水泥污染土壤中驱动微生物诱导碳酸钙沉淀（MICP）的产脲酶细菌的分离与表征

《International Microbiology》：Isolation and characterization of ureolytic bacteria driving microbially induced calcite precipitation in cement contaminated soil

针对水泥污染土壤高碱、高盐的极端环境，研究者分离出6株具强脲酶活性的耐碱菌株（如Bacillus subtilis MHS3），其能有效诱导碳酸钙沉淀（最高达8.04 g L?1）。该研究揭示了本土适应菌株在生物加固、土壤稳定及环境修复中的重要生物技术应用潜力。

　　

当你走在城市街头，很难忽略那些正在拔地而起的新建筑，以及伴随而来的建筑垃圾与废弃物问题。其中，水泥作为最基础的建筑材料之一，其生产、运输及使用过程中的无意泄漏与废弃物堆放，常常导致周边土壤遭受“水泥污染”。这类土壤往往具有极高的pH值（常大于10）、高电解质导电性，并含有潜在有毒金属（如Cr-VI、Ni、Pb等）以及钙、硫酸盐等高离子浓度的化学物质。这种极端的化学环境不仅会破坏土壤结构、降低肥力、抑制植物生长，还会严重损害微生物的多样性，甚至随着雨水径流进一步污染周边水体。

面对这一环境挑战，传统的土壤修复与加固方法往往能耗高、成本高且可能带来二次污染。此时，一种名为“微生物诱导碳酸钙沉淀（Microbially Induced Calcite Precipitation, 简称MICP）”的绿色生物技术逐渐走入人们视野。MICP是利用微生物（尤其是产脲酶细菌，Urease-Producing Bacteria, 简称UPB）代谢过程中产生的脲酶，催化尿素水解生成碳酸根离子，进而与环境中的钙离子结合形成碳酸钙（CaCO₃）沉淀。这些沉淀就像“生物水泥”一样，能将松散的土壤颗粒胶结在一起，提高土体强度与刚度，同时也能将有毒重金属离子包裹固定在内，实现土壤稳定与生态修复的双重目标。

然而，要在高碱、高盐的水泥污染土壤中原位实施MICP技术，最大的瓶颈在于普通微生物难以存活和发挥功效。大多数过往研究使用的产脲酶细菌（如Sporosarcina pasteurii）并非取自这类极端环境，导致其环境适应力不足。于是，一个巧妙的想法应运而生：既然水泥污染土壤本身就是一个极端的生态位，那里是否会“自然选择”出一些天生耐受高pH、高盐且具备强效产脲酶与矿化能力的本土细菌呢？为了回答这个问题，研究人员从埃塞俄比亚亚的斯亚贝巴某水泥污染建筑工地采集了土壤样本，开展了一系列细菌分离、筛选、表征及生物矿化能力评估的研究，相关成果发表在《International Microbiology》期刊上。

为了开展此项研究，作者主要采用了以下关键技术方法：从水泥污染土壤采集样本，利用含尿素的选择性富集培养基及尿素琼脂平板进行产脲酶细菌的分离与纯化；通过形态观察、革兰氏染色、芽胞染色及系列生化试验（如过氧化氢酶、氧化酶、淀粉水解等）进行表型与生理生化表征，并借助ABIS在线鉴定软件进行初步判定；提取基因组DNA，利用通用引ers（E9F和U1510R）进行16S rRNA基因PCR扩增与Sanger测序，通过GenBank BLAST及MEGA软件进行分子鉴定与系统发育分析；采用电导率法测定定量脲酶活性，并在含尿素与氯化钙的胶结培养基中进行为期21天的体外碳酸钙沉淀（CaCO₃）定量 assay；最后，收集沉淀物，利用傅里叶变换红外光谱（FTIR）、扫描电子显微镜（SEM）和X射线衍射（XRD）对碳酸钙晶体进行矿物学、官能团及微观形貌表征。

Isolation of potent urease-producing strains（强效产脲酶菌株的分离）

研究初期，科研人员使用尿素琼脂培养基从水泥污染土壤样品中成功恢复了17株形态各异的细菌分离株。经过初步筛选（如在≥5%尿素浓度下生长能力及36小时内快速产脲酶定性测试），最终选定6株具有潜力的菌株进行深入研究。在这6株菌中，5株为革兰氏阳性、产内生孢子的细菌，1株（编号为CSS4）为革兰氏阴性、不产孢子的细菌。所有菌株均呈杆状，并具有嗜碱（alkaliphilic）、耐盐及中度嗜热的生理特征。初步的ABIS软件分析预示这些菌株分别归属于芽孢杆菌属（Bacillus）、盐单胞菌属（Halomonas）和赖氨酸芽孢杆菌属（Lysinibacillus）。

Quantitative urease activity（定量脲酶活性）

为了精确评估这些菌株的“工作能力”，研究者通过电导率法测定了6株菌在5分钟内的尿素水解速率。结果显示，不同菌株间的脲酶活性存在显著差异。其中，编号为MHS3的分离株表现出最高的脲酶活性，达到7.91 mM 尿素水解·min^?1；而编号为Y的菌株活性最低，为3.93 mM 尿素水解·min^?1。这些数值均在已知产脲酶细菌的活动范围内，且证明了所选菌株具备较强的尿素分解潜力。

In vitro calcium carbonate precipitation（体外碳酸钙沉淀）

在含有尿素和氯化钙的胶结培养基中，所有6株细菌均能诱导产生白色的碳酸钙沉淀，而未接种植物的对照组则无任何沉淀生成。经过21天的发酵培养后，MHS3（后续被鉴定为枯草芽孢杆菌 Bacillus subtilis）产生了最高的碳酸钙干重产量，达到8.04 g L^?1；其次是MHS2（7.58 g L^?1）和MHS4（7.09 g L^?1）；而Halomonas sp. CSS4的产量最低，为4.96 g L^?1。这表明菌株间碳酸钙沉淀效率的不同，可能与其脲酶活性高低、pH耐受性乃至成核效率有关。

Molecular identification（分子鉴定）

通过16S rRNA基因测序及GenBank中的BLAST比对分析，这6株细菌被明确鉴定为：Bacillus sp.（MHS2）、Bacillus subtilis（MHS3）、Bacillus paramycoides（MHS4）、Bacillus pumilus（B2）、Halomonas sp.（CSS4）和 Lysinibacillus boronitolerans（Y），与已知菌株的相似度均在98%到100%之间。它们分属于厚壁菌门（Firmicutes，如Bacillus和Lysinibacillus）和变形菌门（Proteobacteria，如Halomonas）。

Growth potential under alkaline conditions（碱性条件下的生长潜力）

考虑到水泥污染土壤的高碱特性，研究者测试了这些菌株在pH 6至11范围内的生长情况。结果显示，所有菌株不仅能在pH 6–11的范围内生存，甚至在高达45°C的温度和pH 11.0的极端条件下仍能生长（尽管活菌密度相比最适条件下降了83.27%）。其中，Bacillus subtilis MHS3在各pH水平下均表现出最强的生长能力，而Bacillus pumilus B2相对较弱，但它们在pH 11时仍能维持约1.67×10⁶CFU/ml的菌落数。这证实了它们作为嗜碱微生物的强适应能力。

Mineralogical analysis of produced crystal precipitate（产生晶体沉淀的矿物学分析）

为了弄清细菌到底合成了什么样的碳酸钙，研究人员对干燥后的沉淀物进行了FTIR、SEM和XRD分析。FTIR光谱显示，所有沉淀在1420–1470 cm^?1、870–875 cm^?1和710–715 cm^?1处均有吸收带，对应于方解石（calcite）的特征碳酸盐（CO₃^2?）振动；部分菌株（如CSS4、B2和Y）还在1080–1090 cm^?1和745–750 cm^?1处显示出球霰石（vaterite）的特征峰，少数有文石（aragonite）痕迹。SEM图像直观地展示了这一点：MHS2、MHS3和MHS4产生了典型的方解石菱形晶体，而CSS4、B2和Y则形成球霰石特有的球形或不规则团聚体。XRD进一步验证了这些多型态（方解石、球霰石及微量文石）的存在。这种由细菌代谢、脲酶活性及胞外聚合物（EPS）共同影响的生物控制矿化现象，是微生物诱导碳酸钙沉淀的典型特征。

本研究成功从水泥污染土壤中分离并表征了6株具有强效产脲酶和碳酸钙沉淀能力的本土细菌（隶属于Bacillus、Lysinibacillus和Halomonas属）。这些微生物天生具备嗜碱、耐盐、耐中等高温的“硬核”特质，其脲酶活性最高可达7.91 mM 尿素水解·min^?1，碳酸钙产量最高可达8.04 g L^?1，且能产生方解石、球霰石等多种碳酸钙晶型。

在讨论部分，作者指出，这些发现意义重大：首先，它证实了水泥污染这种化学极端环境确实是寻找高效生物矿化微生物的“宝藏之地”；其次，这些本土分离的菌株因预先适应了高pH和高离子强度环境，相比传统实验室模型菌株，在实地应用（如原位生物加固、水泥污染场地修复）中更具成活优势和实用价值；最后，微生物诱导产生的以稳定方解石为主、含部分可转化球霰石的沉淀，不仅能胶结土壤颗粒增强力学强度，还可能通过共沉淀作用固定土壤中的重金属，降低碱度，为可持续的土壤稳定化和环境修复（生物加固和生物修复）提供了极具潜力的微生物资源库。未来，将这些菌株应用于真实的工程场景并评估其污染物固定化效率，将是下一步研究的重点。