P2A与IRES连接子在多顺反子基因表达中的平台依赖性表现：揭示修饰核苷酸对连接子功能的深刻影响及其在优化mRNA疗法设计中的意义

《Genes & Genomics》：Platform-dependent performance of P2A and IRES linkers in multicistronic gene expression

为解决在合成mRNA系统中如何高效共表达多基因的难题，本研究系统比较了P2A肽与四种病毒IRES在质粒DNA和合成mRNA平台上的表现。研究发现，P2A在质粒DNA和m1Ψ修饰的mRNA中总体蛋白表达更优，而完全用m1Ψ替代尿苷会显著削弱所有IRES驱动的表达，甚至低水平（25%）的m1Ψ就足以破坏I型IRES活性。该研究强调了连接子选择在RNA表达系统设计中的重要性，为优化多基因表达策略、开发新一代mRNA疗法（如疫苗）提供了关键见解。

　　

在生物技术与临床应用的广阔天地中，如何让单个细胞像一支训练有素的乐队，和谐、高效地同时演奏多个“基因乐章”，始终是科学家们孜孜以求的目标。无论是细胞重编程需要多个转录因子精准协作，还是帕金森病、癌症等复杂疾病治疗依赖于多靶点协同作用，实现多基因的共表达都是其中的关键一环。为了将多个基因打包进同一个“运载工具”（载体），科研人员常用的“连接子”主要有两大类：一类是能巧妙引导核糖体“跳跃”的2A肽（如P2A），另一类则是能独立招募核糖体起始翻译的内部核糖体进入位点(Internal Ribosome Entry Site, IRES)。然而，当基因治疗的浪潮从传统的DNA平台涌向更具安全性优势的合成mRNA平台时，一个关键问题浮出水面：这些在DNA载体中表现良好的连接子，在含有修饰核苷酸（如广泛应用于降低免疫原性的N1-甲基假尿苷，m¹Ψ）的合成mRNA中，是否还能稳定发挥功效？此前的研究对此莫衷一是，特别是修饰核苷酸如何影响依赖特定RNA空间结构的IRES功能，更是一片亟待探索的空白。

为了回答这些问题，并系统阐明连接子在不同基因表达平台上的性能差异，一项研究在《Genes & Genomics》期刊上揭晓了答案。研究人员开展了一项精心设计的对比研究，旨在揭示P2A与代表性IRES连接子在DNA和mRNA平台，尤其是在存在核苷酸修饰的mRNA环境中的真实表现。

为开展此项研究，作者主要运用了几个关键技术方法：首先是分子克隆技术，构建了包含不同连接子（P2A及四种病毒IRES类型）的双顺反子报告基因质粒载体。其次是体外转录技术，用以合成未经修饰或含有m¹Ψ的合成mRNA。再次是细胞转染技术，将构建好的质粒DNA或合成mRNA转染至A549人肺癌细胞系。最后，通过双荧光素酶报告基因检测技术，以海肾荧光素酶作为报告基因、萤火虫荧光素酶作为内参，定量评估不同连接子介导的基因表达效率。

研究结果

连接子在质粒DNA和mRNA之间的表现存在差异

通过比较包含不同连接子的双荧光素酶报告基因载体，研究发现连接子的性能高度依赖于表达平台。在质粒DNA系统中，P2A和脊髓灰质炎病毒(Poliovirus, PV)来源的I型IRES能产生最高且相当的蛋白表达水平。然而，在合成mRNA平台上，情况发生了变化。在未修饰的mRNA中，I型IRES驱动的下游基因表达甚至与P2A相当。但当mRNA中的尿苷被完全替换为m¹Ψ时，所有IRES驱动的蛋白表达均受到显著削弱，而P2A构建体的蛋白产量则表现出约两倍的增加。

m¹Ψ对P2A和IRES介导的翻译产生不同影响

为了探究基因相对于连接子的位置是否影响表达，研究人员构建了报告基因位于连接子上游或下游的不同载体。结果发现，在质粒DNA和m¹Ψ修饰的mRNA中，P2A在上游基因表达方面始终优于所有IRES。在未修饰mRNA中，不同连接子上游基因的表达水平则相近。对于下游基因（依赖连接子介导翻译），在未修饰mRNA中，P2A与I型IRES表现相当，但在m¹Ψ修饰的mRNA中，P2A的下游基因表达大幅提升（约七倍），而所有IRES的下游基因表达则变得微乎其微。

低水平m¹Ψ掺入即损害IRES介导的翻译

通过调整体外转录中m¹Ψ与尿苷的摩尔比，研究人员进一步探索了修饰水平的影响。对于P2A构建体，无论是上游还是下游基因，其表达效率都随着m¹Ψ掺入比例的增加而逐步提升。与之形成鲜明对比的是，对于I型IRES，下游基因的表达在掺入比例低至25%时即出现显著下降，而上游基因的表达则在不同掺入比例下保持稳定。这表明IRES功能对m¹Ψ修饰极为敏感，少量修饰就足以破坏其介导翻译起始的能力。

研究结论与讨论

本研究系统揭示，多顺反子基因表达的最佳连接子策略并非通用，而是强烈依赖于表达平台和RNA修饰环境。P2A在质粒DNA和m¹Ψ修饰的mRNA系统中普遍能提供更优的整体蛋白表达。而IRES，尽管在未修饰mRNA中能与P2A表现相当，其功能却会被m¹Ψ修饰严重破坏，这种破坏具有剂量依赖性且在低水平修饰时即可发生。

研究的意义重大而深远。首先，它直接回答了领域内关于连接子在mRNA平台，特别是含修饰核苷酸的mRNA中性能不确定性的问题。其次，它深刻揭示了核苷酸修饰能够从根本上改变连接子的性能，这主要是由于m¹Ψ可能改变了RNA的二级结构，进而影响了严重依赖特定空间构象的IRES功能，也可能干扰了IRES与其反式作用因子的蛋白质-RNA相互作用。这些发现为理性设计基于mRNA的多基因表达系统提供了关键指导：在开发使用m¹Ψ等修饰核苷酸的mRNA疗法（如疫苗）时，P2A可能是更可靠的选择；而在某些特定场景（如使用未修饰mRNA的环状RNA平台或低免疫应答环境），IRES仍可能具有应用价值。最后，该研究强调了连接子选择与RNA修饰的联合效应共同塑造翻译结果，这将推动针对特定细胞类型和递送平台优化连接子元件的系统筛选，加速下一代mRNA治疗平台的开发，以满足基因治疗、细胞重编程等领域对协调多基因表达的迫切临床需求。