受生物启发的分支型金铜纳米合金，用于实现具有协同作用的类过氧化物酶双通路活性

《RSC Advances》：Bio-inspired branched Au–Cu nanoalloys for achieving synergistic dual-pathway peroxidase-like activity

　　在这项研究中，我们报道了一种简单且环保的一锅法共还原策略，用于在水相条件下合成双金属Au–Cu分支纳米结构。姜黄素被同时用作还原剂和稳定剂，从而无需额外的化学试剂。所得到的Au–Cu纳米合金呈现出独特的分支纳米管形态，并展示了优异的过氧化酶类催化活性。通过氧化3,3′,5,5′-四甲基苯胺（TMB）来评估其催化性能，最初无色的底物被转化为了蓝色的氧化产物。该系统对H2O2的检测限为8 μM。此外，通过改变底物（H2O2和TMB）的浓度，确定了稳态动力学参数，包括米氏常数（Km）和最大反应速率（Vmax）。TMB的低Km值表明Au–Cu纳米合金对底物具有很强的亲和力。与姜黄素稳定的金纳米颗粒进行比较分析后发现，铜的加入显著提高了纳米结构的催化效率。利用循环伏安法和电化学阻抗谱进一步验证了催化过程中的电子转移机制。总体而言，这项工作为H2O2的灵敏检测提供了一个高效的多模式传感平台。

引言

金（Au）和铜（Cu）纳米颗粒以其出色的等离子体和催化特性而闻名。金纳米颗粒具有依赖于尺寸和形状的可调光学特性，使它们在医学、传感和光电子学应用中具有高度的多样性。此外，它们化学稳定且生物相容的表面便于进行化学修饰和生物偶联。铜纳米颗粒在可见光和近红外区域也显示出强烈的等离子体吸收，这使它们在光子学、传感和成像应用中具有吸引力。然而，尽管作为异质催化剂非常有效，但由于铜纳米颗粒对氧化的高度敏感性，其实际应用受到了显著限制，这会导致它们的等离子体和催化性能下降。通过将铜与更稳定的贵金属（如Au或Ag）合金化，可以有效地解决这些限制，形成与单一金属对应物相比具有更高稳定性和优越催化活性的双金属纳米结构。纳米合金通常具有高表面能和丰富的活性位点，这些特性归因于它们的减小尺寸、晶格应变和众多的结构缺陷。酶作为天然催化剂，在食品加工、制药和农化等多个领域展现出显著的特异性并发挥着关键作用。然而，它们的广泛应用常常受到操作稳定性低、对环境条件敏感以及生产和纯化成本高的限制。为了解决这些挑战，已经开发了人工酶模拟物作为天然酶的坚固、经济且高度稳定的替代品。据报道，包括金属纳米颗粒、金属氧化物和基于碳的纳米结构在内的各种纳米材料表现出内在的酶样活性。这些纳米材料通常展现出与天然酶相当的催化动力学，因此被称为纳米酶。在不同的纳米酶类型中，氧化酶类、过氧化酶类、过氧化氢酶类和超氧化物歧化酶类系统由于在生物医学应用中的关键作用而得到了最广泛的研究，特别是在调节活性氧（ROS）方面。简而言之，氧化酶模拟物通过利用分子氧作为电子受体来催化底物的氧化，从而将其还原为水或过氧化氢。超氧化物歧化酶（SOD）类纳米酶有助于将超氧化物自由基（O2?˙）歧化为过氧化氢和氧气。过氧化氢酶类纳米酶将过氧化氢分解为水和氧气，从而减轻氧化应激。相比之下，过氧化酶类纳米酶在过氧化氢存在下催化底物的氧化，其中底物作为电子供体。过氧化酶是一类能够在过氧化氢存在下催化广泛底物氧化的天然酶，广泛应用于食品工业、生物传感和制药等领域。一个著名的代表是辣根过氧化物酶（HRP），这是一种含有铁原卟啉的酶，以其高催化效率而著称。然而，HRP的实际应用往往受到其对恶劣环境条件的敏感性以及制备和纯化成本高的限制。

为了解决这些限制，人们投入了大量研究努力来开发稳定、经济、可重复使用且易于合成的过氧化酶模拟纳米材料。在各种候选材料中，金纳米颗粒（AuNPs）由于易于合成、可调的光电特性和由高表面积与体积比带来的优异催化活性而在生物医学领域受到了显著关注。在这种背景下，由两种或更多金属元素组成的纳米合金因其可调的结构、组成和物理化学特性而成为有前景的酶替代品。这些材料通常显示出比单一金属对应物更好的催化性能，这主要归因于组成元素之间的协同作用。基于金的纳米合金的另一个优势在于其成本效益，通过部分用成本较低的过渡金属或稀土金属替代金，同时保持甚至提高催化效率。这样的纳米合金的催化行为受到其组成和结构的强烈影响。例如，Au–Fe纳米合金通过结合金的等离子体特性和铁的磁性质而表现出双重功能特性。同样，Au–Ag双金属纳米合金在酸性条件下显示出可调的过氧化酶样活性，这种活性可以通过改变合金组成和溶液pH值来调节。在目前的工作中，我们报道了一种使用姜黄素作为还原剂和稳定剂在水相中简单合成Au–Cu纳米合金的方法。在合成过程中的方法改进导致了分支Au–Cu纳米结构的形成。使用SEM-EDX、HRTEM、STEM-EDS、UV-vis光谱、FT-IR光谱和电化学技术对合成材料进行了全面表征。Au–Cu纳米合金展示了优异的过氧化酶类催化活性，这一点通过其在H2O2存在下催化氧化3,3′,5,5′-四甲基苯胺（TMB）得到了证明。此外，选择性研究显示，即使在各种干扰离子存在的情况下，这些纳米合金也具有高选择性，能够进行H2O2的比色检测。通过详细的电化学研究进一步阐明了传感机制。此外，Au–Cu纳米合金的催化性能与之前报道的姜黄素稳定的金纳米颗粒进行了系统比较，证实了双金属系统的效率得到了提升。

材料与方法

材料

三水合氯化金(III)（HAuCl4·3H2O）、硫酸铜(II)（CuSO4）、过氧化氢（H2O2）和二甲基亚砜（DMSO）从印度Merck Chemicals购买。姜黄素通过标准的溶剂萃取程序从姜黄粉中提取。不同pH值的缓冲胶囊从Alfa Aesar获得。3,3′,5,5′-四甲基苯胺（TMB）也从Alfa Aesar购买。所有水溶液都使用蒸馏水制备。使用碳酸钠（Na2CO3）和盐酸（HCl）调节溶液的pH值，并使用pH试纸（范围1–12）监测pH。

Cu–Au纳米合金的合成

在典型的合成过程中，将2.5 mL的2 mM HAuCl4·3H2O溶液和2.5 mL的2 mM CuSO4溶液混合在一个圆底烧瓶中，在80 °C下加热并不断搅拌5分钟。在另一个步骤中，将0.0046 g的姜黄素溶解在20 mL的蒸馏水中，并使用Na2CO3将溶液的pH值调节至9。然后将制备好的姜黄素溶液逐滴加入到金属前驱体混合物中并持续搅拌。反应在80 °C下进行10–15分钟，期间观察到从黄色到浅棕色的明显颜色变化，表明Au–Cu纳米合金的形成。通过离心收集产物，并用蒸馏水清洗三次以去除任何未反应的物种。随后将纯化的沉淀物重新分散在25 mL的蒸馏水中并超声处理10分钟，以获得均匀的棕色Au–Cu纳米合金胶体溶液。该合成协议具有很高的重复性，所得纳米合金在7 °C下保存时表现出优异的稳定性，可稳定长达1年（图S1，SI中提供了1年后的TEM图像）。

AuNPs的过氧化酶模拟活性的检测

使用3,3′,5,5′-四甲基苯胺（TMB）作为显色底物，评估了合成的Au–Cu纳米合金的过氧化酶类催化活性。对于该测定，首先将0.0010 g的TMB溶解在1 mL的二甲基亚砜（DMSO）中，然后用9 mL的柠檬酸缓冲液（pH 5）稀释。典型的反应混合物包括500 μL的Au–Cu纳米合金分散液、500 μL的TMB溶液、200 μL的缓冲液和500 μL的过氧化氢（H2O2）。使用UV-可见光谱监测反应。加入H2O2后，观察到从无色到蓝色的明显颜色变化，表明TMB被氧化为其氧化形式（TMB+）。为了优化催化性能，系统地研究了关键反应参数，如pH和底物浓度。

Au–Cu纳米合金的表征

使用双光束Thermo Scientific分光光度计记录了UV-可见吸收光谱。使用Shimadzu FTIR光谱仪通过傅里叶变换红外（FTIR）光谱分析了合成Au–Cu纳米合金的表面功能化和键合相互作用。使用高分辨率透射电子显微镜（HRTEM，JEOL JEM-2100）和LaB6电子枪检查了纳米合金的形态和结构特征，其分辨率为0.23 nm。通过扫描透射电子显微镜结合能量色散X射线光谱（STEM-EDS）确认了合金的形成。进一步使用扫描电子显微镜（SEM）结合能量色散X射线光谱（SEM-EDX，JEOL 6390LA/Oxford XMX N）研究了表面形态和元素组成，操作加速电压范围为0.5–30 kV，最大放大倍率达到3000000倍。使用Biologic电化学工作站进行了电化学表征，采用玻璃碳电极作为工作电极，Ag/AgCl作为参比电极，铂丝作为对电极。还进行了电化学阻抗谱（EIS）以评估Au–Cu纳米合金的电子转移特性。

酶类催化行为的分析

使用米氏-门滕动力学模型研究了合成Au–Cu纳米颗粒的酶类催化行为。进行时间依赖的吸光度测量以监测反应进程，并采用初始速率方法来评估底物浓度对催化活性的影响。在这项研究中，使用过氧化氢（H2O2）和3,3′,5,5′-四甲基苯胺（TMB）作为底物。通过绘制初始反应速率（V）与底物浓度的函数来确定动力学参数，即米氏常数（Km）和最大反应速率（Vmax）。进一步使用Lineweaver–Burk双重倒数图进行分析，通过绘制1/V与1/[S]的关系来更准确地估计动力学参数。在不存在H2O2的情况下使用相同的过氧化酶类测定进行了干扰研究，以评估Au–Cu纳米合金系统在潜在干扰物种存在下的选择性。在相同的实验条件下单独测试了常见的生物分子，包括葡萄糖、水杨酸、抗坏血酸、胆固醇和尿素（每种浓度为1 mM），并记录了相应的比色响应，以评估潜在的干扰效应，确认了纳米合金系统对H2O2检测的选择性。对于真实样品分析，将开发的基于Au–Cu纳米合金的传感系统应用于检测牛奶样品中的H2O2，证明了其在复杂生物基质中的实际应用性。

结果与讨论

金-铜纳米合金（Au–Cu NAs）通过一种简单、环保的一锅法共还原策略在水相介质中合成，无需使用苛刻的化学物质。姜黄素在合成过程中同时起到了还原剂和稳定剂的作用，从而简化了反应系统并增强了其环保性。Au–Cu NAs是使用金和铜前驱体以1:1摩尔比制备的。共还原被认为是纳米合金合成的有效方法，因为它涉及用共同的还原剂同时还原两种具有相似还原电位的金属离子。反应在碱性条件下进行，期间溶液颜色逐渐从浅黄色变为深棕色，表明Au–Cu纳米合金的成功形成。如图1所示，Au–Cu纳米合金（NAs）的UV-可见吸收光谱表现出明显的表面等离子体共振（SPR）带。在我们之前的研究中，姜黄素稳定的金纳米颗粒（Cur-GNPs）在520纳米处显示出特征性的表面等离子体共振（SPR）峰，而Au–Cu纳米颗粒（Au–Cu NAs）则显示出大约在550纳米处的红移SPR峰，表明颗粒尺寸增加和/或形态发生变化。图1的插图显示了合成的Au–Cu NAs的颜色。与Spataro等人报告的观察结果不同，他们在合金形成过程中观察到SPR带的减弱，在本研究中没有发现这种减弱现象。SPR带的红移可以归因于纳米颗粒的形态演变，这表明从球形结构向分支或纳米管状结构的转变。此外，包括基于Mie理论的研究已经证明，Au–Cu合金中铜含量的增加也会导致SPR带的红移，这与当前的研究结果一致。

姜黄素、金纳米颗粒（GNPs）和Au–Cu纳米颗粒（Au–Cu NAs）的紫外-可见光谱（UV-vis spectra）。插图显示了Au–Cu NAs的颜色。傅里叶变换红外光谱（FTIR）证实了姜黄素在Au–Cu纳米合金表面的成功功能化。在Au–Cu NAs的FTIR光谱中（图2），观察到1615厘米?1和2347厘米?1处的特征吸收带，分别对应于姜黄素酮醇形式的CO伸缩振动和对称的CH?弯曲振动。中心位于3298厘米?1的宽带归因于O–H伸缩振动。这些光谱特征清楚地表明了纳米合金表面存在姜黄素基团，证实了其在合成过程中作为还原剂和稳定剂的双重作用。此外，还观察到特征带向低波数方向的轻微移动，这可以归因于姜黄素官能团与Au–Cu纳米合金表面之间的相互作用。这一移动进一步证明了成功的表面修饰和姜黄素与双金属系统的配位。

傅里叶变换红外光谱（FTIR）分析还显示，合成的Au–Cu纳米颗粒具有大约17纳米的平均流体动力学直径和-27.9毫伏的ζ电位。相对较高的负ζ电位表明了优异的胶体稳定性，这可以归因于纳米颗粒之间的强静电排斥。高分辨率透射电子显微镜（HRTEM，图3a）图像显示，Au–Cu纳米颗粒主要呈现管状形态，具有明确定义和均匀的结构特征。平均核心颗粒尺寸估计约为7纳米，由于溶剂化层和表面结合的姜黄素分子的贡献，这一尺寸小于通过动态光散射（DLS）测量得到的流体动力学直径。

不同放大倍数的Au–Cu NAs的透射电子显微镜（TEM）图像。直方图显示了颗粒大小分布。扫描电子衍射（SAED）图案。基于STEM-EDS的元素映射：（i）HAADF图像，（ii）Au图，（iii）Cu图，（iv）Au和Cu的联合图。图3b显示了大小分布的直方图。HRTEM分析揭示了Au–Cu纳米颗粒表面存在0.19纳米到0.21纳米的纳米条纹。0.21纳米的晶格条纹间距对应于Au–Cu的（111）FCC面的d间距。选定的区域电子衍射（SAED）图案显示了Au–Cu NAs的晶体性质。通过STEM和EDX映射研究了纳米合金的组成，结果显示Au和Cu在分支结构中均匀分布。使用HAADF-STEM-EDS研究了Au–Cu NAs的化学性质，平均组成为80%的Au和20%的Cu。

通过使用过氧化氢（H?O?）和3,3′,5,5′-四甲基联苯胺（TMB）作为模型底物，评估了Au–Cu纳米颗粒的催化效率。通过监测TMB在乙酸盐缓冲液中氧化为其氧化形式（TMB+）来光谱学地监测H?O?的氧化。TMB是过氧化物酶测定中广泛使用的显色底物；它在还原状态下是无色的，而其氧化形式会产生蓝色的二胺电荷转移复合物。在不同pH条件下系统地研究了纳米颗粒的催化活性，最高活性出现在pH 3.5（补充信息，图S4a）。因此，选择这个pH作为后续催化研究的最佳条件。通过紫外-可见光谱进一步确认了Au–Cu纳米颗粒在酸性条件下的稳定性，没有观察到聚集或峰值偏移，表明了其优异的结构稳定性。还原型TMB在285纳米处显示出吸收最大值，而氧化型TMB（TMB+）在370、450和652纳米处显示出特征吸收峰。在这些波长处吸收的逐渐增加对应于由活性·OH物种的催化生成所驱动的TMB+的形成。吸收最初随时间线性增加，随后速率逐渐下降直至达到平台期，表明TMB氧化完成。在本研究中，通过监测652纳米处的吸光度来定量跟踪TMB+的形成。使用Thermo Scientific紫外-可见分光光度计在时间扫描模式下记录了反应动力学。在没有Au–Cu纳米颗粒的情况下，即使有H?O?存在，也没有观察到TMB的氧化，这证实了反应不会自发进行，需要催化剂，类似于辣根过氧化物酶（HRP）的行为。为了进一步验证纳米颗粒的催化作用，在相同的条件下使用单独的姜黄素（没有纳米颗粒）与TMB和H?O?进行了对照实验。没有观察到可观察到的颜色变化，表明姜黄素本身不参与催化过程，活性完全来自Au–Cu纳米颗粒。图5a展示了在有无H?O?的情况下纳米颗粒引起的明显颜色变化，而图5b显示了在不同H?O?浓度（从10到500 μM）下的相应比色响应。根据吸光度与H?O?浓度的校准图（图S5），确定所提出方法的检测限为8 μM。

(a) 在有和没有H?O?的情况下，Au–Cu纳米颗粒的催化性能观察到的颜色变化。(b) 不同H?O?浓度的颜色变化。为了评估Au–Cu纳米颗粒的催化性能，通过改变H?O?或TMB的浓度来进行动力学研究，同时保持纳米颗粒浓度恒定，遵循初始速率方法。监测652纳米处吸光度的时间依赖性变化来评估类过氧化物酶的催化活性。催化过程可以用典型的酶促反应机制来描述：
E + S ? ES → P + E
(1)

其中E代表酶模拟物（Au–Cu纳米颗粒），S表示底物（TMB或H?O?），P是产物。系统的动力学行为遵循Michaelis–Menten模型：
(2)

其中V是反应速率，Vmax是最大反应速度，[S]是底物浓度，Km是Michaelis–Menten常数。为了确定基于Au–Cu纳米颗粒的过氧化物酶模拟物的动力学参数，使用实验获得的初始速率应用了Michaelis–Menten模型。过氧化物酶测定使用含有500 μL Au–Cu纳米颗粒分散液、500 μL 1 mM TMB、200 μL乙酸盐缓冲液和500 μL H?O?的反应混合物进行。使用紫外-可见分光光度计记录吸光度的变化。通过独立改变H?O?和TMB的浓度来进行稳态动力学分析。对于H?O?依赖的动力学，H?O?的浓度从0.5%变化到4%，同时保持TMB浓度在1 mM。对于TMB依赖的动力学，TMB的浓度从0.1变化到0.5 mM，同时保持H?O?浓度在0.3%。所有实验的总反应体积固定在2 mL。使用比尔-朗伯定律（Beer–Lambert law）根据时间扫描吸光度数据确定了随时间形成的氧化TMB（TMB+）的浓度。从浓度-时间曲线的斜率计算了反应速度（V）。反应速度与底物浓度的图产生了典型的Michaelis–Menten曲线，而双倒数图（1/V与1/[S]）产生了用于确定动力学参数的Lineweaver–Burk图。

从Lineweaver–Burk图的斜率和截距提取了动力学参数Vmax和Km。基于实验观察，为Au–Cu纳米颗粒系统提出了一个协同催化机制。催化过程始于H?O?分子在纳米颗粒表面的吸附，随后激活并分解为活性氧物种（·OH自由基），这些自由基随后将TMB氧化为TMB+。在天然过氧化物酶中，催化途径通常遵循乒乓球机制，其中两个氧化还原底物依次结合，第一个产物在第二个底物结合之前释放。相比之下，纳米酶系统可能根据其组成遵循不同的催化途径。基于过渡金属的纳米酶（例如Fe-、Co-和Cu-基系统）通常通过来自与底物的氧化还原相互作用的价态变化来运作，常常类似于Fenton型机制。另一方面，基于贵金属的纳米材料表现出主要由表面等离子体共振（SPR）诱导的电子转移所控制的催化活性。在目前的Au–Cu纳米颗粒系统中，增强的催化性能可以归因于Cu介导的氧化还原活性和Au诱导的等离子体电子转移之间的协同作用，从而提高了活性物种的生成和底物的有效氧化。对于基于过渡金属的纳米酶，表面金属离子可以直接催化H?O?分解为羟基自由基（·OH），这些自由基随后氧化显色底物。相比之下，基于贵金属的纳米酶通常通过H?O?在表面的吸附来表现出过氧化物酶样的活性，随后通过O–O键断裂生成·OH自由基，这些自由基将TMB氧化为其有色产物。在目前的Au–Cu纳米颗粒系统中，Cu位点在促进·OH生成方面起着关键作用，通过Fenton类似机制。所提出的催化途径在图6中示意（自由基清除测定结果见补充信息，图S6）。Cu的存在增强了氧化还原循环，促进了H?O?有效分解为活性氧物种。

Au–Cu纳米颗粒的催化性能示意图。所有实验都在日光条件下进行。由于Au–Cu纳米颗粒的表面等离子体共振（SPR）带中心大约在550纳米，自然光照射可以诱导等离子体激发。在SPR激发下，纳米颗粒表面生成热电子和空穴。由于能量的良好对齐，这些激发的电子转移到吸附的H?O?的分子轨道上，促进其激活为活性过渡状态。这一过程导致H?O?分解为羟基自由基（·OH）和氢氧根离子（OH?）。在酸性条件下，生成的OH?离子容易与H+反应形成水，这抑制了电子-空穴的快速重组。这种抑制增强了电荷分离效率，促进了持续的·OH自由基生成，最终加速了整体催化反应速率。总体而言，Au–Cu纳米颗粒增强的过氧化物酶样活性可以归因于Cu介导的Fenton类似氧化还原过程和Au驱动的SPR诱导的电子转移之间的协同作用，从而有效生成了活性氧物种并提高了催化性能。在这项研究中，我们将我们小组之前报道的姜黄素稳定的金纳米颗粒（Cur-GNP）的催化性能与Au–Cu纳米颗粒的催化性能进行了比较。基于计算出的Michaelis–Menten常数（Km）和最大反应速度（Vmax），Au–Cu纳米颗粒表现出比Cur-GNP更优越的催化活性。这种增强的性能可以归因于合金结构中过渡金属（Cu介导）和贵金属（Au介导）催化途径的协同双重机制贡献。图6示意了Au–Cu纳米颗粒的催化机制。Cu掺入Au晶格中诱导了电子捐赠和压缩晶格应变，导致Au 5d带的窄化和d带中心向费米能级的上移。这种电子调制增强了吸附物-金属轨道的重叠，加强了底物结合，并降低了氧化还原反应的活化能，从而提高了催化效率。此外，增加的表面积、Au–Cu界面组合的形成以及由晶格应变引起的强烈局部电子扰动——特别是在高曲率区域——共同促进了H2O2吸附的改善、O–O键断裂的加速以及电子转移动力的增强。值得注意的是，分支状的纳米粒子表现出更高的周转频率，这表明观察到的催化增强主要源于内在的几何和电子效应，而不仅仅是粒子大小本身。图7a显示了吸光度与时间的关系图，图7b对应于Michaelis–Menten图，图7c对应于Lineweaver–Burk图，以H2O2作为底物，即保持TMB浓度不变，而H2O2的浓度从0.5%变化到4%，Vmax = 27.8 × 10?8 M s?1，Km值被确定为21.3 × 10?3 M。

使用不同浓度的H2O2作为底物的Au–Cu催化剂的动力学图：(a) 吸光度与浓度关系，(b) Michaelis–Menten图和(c) Lineweaver–Burk图。图8a展示了催化反应的吸光度-时间图。图8b显示了相应的Michaelis–Menten图，而图8c展示了以TMB作为底物的Lineweaver–Burk图。使用H2O2作为底物和Au–Cu纳米合金作为过氧化物酶模拟物，通过Lineweaver–Burk分析确定了动力学参数。最大反应速率(Vmax)计算为27 × 10?8 M s?1，Michaelis常数(Km)确定为0.0429 × 10?3 M。

使用不同浓度的TMB作为底物的Au–Cu纳米合金催化剂的动力学图：(a) 吸光度与浓度关系，(b) Michaelis–Menten图和(c) Lineweaver–Burk图。较低的Km值表明催化剂对其底物的亲和力更强。根据获得的动力学参数，Au–Cu纳米合金对TMB的Km值低于GNPs，这表明Au–Cu纳米合金对TMB的结合亲和力更强，并且显示出更高的氧化催化效率。Au–Cu纳米合金对H2O2的Km值低于GNPs，表明与Cur-GNP相比，它对H2O2的亲和力相对较好，这表明Au–Cu纳米合金能有效地激活TMB。表1提供了各种纳米结构催化活性的比较总结，突出了Au–Cu纳米合金相对于其他报道的纳米酶的性能（各种基于金的纳米酶的检测限比较在SI表S1中给出）。

不同纳米材料的Michaelis–Menten常数和Vmax的比较

模拟材料
底物
Km (10?3) M
Vm (10?8) M s?1

HRP34
TMB
0.433
10

H2O2
3.72
8.7

AuNPs/Cit-GNs40
TMB
0.0591
14.93

H2O2
25.08
21.46

Fe3O4 (参考文献36)
TMB
0.233
0.176

H2O2
479
0.275

Co3O4 (参考文献36)
TMB
0.103
0.256

H2O2
173
0.189

Biogenic GNP41
TMB
0.69

H2O2
0.79

Curcumin稳定化的GNP29
TMB
0.9
1.98

H2O2
4500
7.6

我们工作中的Au–Cu
TMB
0.0429
27

H2O2
21.20
27.8

干涉和真实样品分析

进行了干涉研究以评估所开发检测方法的选择性。在没有H2O2的情况下，测试了含有1 mM浓度常见潜在干扰物（包括葡萄糖、水杨酸、尿素、胆固醇和抗坏血酸）的检测系统。检查了这些物质对比色响应的影响，没有检测到明显的颜色变化，证实了Au–Cu NAs对H2O2的高度选择性（图9）。H2O2的检测限(LOD)被确定为8 μM，吸光度与波长的关系图见SI图S6。

在存在干扰物质（葡萄糖、水杨酸、尿素、抗坏血酸和胆固醇）的情况下进行选择性研究。为了进一步评估基于纳米酶的检测方法的实际应用性，使用了当地品牌获得的市售生牛奶进行了真实样品分析。牛奶样品中加入了已知浓度的H2O2，并通过分光光度法测量了H2O2的含量。计算出的回收率约为96%，证明了所提出的检测平台的准确性和可靠性（SI图S7）。

为了阐明电子转移机制，使用聚偏二氟乙烯(PVDF)作为粘合剂，将Au–Cu NAs功能化到玻璃碳电极(GCE)上，用于H2O2的传感。在酸性醋酸盐缓冲液中，在惰性条件下进行了循环伏安法(CV)测量，电位从+1.2 V扫描到?0.6 V（相对于calomel电极）。图10显示了Au–Cu纳米合金修饰的GCE的循环伏安图。在大约?0.2 V处出现一个明显的氧化还原峰，对应于Cu2+/Cu+的氧化还原对（裸GCE、Au–Cu和Cur-GNP的对比CV响应见SI图S8a）。记录了扫描速率的变化，我们观察到随着扫描速率的增加，电流有系统性的增加（图S8b）。

Au–Cu修饰GCE的循环伏安响应。为了研究对H2O2的电化学响应，在不同浓度的H2O2下记录了CV（SI，图S9）。在?0.3 V附近观察到还原电流明显增加，表明纳米合金表面催化了H2O2的还原。使用线性扫描伏安法(LSV)在10–80 μM的浓度范围内构建了校准曲线（SI，图S10）。随着H2O2浓度的增加，还原电流呈线性增加，证实了系统的灵敏度。

电化学过程可以由以下反应描述：

2Cu2+ + 2e? → 2Cu+
(4)

2Cu+ + H2O2 → 2Cu2+ + H2O + ˙OH
(5)

在阴极扫描过程中，电极表面的Cu2+被还原为Cu+。生成的Cu+随后与H2O2反应，产生羟基自由基(˙OH)，同时被氧化回Cu2+。因此，随着H2O2浓度的增加，Cu2+/Cu+的再生变得更加明显，导致还原电流增强。为了进一步了解纳米合金的电子转移特性，进行了电化学阻抗谱(EIS)研究。图11显示了在含有1 mM potassium ferricyanide/potassium ferrocyanide的溶液中，加入NaCl作为支持电解质的裸GCE、GNP修饰的GCE和Au–Cu纳米合金修饰的GCE的Nyquist图。测量的电荷转移电阻(Rct)值为：裸GCE：18?821 Ω cm2，GNP修饰的GCE：3891 Ω cm2，Au–Cu纳米合金修饰的GCE：2887 Ω cm2。Au–Cu纳米合金电极观察到的显著较低的Rct值表明其电子转移动力学更快，这证实了Au–Cu纳米合金的优异催化效率和增强的电化学活性。这些证据证实了催化途径的双重机制。在我们之前的工作中，Cur-GNP的催化活性主要归因于等离子体诱导的电子转移，而在本研究中，铜的引入引入了额外的氧化还原途径，从而提高了催化效率。

在本研究中，我们展示了在水溶液中通过简单的一锅法成功地合成了分支状的Au–Cu纳米合金，使用姜黄素作为稳定剂和还原剂。所得纳米合金在比色和电化学方法上都表现出出色的过氧化氢(H2O2)检测催化活性。所提出的机制表明了一种协同的电子转移途径，涉及等离子体激发的热载流子和表面氧化还原循环，共同促进了催化性能的增强。动力学分析证实了Michaelis–Menten行为，具有有利的Km和Vmax值，反映了Au–Cu纳米合金对TMB的强催化亲和力——在某些方面超过了天然辣根过氧化物酶(HRP)的性能。选择性研究和真实样品分析显示，来自常见生物分子的干扰可以忽略不计。此外，所开发的方法实现了8 μM的低检测限，并在应用于生牛奶样品时表现出出色的回收率（约96%）。总体而言，这些发现突显了Au–Cu纳米合金作为高效H2O2多模态检测纳米酶平台的潜力，提供了高灵敏度、选择性和实际应用性。

作者贡献

S. P. 参与了写作、概念化、验证和资源准备工作。S. S. 完成了所有实验室工作。P. A. 和 R. M. 协助了电化学分析和解释。

利益冲突

没有需要声明的利益冲突。

数据可用性

支持本文的数据已包含在补充信息(SI)中。补充信息包括pH的影响、吸光度与浓度图、真实样品分析和扫描速率变化图。详见DOI: https://doi.org/10.1039/d6ra00153j。

致谢

作者感谢NSS学院、Nemmara和SVNSS提供了进行工作的基本设施。作者还感谢STIC-CUSAT提供了表征设施。