利用环糊精包合作用区分β-磷酸化氮氧自由基非对映异构体的电子顺磁共振与循环伏安法研究

《RSC Advances》：Differentiation of β-phosphorylated nitroxide diastereoisomers by complexation with cyclodextrins: an EPR and cyclic voltammetry study

　　

研究人员采用电子顺磁共振（EPR）光谱与循环伏安法，探究了β-磷酸化环状氮氧自由基——2,5-二甲基-5-羟亚甲基-2-二乙氧基磷酰吡咯烷-N-氧基的两个非对映异构体与β-环糊精（β-CD）及γ-环糊精（γ-CD）的包合作用。两种异构体的EPR谱图特征存在差异，源于其磷与氮超精细分裂常数的不同：顺式立体异构体（1c˙）可形成分子内氢键，涉及亚甲基连接的羟基与磷基团上的氧原子，而反式立体异构体（1t˙）无法形成此类分子内氢键。EPR谱图显示1t˙对γ-CD的亲和力更高，自由态与包合态自由基的EPR参数差异显著。基于EPR与循环伏安数据计算的结合常数表明，γ-CD的亲和力高于β-CD，该趋势在1t˙体系中尤为突出。热力学参数显示，氯化钾浓度的升高可通过调控溶剂化与静电相互作用，线性增强包合物的稳定性。电化学测量结果证实包合后扩散系数降低、阳极峰电位发生偏移，与光谱结果一致。上述发现凸显了分子立体化学与离子强度在调控环糊精与氮氧自由基主客体相互作用中的关键作用。

研究背景与意义

稳定自由基的主客体化学已通过电子顺磁共振（EPR）光谱研究了数十年，多数工作聚焦于氮氧自由基与环糊精（CDs）的包合作用，针对β-磷酸化氮氧自由基的研究仍十分有限。与传统氮氧自由基相比，β-磷酸化氮氧自由基的氮、磷超精细分裂常数变化更为显著，既受空腔疏水微环境影响，也与包合导致的自由基构象改变有关。此前研究虽已证明β-磷酸化氮氧自由基作为自旋探针能提供比经典氮氧自由基更丰富的主客体作用信息，但环状β-磷酸化氮氧自由基的非对映异构效应、环糊精空腔尺寸及离子强度对该类包合过程的影响尚未得到系统阐明。本研究以两种β-磷酸化环状氮氧自由基非对映异构体为模型，结合EPR与循环伏安法，明确立体化学、空腔尺寸与离子强度的调控规律，相关成果发表于《RSC Advances》。

关键技术方法

研究采用密度泛函理论（DFT）优化两种异构体几何结构，选用B3LYP泛函与6-311++G(d,p)基组，通过SMD隐式溶剂化模型模拟水溶液环境；EPR光谱测试使用X波段JEOL FA100谱仪，通过WinSim与EasySpin软件拟合各浓度环糊精下的自由基比例与超精细参数；循环伏安实验在0.5 M氯化钾水溶液中开展，采用三电极体系，基于不可逆Randles-Sevcik方程计算扩散系数，通过电化学电流法求解包合常数。所有样品均基于前期已报道合成的β-磷酸化氮氧自由基1c˙与1t˙，环糊精购自商业供应商直接使用。

研究结果

Introduction

研究明确了β-磷酸化氮氧自由基的EPR参数对微环境与构象的双重敏感性，指出羟基取代带来的分子内氢键特性，使其可作为新型功能化自旋探针应用于生物成像领域，同时强调立体化学与离子强度因素在包合过程中的潜在影响。

Materials and methods

详细说明了DFT计算的参数设置、EPR谱仪的测试条件、样品配制流程以及循环伏安实验的电极体系与测试方法，确保实验结果的可重复性。

Results and discussion

DFT计算证实1c˙中羟基与磷酰基形成强分子内氢键，O?H距离为1.85 ?，而1t˙中该距离达3.11 ?，无有效分子内氢键。EPR参数显示，1t˙的磷超精细分裂常数（a_P）在水相中比1c˙高约3 G，包合进入γ-CD后，1t˙的a_P增幅达6 G，显著高于1c˙的2 G，对应二面角θ的变化幅度分别为15%与8%，证明无分子内氢键的异构体构象更易受包合扰动。结合常数计算显示，1t˙与γ-CD的结合常数达142.3 M^-1，远高于1c˙的72.6 M^-1；氯化钾浓度从0升至1 M时，1t˙/γ-CD体系的结合常数线性上升，吉布斯自由能变化从-12.29 kJ·mol^-1降至-15.68 kJ·mol^-1，表明离子强度通过削弱溶剂化竞争提升包合物稳定性。旋转相关时间结果显示，包合后自由基转动受限程度提升一个数量级，γ-CD体系的受限程度略高于β-CD。

Cyclic voltammetry measurements

循环伏安结果表明，两种异构体的氧化均为不可逆过程，包合后峰电流下降、阳极峰电位正移，对应扩散系数降低与氧化难度增加。电化学法测得的包合常数普遍高于EPR结果，但两者均呈现1t˙结合能力强于1c˙、γ-CD结合能力强于β-CD的规律，印证了主客体匹配度对稳定性的决定作用。

讨论与结论

研究结论指出，氮氧自由基的立体化学差异显著影响环糊精包合行为：1t˙因无分子内氢键，结合能力更强且构象变化更大；γ-CD凭借更大的空腔尺寸形成更稳定的包合物；离子强度升高通过削弱溶剂化屏障提升包合稳定性。EPR与循环伏安法虽给出不同的结合常数值，但对作用规律的揭示完全一致。该研究明确了立体化学与离子环境在主客体相互作用中的调控机制，为β-磷酸化氮氧自由基作为高灵敏自旋探针的设计与应用提供了关键理论依据。