仿生双层静电纺纳米纤维支架，表面涂覆贻贝粘附蛋白并包裹TGF-β3，以促进肩袖撕裂后的肌腱-骨骼愈合

《Materials Today Advances》：Biomimetic Double-Layered Electrospun Nanofibrous Scaffold with Mussel Adhesive Protein Coating and TGF-β3 Encapsulation for Enhanced Tendon-Bone Healing in Rotator Cuff Tears

　　盛芳|王一鸣|李环|李汉文|庄哲|王环|韩锋|盛浩|刘大川|李家英|朱晨旭|于启凡|李东|崔晨|张照帆|刘金波|李斌|陈松
江苏省常州市苏州大学第三附属医院关节骨科，213003，中国

**摘要**
肌腱-骨骼愈合不良是一个具有挑战性的问题，这导致旋转袖撕裂（RCT）修复后的再次撕裂率较高。肌腱-骨骼界面的复杂多组织结构及其有限的软骨形成能力阻碍了有效再生和愈合过程的恢复。在本研究中，我们开发了一种双层仿生纳米纤维支架，该支架封装了TGF-β3，并通过施加贻贝粘附蛋白（MAP）涂层进一步进行功能化，以靶向修复撕裂的旋转袖愈合部位。这种独特的双层结构在每层具有不同的纤维排列方式，模仿了肌腱和骨骼的异质性细胞外基质结构。这种设计为多种组织在界面处的生长提供了理想的仿生环境。体外研究表明，MAP涂层支架表现出优异的生物相容性和增强的细胞黏附性，促进了肌腱-骨骼界面的整合。此外，TGF-β3的持续释放促进了干细胞的募集和软骨分化，这一点在体外和体内实验中都得到了验证。RNA测序结果显示，PI3K-Akt信号通路可能与支架的调控效应有关。在大鼠RCT模型中，这种复合支架显著增强了肌腱-骨骼界面的软骨再生，恢复了愈合部位的结构和生物力学性能。因此，该复合支架为改善肌腱-骨骼愈合及推进旋转袖修复中的界面组织工程提供了有希望的策略。

**1. 引言**
旋转袖撕裂（RCT）是肩部最常见的疾病之一，其特征是严重的疼痛和功能障碍，尤其影响老年人和成人[1]。治疗RCT的主要方法是关节镜修复，但术后再次撕裂的发生率据报道为20%至60%[2],[3]。导致再次撕裂的主要因素是肌腱-骨骼愈合不良，表现为肌腱-骨骼界面处软骨再生不足及瘢痕形成[2],[4],[5],[6]。旋转袖中肌腱-骨骼连接处（愈合部位）的自然结构包括肌腱、软骨和骨骼，形成了一个梯度式多层结构[7],[8]。这种梯度结构有效地促进了载荷传递并减少了肌腱-骨骼界面的应力集中[7],[8],[9]。相比之下，瘢痕组织的机械强度和载荷传递能力远低于原始愈合部位，从而增加了修复界面再次撕裂的风险。因此，成功实现肌腱-骨骼愈合的关键在于恢复愈合部位的结构，尤其是软骨过渡区[7],[8],[9],[10],[11]。尽管其重要性显而易见，但在设计有效的肌腱-骨骼界面重建方法方面仍存在挑战。

鉴于组织本身的愈合能力有限，组织工程已被用于促进肌腱-骨骼愈合[12],[13],[14]。各种生物材料，如水凝胶[15],[16],[17]、静电纺丝纤维支架[4],[18]以及去细胞化的细胞外基质（ECM）支架[19],[20]，已被用于RCT的修复。理想的支架应具备以下特性：无毒、良好的生物相容性、可降解性及仿生性，能够作为临时的ECM支持细胞增殖和分化[4],[14],[21],[22]。静电纺丝支架由于其纳米级纤维结构、高孔隙率和较大的比表面积，与原始ECM的物理结构非常相似，在组织工程中得到了广泛应用，包括RCT修复[23],[24],[25],[26]。然而，值得注意的是，肌腱-骨骼界面不同于其他单一组织界面，它涉及软组织和硬组织，且这两种组织的ECM结构存在显著差异。一些文献指出，维持ECM结构的胶原纤维在肌腱组织中是排列整齐的，而在骨骼组织中则是随机分布的[7],[8]。因此，传统的单一结构支架无法同时复制这两种组织的结构。在本研究中，我们开发了一种双层仿生静电纺丝支架，在不同层中采用了不同的纤维排列方式。上层具有整齐的纤维排列，可以为肌腱提供仿生ECM结构；而下层具有随机纤维排列，模仿了骨骼的ECM结构。我们假设这种双层支架能够解决支架与肌腱-骨骼界面之间的不匹配问题，创造一个有利于多种组织生长的仿生环境。

聚乳酸-羟基乙酸共聚物（PLGA）是一种经FDA批准的无毒、可降解的合成共聚物，在生物医学应用中得到广泛使用[27],[28]。然而，PLGA作为疏水性材料，不利于细胞和组织的黏附。贻贝粘附蛋白（MAP）由海洋贻贝的足腺分泌，使贻贝能够在各种表面上（包括水环境中）表现出显著的黏附力。MAP由于含有丰富的3,4-二羟基苯丙氨酸（DOPA）和赖氨酸，因此具有低毒性、良好的生物相容性和强黏附性[29],[30]。MAP能够增强细胞黏附、促进细胞增殖和组织整合及再生，因此在生物再生医学中得到广泛应用[29],[30],[31],[32],[33]。文献报道，MAP功能化的静电纺丝纳米纤维和水凝胶可以加速伤口愈合，而涂有MAP的钛植入物可以提高骨整合[31],[32],[33]。在本研究中，我们利用MAP作为表面涂层来改善PLGA支架的亲水性和黏附性能。我们的假设是，MAP涂层支架可以增强肌腱和骨骼之间的结合，从而促进早期阶段的肌腱-骨骼结合和再生。

恢复软骨过渡区是重建旋转袖愈合部位的最关键且最具挑战性的环节。这一挑战源于肌腱-骨骼区域内软骨细胞的缺乏和软骨基质形成的限制[13],[14],[34]。已有研究表明，一些具有促软骨生成作用的细胞因子或药物可以促进肌腱-骨骼愈合[5],[10],[34]。转化生长因子-β3（TGF-β3）因其显著的促软骨生成能力而备受关注[35],[36],[37]，被认为是重建软骨过渡区、恢复愈合部位结构的最佳候选分子。然而，TGF-β3是一种亲水性蛋白质，活性半衰期较短，容易发生变性。因此，需要一个可靠且持续的释放系统来维持界面处TGF-β3的生物活性和有效浓度。文献综述了静电纺丝支架在生长因子输送中的应用，核壳结构支架可以实现生长因子的持续或可控释放，同时保持其生物活性[38],[39],[40],[41]。因此，我们采用乳化静电纺丝技术将TGF-β3封装到PLGA纳米纤维中，形成了支架纤维内的核壳结构。我们假设这种核壳结构能够保持TGF-β3的生物活性，并确保其持续释放，从而在肌腱-骨骼界面促进软骨再生。

在本研究中，我们开发了一种装载TGF-β3的静电纺丝纳米纤维支架，具有仿生双层结构和MAP涂层，旨在促进肌腱-骨骼愈合（图1），目标是恢复旋转袖的愈合部位结构。这种双层结构在每层具有不同的纤维排列方式，旨在同时模仿肌腱和骨骼的ECM结构，从而与肌腱-骨骼界面实现良好的匹配，为多种组织的生长提供仿生ECM环境。同时，MAP涂层支架表现出优异的生物相容性和黏附性，作为中间连接层，紧密结合肌腱和骨骼，有助于早期建立肌腱-骨骼连接。通过TGF-β3的持续释放，促进了干细胞的募集和分化，形成了软骨过渡区，最终重建了愈合部位结构。为了进一步评估这种功能化静电纺丝纳米支架的可行性和有效性，我们进行了体外评估，包括形态学、亲水性、黏附性、TGF-β3释放行为和软骨诱导能力的分析。此外，还进行了RNA测序以阐明复合支架的调控机制。最后，将支架植入大鼠RCT模型的肌腱-骨骼界面，并在体内评估了其对改善肌腱-骨骼愈合的效果。

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**图1. 用于促进RCT肌腱-骨骼愈合的MAP涂层和TGF-β3封装的仿生双层静电纺丝纳米纤维支架的制备过程。**
（A）复合静电纺丝纳米纤维支架的详细制备方法和过程。
（B）支架促进肌腱-骨骼界面再生的机制。

**2. 材料与方法**
**2.1. 静电纺丝纳米支架的制备**
准备了四种类型的静电纺丝支架：P-PL（磷酸盐缓冲盐水PBS@PLGA）、T-PL（TGF-β3@PLGA）、M-PL（MAP@PLGA）和T-M-PL（TGF-β3和MAP@PLGA）。对于含有TGF-β3的样品，首先将100 μL TGF-β3（50 μg/mL，PeproTech，美国）与50 μL透明质酸（HA，Macklin，中国，1.2% w/w）水溶液混合，形成HA-TGF-β3水溶液。对于P-PL和M-PL组，用等体积的PBS替代TGF-β3。随后将水溶液逐滴加入含有4 mg二氯甲烷（DCM，Qiangshun，中国）和0.02 g Span-80（Sigma-Aldrich，美国）的溶剂混合物中，在室温下高速搅拌，形成水包油（W/O）乳液。然后向乳液中加入1 g PLGA（65/35，MW=100 kDa，Daigang，中国）和2 g二甲基甲酰胺（DMF，Qiangsheng，中国），按照文献[41],[42]中的步骤进行静电纺丝。将制备好的溶液装入5-mL注射器中，通过注射泵（LSP01-3A，Longer Pump，中国）以0.8 mL/h的流速注入。针头用金属夹固定，并连接到高压电源（DW-P203-1ACF0，Dong Wen High Voltage，中国）。电压设置为15 kV，针头与收集器（SIBEINING，中国）之间的距离为15 cm。滚筒收集器的旋转速度设置为2,000 rpm，持续3小时以制备排列整齐的纤维层；之后将旋转速度降至100 rpm，再持续3小时在相同的收集器上制备随机纤维层，形成双层结构的支架。在静电纺丝工作液的后半部分加入2毫克苯酚红以标记随机纤维层。对于MAP工作液，将100 μL MAP（1.5 mg/mL，5%醋酸，Corning，美国）加入含有2.85 mL 0.1 M碳酸氢钠和50 μL 1 N氢氧化钠的中性缓冲液中，制备3.0 mL MAP工作液。在M-PL和T-M-PL组中，将MAP工作液以液膜形式涂覆在支架上（70 μL/cm2），并孵育至少30分钟。用无菌水清洗去除残留溶液后，支架进行真空干燥24小时，并在2-8°C下保存以备后续使用。

**2.2. 支架的表征**
通过对支架进行溅射镀金处理后，使用扫描电子显微镜（SEM，Quanta 250，FEI，美国）观察各层的形态和截面。利用Image J软件（NIH，Bethesda，美国）测量并分析纳米纤维的平均直径。此外，使用透射电子显微镜（TEM，FEI，美国）观察支架内单个纤维的结构。通过傅里叶变换红外光谱（FTIR，Nicolet 6700，Thermo Fisher Scientific，美国）检测支架的分子结构。使用带视频功能的测角仪（DSA25，KRUSS，德国）通过静止滴法测定水接触角（WCA），以评估支架的亲水性。利用万能机械测试系统（HY-0580，Hengyi，中国）以5 mm/min的速度进行剪切测试，评估支架与玻璃片的黏附性。

**2.3. TGF-β3的装载和释放检测**
为了确认支架中TGF-β3的装载和分布，使用Cy5荧光标记的牛血清白蛋白（BSA-Cy5，Bioss，中国）作为TGF-β3的替代物，并加入静电纺丝工作液中。收集到的静电纺丝纤维放置在玻璃片上，使用荧光显微镜（Zeiss Axiovert 200，美国）在明场和荧光场下观察。

**2.4. TGF-β3的释放研究**
为了研究TGF-β3的释放特性，将重量为50 mg的静电纺丝支架（理论上含有0.25 μg TGF-β3）浸入含有1% BSA的4 mL PBS中并持续振荡。在特定的时间点（1、2、3、5、7、10、15、20、25和30天），收集1毫升的上清液，并加入等量的PBS。使用TGF-β3 ELISA试剂盒（Solarbio，中国）定量上清液中释放的TGF-β3，并绘制释放曲线。2.4. 支架上的细胞活力和增殖所有动物实验严格遵循NIH关于实验室动物护理和使用的指南，并获得了苏州大学伦理委员会的批准（ECSU）。从Sprague-Dawley（SD）大鼠的股骨中提取骨髓干细胞（BMSCs），并在含有10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素（均来自Gibco，美国）的α-MEM完全培养基中培养。所有实验使用的是第3代的BMSCs。电纺支架被定制为包裹直径14毫米的圆形盖玻片，并经过灭菌以用于细胞实验。BMSCs以1×10^4细胞/毫升的密度种植在不同的支架层上，放在24孔板中。对照组不包含任何支架。培养3天后，进行活/死细胞染色以评估支架上的细胞活力。移除培养基后，将细胞与活/死细胞染色溶液（Invitrogen，美国）在室温下孵育30分钟。使用荧光显微镜拍摄图像，并计算三个随机选取视野中的活细胞数量。为了评估细胞增殖，将BMSCs种植在支架上并培养1、3和5天。在每个时间点，将细胞在含有10% CCK-8溶液（Dojindo，日本）的新鲜完全培养基中孵育2小时。随后，将100微升混合液移液到96孔板中，并使用微孔板读数器（BioTek，美国）在450纳米波长下测量吸光度。2.5. 免疫荧光在不同支架上使用完全培养基培养3天后，用4%的甲醛（Biosharp，中国）固定BMSCs，然后用0.3%的Triton X-100（Sigma-Aldrich，美国）在PBS中渗透20分钟。之后，用Immunol Staining Block（Beyotime，中国）封闭细胞1小时。接着在4°C下用1:100稀释的抗Vinculin一级抗体孵育细胞过夜。进一步使用Alexa Fluor 488二级抗体（稀释度为1:400，Abcam，英国）在室温下孵育1小时。随后，用Rhodamin-Phalloidin（稀释度为1:300，Yeasen，中国）孵育1小时和DAPI孵育10分钟。然后在荧光显微镜下获取图像。此外，BMSCs还在包含高葡萄糖DMEM、100 nM地塞米松、50 mg/mL抗坏血酸2-磷酸盐、1 mM丙酮酸、40 μg/mL脯氨酸（均来自Sigma-Aldrich，美国）和1%胰岛素转铁蛋白硒（ITS，Becton Dickinson，美国）的基本软骨生成分化培养基上培养。培养7天后，如上所述，进行胶原蛋白II（COL II）免疫荧光（抗COL II一级抗体稀释度为1:200）和摄影。所有使用的一级抗体列在表S1中。2.6. 体外BMSCs招募效应通过Transwell实验评估支架对BMSCs的招募效应。简而言之，将含有总共2×10^4 BMSCs的200微升悬浮液放入24孔Transwell板（孔径8-μm，Corning，美国）的上室。在下方室中放置支架和500微升培养基。同时，建立无支架组（下室不含生物活性因子）和TGF-β3组（下室不含支架但含有10 ng/mL TGF-β3）作为与支架组的对比。经过12小时和24小时的孵育期后，用PBS冲洗Transwell板，然后用4%甲醛固定。随后，用棉签擦拭Transwell膜上方的细胞，然后用0.1%结晶紫溶液染色。之后，捕获并量化迁移到下方室的染色细胞，在三个随机选取的显微镜视野中计数。2.7. 实时定量PCR（RT-qPCR）分析为了评估在不同支架上培养的BMSCs的软骨生成分化，使用RT-qPCR在基本软骨生成分化培养基中孵育3天后，测定BMSCs中与软骨生成相关的基因（Col2a1和Acan）的表达水平。简而言之，使用Trizol试剂（Invitrogen，Carlsbad，美国）从BMSCs中提取RNA，并使用NanoDrop 2000分光光度计（Thermo Fisher Scientific，美国）测定RNA浓度。随后，使用RT Master Mix（ABM，加拿大）将RNA转换为cDNA，并在Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR系统（Applied Biosystems，美国）上使用SYBR Green Supermix（BioRad，美国）进行RT-qPCR。相对基因表达使用2-ΔΔCt方法计算，并归一化到Gapdh。本研究中使用的所有一级抗体列在表S2中。2.8. RNA-seq和生物信息学分析为了深入研究复合支架对BMSCs的调控机制，进行了RNA测序。培养3天后，使用Trizol试剂从对照组和T-M-PL组的BMSCs中提取总RNA。每组设置三个平行样本。使用NanoDrop ND-2000测定每个RNA样本的数量和纯度，并使用Bioanalyzer 2100（Agilent，美国）评估RNA完整性。高质量RNA样本（总RNA量> 1 μg，RNA浓度> 50 ng/μL，OD值260/280范围1.8-2.2，RIN值> 7.0）被过滤以构建测序文库。文库构建过程包括mRNA纯化、捕获、片段化、逆转录为cDNA，然后进行A-tailing、接头连接和PCR扩增。随后，使用Illumina NovaseqTM 6000（LC-Bio，中国）进行RNA-seq。使用edgeR软件包（Bioconductor，版本3.32.1，美国）以≥ 2的倍数变化和p < 0.05的标准鉴定差异表达基因（DEGs）。最后，对DEGs进行基因本体论（GO）和京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集分析，以了解复合支架影响的生物过程和途径。2.9. Western blot分析为了进一步验证调控信号通路的作用，进行了Western blot分析。培养5天后，使用RIPA裂解缓冲液（Beyotime，中国）从对照组、P-PL组、T-PL组和T-M-PL+MK-2206组的BMSCs中提取蛋白质。使用MK-2206是基于之前的研究[43]，其中BMSCs用MK-2206（5 μmol/L）作为Akt抑制剂处理。使用BCA蛋白测定试剂盒（Beyotime，中国）测定所有样本中的蛋白质浓度。通过10% SDS-PAGE凝胶分离后，将蛋白质转移到硝酸纤维素膜（Beyotime，中国）上。然后将膜封闭1小时，并在4°C下与一级抗体（1:1000稀释的抗AKT、1:5000稀释的抗AKT1/P-AKT、1:1000稀释的抗Smad2/3、1:1000稀释的抗COL II和1:1000稀释的抗GAPDH）孵育过夜。用含有0.1% Tween的PBS洗涤后，将膜在室温下与1:1000稀释的过氧化物酶结合二级抗体（Beyotime，中国）孵育1小时。最后，使用FluorChem成像系统（Protein Simple，美国）可视化免疫反应条带。本实验中使用的一级抗体列在表S1中。2.10. 动物模型和支架植入实验获取了12周大、体重约400克的雄性SD大鼠进行实验。动物实验分为五组：（ⅰ）无支架植入的缺陷组，（ⅱ）P-PL支架组，（ⅲ）T-PL支架组，（ⅳ）M-PL支架组，以及（ⅴ）T-M-PL支架组（每组n=12）。在腹腔注射戊巴比妥麻醉并进行常规消毒后，在肩部中线前方外侧做纵向切口。依次分离三角肌和肩锁关节，然后暴露旋转袖肌腱（图S1）。接着在肱骨大结节表面的肌腱附着点处解剖冈上肌腱。在附着点区域进行去皮质处理后，将支架放置在冈上肌腱和大结节之间，使支架的白色面朝上并与肌腱纤维方向平行。之后，用3-0 Ethibond缝线（Ethicon，美国）通过骨缝线将分离的冈上肌腱连同支架重新连接到附着点。逐层关闭伤口，并在术后连续三天用碘消毒切口。2.11. 干细胞在体内的招募效应通过SOX2的免疫荧光评估支架对干细胞的招募效应，SOX2是干细胞的分子标记物。手术后1周收集样本，并在10%甲醛溶液中固定24小时。用14%乙二胺四乙酸（EDTA）脱钙30天后，将样本包埋在石蜡中并切片至6微米厚度。切片 Immunofluorescence 的程序与之前描述的组织类似。简而言之，抗原回收后，先将切片封闭1小时，然后在4°C下与1:100稀释的抗SOX2一级抗体（表S1）孵育过夜。接着在室温下与1:200稀释的Cy3结合二级抗体（Abcam，英国）孵育1小时。用DAPI对细胞核进行染色后，用荧光显微镜观察切片。使用Image J软件测量并分析界面区域的SOX2阳性细胞平均数量。2.12. 组织学分析在手术后的4周和8周收集冈上肌腱-肱骨复合体的样本，然后进行固定、脱钙、石蜡包埋和切片。如前所述进行H&E染色以观察组织学。使用Safranin O/Fast green（SO/FG）染色来评估软骨ECM的主要成分——糖胺聚糖的形成。使用Masson trichrome（MT）染色来评估腱骨界面处胶原蛋白的形成，这是腱成熟的重要指标[44]。为了分析COL II蛋白在体内的表达变化，进行了免疫组化（IHC）染色。抗原回收后，样本在室温下封闭1小时。随后在4°C下与1:200稀释的抗COL II一级抗体（表S1）孵育过夜，然后在室温下与1:100稀释的HRP标记的二级抗体（Beyotime，中国）孵育1小时。接着用3,3'-二氨基联苯胺（DAB，Sigma-Aldrich，美国）和hematoxylin顺序染色样本。最后，使用明场显微镜观察切片。引入了改良的腱成熟评分[45]来评估再生的腱和腱骨连接。使用Image J软件对MT染色、SO/FG染色和COL II IHC阳性染色区域的比例/强度进行定量分析。2.13. 生物力学测试在手术后的8周，收集冈上肌腱-肱骨复合体的样本。使用数字卡尺（Fig. 8B）测量肱骨头部冈上肌腱附着点的横截面积。使用电子通用力学测试机（TY-8000A，TYTESTER，中国）（Fig. 8A）进行生物力学测试。用夹具固定腱和肱骨，并将其对准在一条直线上。将样本预加载至1 N，然后以10 mm/min的速率加载至失效。最终负载至失效值记录为肱骨-冈上肌腱复合体承受的最大力，并记录伸长率。应力和刚度分别计算为最终负载至失效值除以横截面积或伸长率。下载：下载高分辨率图像（987KB）下载：下载全尺寸图像图8. 术后8周的生物力学评估。(A) 肱骨-冈上肌腱复合体的单轴拉伸测试。(B) 使用数字卡尺测量肌腱附着点的横截面积。(C) 肱骨-冈上肌腱复合体的最终负载至失效。(D) 不同组的附着点横截面积。(E) 肱骨-冈上肌腱复合体的应力。(F) 肱骨-冈上肌腱复合体的刚度。(P, PBS; T, TGF-β3; M, 贝壳粘连蛋白 (MAP); PL, PLGA. *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001, ****p < 0.0001; ns, 无显著差异。)2.14. 统计分析所有值表示为平均值 ± 标准差。使用GraphPad Prism软件（版本8，美国）进行统计分析。采用单因素方差分析（ANOVA）后进行Tukey检验来比较多个组之间的差异。p值小于0.05被认为在统计学上具有显著性。3. 结果 3.1. 支架的特性分析 通过扫描电子显微镜（SEM）观察了四种类型支架（P-PL、T-PL、M-PL和T-M-PL）每一层的纤维排列情况。纤维在排列有序的层中呈平行排列，在随机层中则呈现不规则的方向（图1A），分别模仿了肌腱和骨骼的细胞外基质（ECM）结构。四种支架中纤维的平均直径分别为607.6 ± 114.3纳米（P-PL）、648.4 ± 133.4纳米（T-PL）、943.6 ± 178.7纳米（M-PL）和977.1 ± 173.6纳米（T-M-PL）（图1B和S2）。MAP涂层组与非MAP涂层组之间存在显著差异。无论是否添加TGF-β3，各组之间的纤维直径没有明显差异。所有纤维表面光滑，视野中仅观察到极少的珠状突起。透射电子显微镜（TEM）图像确认了所有组中的核壳纤维微观结构，在M-PL和T-M-PL组中，MAP涂层包裹着纳米纤维（图1C）。傅里叶变换红外光谱（FTIR）显示了PLGA特有的酯酰羰基吸收（1750厘米^-1）和C–O–C/C–O吸收（1000–1200厘米^-1）特征。M-PL和T-M-PL支架还显示了MPA特有的酰胺吸收（1540–1660厘米^-1）和N–H/O–H吸收（3200–3600厘米^-1）特征，表明MAP已成功结合到支架上。支架的宏观观察结果如图1E所示，其中随机层被酚红标记，排列有序的层则用支架的白色部分表示。此外，通过玻璃片的拉普剪切试验评估了支架的粘附性，结果显示MAP涂层的组别剪切应力显著高于未涂层的组别（图1F）。通过静态滴液实验测定了不同类型支架各层的亲水性。如图1G所示，MAP涂层支架的接触角（WCA）显著低于非MAP涂层组，表明MAP涂层提高了支架的亲水性。同时，无论是否添加TGF-β3，各组之间的WCA没有明显差异，表明TGF-β3并未影响支架的亲水性。

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图1. 支架的特性。(A) 扫描电子显微镜（SEM）观察支架不同层中的纤维排列。(B) 不同支架中纤维的直径（n = 50，来自三张图像).(C) 单根纤维结构的透射电子显微镜（TEM）图像。(D) 支架的傅里叶变换红外光谱（FTIR）。(E) 双层支架的宏观观察。随机层用酚红标记。(F) 用于评估支架粘附性的拉普剪切试验。(G) 不同支架的接触角（WCA）。(H) 纤维中BSA-Cy5的分布。(I) T-M-PL支架中TGF-β3的体外释放动力学。(A，排列有序层；R，随机层。P，PBS；T，TGF-β3；M，贻贝粘附蛋白（MAP）；PL，PLGA)。****p < 0.0001；ns，无显著差异。

3.2. TGF-β3的分布和释放 图1H显示了荧光BSA-Cy5在纳米纤维中的分布，表明通过乳液静电纺丝技术成功将细胞因子加载到支架中。图1I展示了T-M-PL支架中TGF-β3的释放行为，其累积释放量分别为：1天24.68 ± 1.03%、3天45.83 ± 0.24%、5天55.33 ± 0.41%、10天67.84 ± 0.45%、15天73.09 ± 0.13%、20天77.10 ± 0.06%和30天77.75 ± 0.11%。在最初的3天内观察到快速释放现象，随后20天内释放保持稳定并持续进行。30天内TGF-β3的累积释放量接近80%，整个释放过程符合Korsmeyer-Peppas释放动力学模型（图S3）。

3.3. 细胞在支架上的存活率、形态、粘附性和增殖 通过活/死细胞染色评估了细胞在支架上的存活情况。如图2A所示，所有组中观察到大量活细胞，仅有少数死细胞，表明PLGA静电纺丝支架无毒。此外，在添加MAP的组中观察到更多活细胞，表明MAP涂层提高了支架的生物相容性。同一类型支架的排列有序层和随机层之间以及是否添加TGF-β3的组之间均未观察到显著差异（图2C），表明纤维排列和TGF-β3不影响支架的生物相容性。细胞骨架染色（图2B，第一列和图S4）显示BMSC在支架不同层上的不同形态和排列方式。在每个支架的排列有序层上，BMSC呈延长且高度有序的排列，类似于天然肌腱组织中的肌腱细胞。在随机层上，BMSC呈现不规则形状和随机方向，类似于天然骨组织中的细胞。Vinculin免疫荧光显示，添加MAP的组中的荧光强度显著高于未添加MAP的组（图2B，第二列和D），表明MAP涂层增强了细胞在支架上的粘附性。同时，未添加MAP的组之间荧光强度没有明显差异，表明纤维排列和TGF-β3对细胞在支架上的粘附性没有显著影响。此外，使用CCK-8测定法评估了BMSC在支架上的增殖情况。培养1天、3天和5天后，添加MAP的组中的细胞增殖显著高于未添加MAP的组（图2E），表明MAP涂层促进了细胞在支架上的增殖。无论是否添加TGF-β3，各组之间均未观察到显著差异，表明TGF-β3对BMSC的增殖没有明显影响。

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图2. 不同支架层上细胞的存活率、形态、粘附性和增殖。(A) 活/死细胞染色。(B) 细胞骨架、细胞核和Vinculin免疫荧光。(C) 不同组活/死细胞染色中的活细胞数量。(D) 不同组的Vinculin荧光强度。(E) CCK-8细胞增殖测定。(A/, 排列有序层；R/, 随机层。P, PBS；T, TGF-β3；M, 贻贝粘附蛋白（MAP）；PL, PLGA；OD, 光密度。*p < 0.05；**p < 0.01；***p < 0.001；****p < 0.0001；ns, 无显著差异。

3.4. 对BMSC体外募集和软骨生成分化的作用 通过Transwell实验研究了支架对BMSC的募集效应。在添加TGF-β3的组中观察到细胞迁移，而在未添加TGF-β3的组中，12小时后几乎没有细胞迁移到下层培养皿（图3A，第一行）。培养24小时后，添加TGF-β3的组中迁移到下层培养皿的细胞数量显著增加（图3A，第二行和C）。加载了TGF-β3的支架组（T-PL和T-M-PL）的迁移细胞数量与10 ng/mL TGF-β3组相当，证实了支架释放的TGF-β3对BMSC的募集效应。通过免疫荧光检测了BMSC中与软骨生成相关的COL Ⅱ蛋白的表达情况。如图3B和D所示，添加TGF-β3的组中COL Ⅱ的荧光强度明显高于未添加TGF-β3的组，表明支架释放的TGF-β3有效诱导了BMSC的软骨生成分化。此外，同一类型支架的排列有序层和随机层之间未检测到显著差异，表明BMSC的软骨生成分化与支架的纤维排列无关。此外，使用RT-qPCR定量分析了与软骨生成相关的基因表达情况。添加TGF-β3的组中Col2a1和Acan的表达水平显著高于未添加TGF-β3的组（图3E），与免疫荧光结果一致。

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图3. 支架对BMSC的体外募集和促软骨生成分化作用。(A) 12小时和24小时Transwell实验中迁移的BMSC的代表性图像。(B) 不同支架层上培养的BMSC的COL Ⅱ免疫荧光。(C) 迁移细胞的定量分析。(D) 不同组中COL Ⅱ的荧光强度。(E) 通过RT-qPCR定量分析不同支架上BMSC的软骨生成相关基因表达（Col2a1和Acan）。(对照组：无支架或生物活性因子。A/, 排列有序层；R/, 随机层。P, PBS；T, TGF-β3；M, 贻贝粘附蛋白（MAP）；PL, PLGA。*p < 0.05；**p < 0.01；***p < 0.001；****p < 0.0001；ns, 无显著差异。

3.5. 复合支架对BMSC调节作用的机制 为进一步阐明复合支架对BMSC调节作用的机制，我们进行了RNA-seq分析。主成分分析（图S5）显示，对照组（Ctrl，无支架或生物活性因子）与T-M-PL组之间存在明显的转录组差异，每组三个重复样本之间的分散度较低。火山图（图4A）显示，与对照组相比，T-M-PL支架培养的BMSC中有667个基因显著上调，364个基因下调。基因表达热图显示了两组之间的差异表达基因（DEGs）（图4C）。与细胞粘附（Spp1、Itga1、Edil3等）和ECM（Tgfbi、Col9a3、Angptl4等）相关的基因在T-M-PL组中上调。为了揭示T-M-PL组中高表达基因的功能，进行了GO分析。如图4B所示，两组之间的DEGs富集在包括ECM、含胶原的ECM、细胞表面和整合素复合体在内的GO术语中。一致地，基因集富集分析（GSEA）表明，与细胞粘附和软骨凝聚正相关的DEGs在T-M-PL组中上调（图4E），证实了复合支架对细胞粘附和ECM形成的促进作用。为了明确涉及的潜在信号通路，进行了KEGG通路富集分析。如图4D所示，PI3K-Akt通路显示了最多的富集DEGs，表明复合支架的功能可能通过PI3K-Akt通路调节。Western blot分析显示，T-M-PL组中磷酸化AKT（P-AKT）和COL Ⅱ的表达水平同时显著上调（图4F）。进一步验证Akt通路的参与作用，引入了MK-2206作为药理抑制剂。结果表明，抑制Akt磷酸化显著降低了T-M-PL+MK-2206组中的P-AKT和COL II表达，而总AKT表达没有明显变化。此外，TGF-β-Smad通路中的关键蛋白Smad2/3在T-M-PL组中上调，且MK-2206处理后未改变。这些发现提供了药理学证据，表明复合支架整体上通过PI3K-Akt通路促进了含胶原的ECM的形成。

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图4. RNA-seq、生物信息学和复合支架对BMSC调节作用的机制分析。(A) 差异表达基因（DEGs）的火山图。(B) 基因本体（GO）分析。(C) 基因表达热图。(D) 京都基因与基因组百科全书（KEGG）富集。(E) 基因集富集分析（GSEA）。(F) Western blot分析。(P, PBS；T, TGF-β3；M, 贻贝粘附蛋白（MAP）；PL, PLGA；P-AKT, 磷酸化AKT)

3.6. 支架在体内的性能 3.6.1. 对干细胞的体内募集作用 通过SOX2免疫荧光评估了支架对干细胞的体内募集作用。如图5A所示，所有组的骨骼和骨髓组织中都观察到了红色荧光，证实BMSC可能被SOX2免疫荧光标记。此外，在T-PL和T-M-PL组中，靠近肌腱-骨骼界面的SOX2阳性细胞数量更多，表明加载了TGF-β3的支架能够有效募集BMSC到该界面区域。

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图5. 体内的干细胞募集作用。(A) SOX2免疫荧光。BMSC被红色荧光标记，并在T-PL和T-M-PL组中被募集到肌腱-骨骼界面。(B) SOX2阳性细胞的数量。(T-I-B: T, 肌腱；I, 肌腱-骨骼界面；B, 骨骼。P, PBS；T, TGF-β3；M, 贻贝粘附蛋白（MAP）；PL, PLGA。*p < 0.05；**p < 0.01；ns，无显著差异。

3.6.2. 组织学评估 使用H&E染色检查了宏观组织结构，重点关注肌腱-骨骼界面处的细胞排列和密度。如图6A所示，术后4周，未植入支架的缺陷组界面处的组织形态混乱。相比之下，植入支架的组在界面处表现出更有序的细胞和肌腱纤维排列，以及更高的改良肌腱成熟度评分，这表明支架在塑造沿其生长的细胞和新组织方面发挥了作用。此外，含有MAP的组的界面新组织显得更为密集，表明MAP涂层的支架具有良好的生物相容性，有助于更好的细胞粘附和增殖。8周后，M-PL和T-M-PL组观察到更规则排列和更密集的组织。通过MT染色评估了肌腱-骨界面的胶原蛋白形成情况。如图6B和D所示，缺陷组在界面处蓝色染色区域的比例较小，表明胶原蛋白形成有限，肌腱成熟度较低。相比之下，T-M-PL组在界面处显示出最高的胶原蛋白形成水平，蓝色染色区域的最大比例，表明复合支架有效促进了界面处的胶原蛋白形成和肌腱成熟。此外，通过SO/FG染色评估了糖胺聚糖的形成情况。在术后4周和8周时，含有TGF-β3的组在界面处观察到了更大的异染区比例（图7A和C），表明支架持续释放的TGF-β3促进了糖胺聚糖的形成，从而有助于肌腱-骨界面的软骨基质再生。COL Ⅱ IHC染色显示了COL Ⅱ蛋白的形成水平。在术后8周时，含有TGF-β3的组在界面处观察到更大的异染区比例和更高的强度（图7B和D），与SO/FG染色结果一致。T-M-PL组在SO/FG染色和COL Ⅱ IHC染色中均显示出最大的异染区，表明复合支架有效促进了肌腱-骨界面处的软骨生成。

与缺陷组相比，植入支架的组在界面处细胞和肌腱纤维的排列更为有序，修饰后的肌腱成熟度评分也更高，表明支架在塑造沿其生长的细胞和新组织方面发挥了作用。此外，含有MAP的组界面新组织更为密集，表明MAP涂层的支架具有良好的生物相容性，有助于更好的细胞粘附和增殖。8周后，M-PL和T-M-PL组观察到更规则且更密集的组织。通过MT染色评估了肌腱-骨界面的胶原蛋白形成情况。图6B和D显示，缺陷组在界面处蓝色染色区域的比例较小，表明胶原蛋白形成有限，肌腱成熟度较低。相比之下，T-M-PL组在界面处蓝色染色区域的比例最大，表明复合支架有效促进了胶原蛋白的形成和肌腱成熟。进一步通过SO/FG染色评估了糖胺聚糖的形成情况，在术后4周和8周时，含有TGF-β3的组在界面处观察到更大的异染区比例。COL Ⅱ IHC染色显示COL Ⅱ蛋白的形成水平。图7B和D显示，在术后8周时，含有TGF-β3的组在界面处观察到更大的异染区比例和更高的强度，与SO/FG染色结果一致。T-M-PL组在SO/FG染色和COL Ⅱ IHC染色中均显示出最大的异染区，表明复合支架有效促进了肌腱-骨界面处的软骨生成。

3.6.3 生物力学测试
生物力学测试使用电子万能力学测试机进行，图8A显示了测试前的和测试后的代表性图像。在拉伸测试过程中，随着拉伸的进行，肱骨-肌腱复合体通常会在肌腱部分发生伸长和变形，最终导致失效或断裂。使用数字卡尺测量了肌腱在肱骨表面（旋转袖腱附着点）的截面积（图8B）。如图8D所示，含有支架植入物的组的截面积显著大于缺陷组。含有支架植入物的组与正常样本之间没有显著差异，证实支架为新组织再生提供了足够的空间。术后8周时，T-PL和T-M-PL组的肱骨-冈上肌腱复合体的最终载荷-失效值、应力和刚度值高于其他组，并且与正常样本相当（图8C、E和F）。这表明TGF-β3在肌腱-骨界面持续释放促进了软骨形成，对恢复旋转袖的生物力学性能至关重要。

4. 讨论
肌腱-骨愈合不良是一个棘手的问题，导致RCT修复后的再撕裂率较高[3]，[5]。这一问题主要由两个因素引起。首先，复杂的肌腱-骨界面由具有不同结构的组织组成，使得它们难以有效整合。其次，缺乏足够的软骨生成来建立肌腱和骨骼之间的软骨过渡区，这对于恢复旋转袖的天然附着结构至关重要[5]，[6]，[10]，[46]，[47]，[48]。为了应对这些挑战，我们开发了一种双层仿生结构的静电纺纳米纤维支架，其中包裹了TGF-β3，并对其表面进行了MAP修饰。这种创新方法为促进肌腱-骨愈合提供了新的策略。

在肌腱和骨骼之间建立组织生长和连接是肌腱-骨愈合的基本且关键步骤。在本研究中，我们制备了一种MAP涂层的静电纺纳米纤维支架，并将其植入肌腱-骨界面。静电纺纳米纤维支架作为细胞外基质（ECM），支持多种组织的生长，并通过MAP涂层实现良好的粘附，充当紧密连接肌腱和骨骼的中间链接物。生物力学剪切测试显示，MAP涂层支架组的界面粘附力更强。同时，我们观察到MAP涂层支架组在早期有更多的活性细胞，并且细胞增殖也更强。我们认为这归因于MAP涂层改善了初始细胞粘附，其机制如下：（1）从支架物理特性的角度来看，PLGA本身具有疏水性，限制了细胞附着。MAP涂层降低了支架表面的疏水性（如图1G所示，含有MAP涂层的支架的水接触角更低），有助于细胞在支架上的初始附着。（2）从支架生物学特性的角度来看，MAP涂层含有丰富的多巴胺（DOPA）和粘附化学基团，这些基团增强了细胞对支架的粘附，这一点通过vinculin免疫荧光染色得到了证实。因此，MAP涂层支架组在早期有更多的活性细胞附着在支架上，从而导致随后更强的细胞增殖。因此，H&E染色显示，含有MAP的组在早期肌腱和骨骼之间的新组织更为密集，连接也更好。此外，我们注意到MAP涂层支架（M-PL、T-M-PL）的纤维直径更大（约900纳米 vs 约600纳米）而非MAP组（P-PL、T-PL）。关于支架纤维直径的变化是否会影响细胞增殖，文献[49]、[50]报告称支架的纤维直径确实会影响细胞活性，Wang [50]指出400纳米直径的静电纺支架比800纳米直径的支架更有利于细胞生长。这可能是因为较小的纤维直径提供了更大的表面积，有利于细胞粘附和增殖。然而，在本文中我们注意到CCK-8实验显示相反的结果，即MAP组具有更大的纤维直径的组细胞增殖更强。这有力地证实了MAP是促进细胞增殖的主要因素。

此外，强调支架结构必须与相邻组织的结构相容非常重要。这是因为支架决定了沿其生长的新组织的形状和排列，从而影响其功能[14]，[51]，[52]。然而，肌腱-骨界面包含软组织和硬组织，结构差异显著。先前的研究表明，作为维持组织结构基础的ECM中的胶原纤维在肌腱侧呈现出有序排列，而在骨骼侧则呈现无序状态[8]，[10]。因此，传统的单一结构的支架无法同时匹配肌腱-骨界面的两种不同组织结构。在本研究中，我们制备了一种双层结构的仿生静电纺纳米纤维支架，每层具有不同的纤维排列。扫描电子显微镜（SEM）观察显示，上层的纤维排列有序且平行，与肌腱组织中的ECM结构一致，而下层的纤维排列无序，类似于骨骼中的ECM结构。细胞骨架染色显示，有序层中的细胞呈伸长且定向排列，类似于天然肌腱组织中的细胞。相比之下，无序层中的细胞形状不规则且排列随机，类似于天然骨组织中的细胞。每层上不同的细胞形态和排列证实了双层支架在体外的仿生效果。此外，H&E和MT染色显示，含有支架的组中肌腱纤维更为有序，植入区域? ???生成也更多，证实了支架在体内的仿生效果。因此，双层静电纺纳米纤维支架表现出良好的结构仿生特性，能够同时匹配肌腱和骨骼组织，为界面处的多种组织再生提供仿生环境。

在肌腱-骨界面形成软骨过渡区对于恢复天然的附着结构和实现可靠的肌腱-骨愈合至关重要[6]，[8]，[9]。由于软骨细胞的缺乏和内在的软骨生成能力有限，肌腱-骨界面的软骨形成不足，导致疤痕组织替代，生物力学强度较低[34]，[53]。已探索了多种具有软骨分化潜能的外源性干细胞（包括BMSCs）作为种子细胞来促进体内的软骨再生[16]，[54]，[55]，[56]，[57]。然而，这种方法存在缺点，包括免疫排斥、供体短缺以及移植后的细胞存活率低。相比之下，通过细胞因子或药物在界面处招募自体干细胞可以规避这些问题。在本研究中，将TGF-β3负载到静电纺纳米纤维支架中，并将其输送到肌腱-骨界面，以促进自体干细胞的局部招募和软骨分化。Transwell实验和组织切片的SOX2免疫荧光染色分别证实了支架在体外和体内的干细胞招募能力。值得注意的是，TGF-β3作为一种生物活性蛋白，在不利条件下可能会变得不稳定且无效。此外，其较短的活性半衰期可能导致维持生物效应所需的浓度不足。因此，需要一个可靠且持续的释放系统。在本研究中，我们使用乳液静电纺丝技术将TGF-β3-HA水溶液封装到PLGA纳米纤维中，形成核壳结构单元，通过TEM观察得到了证实。HA水溶液作为一种保护剂，防止了TGF-β3在高压静电纺丝过程中的变性和失活。与表面吸附或化学偶联方法相比，核壳结构封装为TGF-β3提供了更好的储存和保护。我们注意到ELISA检测显示TGF-β3在早期（0-5天）迅速释放。这可能与两个原因有关：（1）支架内外TGF-β3的浓度梯度差异，导致TGF-β3的扩散；（2）一些未封装在纤维内部的TGF-β3从纤维表面解离并迅速释放。在后期，随着支架逐渐降解，储存在PLGA纤维内的TGF-β3持续释放，体外释放量接近80%，符合Korsmeyer-Peppas释放动力学模型。由于TGF-β3持续有效释放，它随后促进了软骨相关基因的表达。COL Ⅱ免疫荧光、Western blot分析和RT-qPCR显示，含有TGF-β3的组中软骨生成相关蛋白质和基因的表达显著增加，证实了TGF-β3负载支架在体外的促软骨分化效应。体内实验显示，术后8周时，TGF-β3负载支架组的肌腱-骨界面处异染区更大，强度也更高。此外，生物力学测试显示TGF-β3组的最终载荷-失效值、应力和刚度也高于正常样本。这些结果表明，通过恢复带有软骨过渡区的附着结构，旋转袖的生物力学强度得到了相应的提升。为了进一步阐明T-M-PL复合支架的调控机制，我们使用RNA-seq技术研究了经过该复合支架处理的骨髓间充质干细胞（BMSCs）的基因表达谱。测序数据显示，差异表达基因（DEGs）主要富集在与细胞外基质（ECM）及含胶原蛋白的ECM相关的GO术语中。与对照组相比，T-M-PL组中与这些术语相关的基因表达显著上调。此外，KEGG通路富集分析显示PI3K-Akt信号通路最为相关。已知PI3K-Akt信号通路与多种细胞生物过程有关，包括细胞增殖、粘附、迁移、分化和ECM调控[58, [59], [60]。先前的研究报道，激活PI3K-Akt信号通路可以增加髓核细胞中特异性软骨蛋白（如Col II和Aggrecan）的表达[61]。相反，抑制PI3K-Akt信号通路会上调促进ECM降解的MMP13蛋白的表达水平。还有研究表明，骨形态发生蛋白2（BMP2）激活PI3K-Akt信号通路可以减少ECM的降解[62]。在我们的研究中，western blot分析显示T-M-PL组中P-AKT和COL II的表达同时上调，而总AKT水平保持相对不变。同时，TGF-β-Smad信号通路中的关键蛋白Smad2/3在T-M-PL组中表达上调，但在MK-2206处理后未发生变化。Smad2/3的表达趋势与COL II的变化并不完全一致。因此，我们推测T-M-PL复合支架可能主要通过PI3K-Akt信号通路促进了软骨ECM的形成。这一发现提示了复合支架增强BMSCs软骨分化并有助于在肌腱-骨骼界面形成功能性ECM的潜在机制。

本研究存在一些局限性。首先，建立的是急性RCT大鼠模型，而临床中的某些RCT病例实际上是旋转袖慢性退化的结果，急性模型可能无法完全模拟慢性退化的复杂病理变化。其次，尽管证明了MAP涂层的良好生物相容性和粘附性，但其相对较高的成本可能成为广泛应用的潜在障碍，尤其是在临床环境中。第三，PLGA的降解产物（乳酸和羟基酸）可能会影响pH值，并对细胞和组织再生产生不利影响，这一问题需要进一步解决。最后，由于实验设备的限制，我们的研究缺乏对肌腱-骨骼修复过程进行磁共振成像（MRI）评估以及步态分析来评估动物活动和行为的能力。在未来研究中解决这些局限性将有助于提高研究结果在临床应用中的转化相关性。

5. 结论

在这项研究中，我们成功开发了一种载有TGF-β3的电纺纳米纤维支架，该支架具有双层仿生结构和MAP涂层。这种创新支架旨在促进RCT修复后的肌腱-骨骼愈合。MAP涂层显著提高了支架的生物相容性和粘附性，在组织连接的早期阶段起到了有效的中介作用。此外，双层结构模仿了肌腱和骨骼各自的ECM，提供了有利于多组织生长的结构仿生环境，使细胞形态和行为与邻近组织高度一致。此外，支架持续释放TGF-β3在促进肌腱-骨骼界面软骨形成方面发挥了关键作用，这通过诱导干细胞募集和软骨分化实现，最终恢复了旋转袖的梯度附着结构及其生物力学强度。总之，这种新型功能性支架在促进RCT修复后的肌腱-骨骼愈合方面表现出显著效果，为肌腱-骨骼界面的组织工程提供了有前景的策略。

作者贡献声明：
李东：正式分析、数据整理。
王一鸣：撰写初稿、可视化、监督、正式分析。
崔晨：方法学、数据整理。
李欢：撰写与编辑、可视化、研究、资金申请、概念化。
李汉文：方法学、正式分析、数据整理。
刘大川：可视化、方法学、研究。
李家英：方法学、研究、概念化。
朱晨旭：方法学、正式分析、数据整理。
于启凡：方法学、正式分析。
方胜：撰写初稿、方法学、研究、资金申请、正式分析、数据整理、概念化。
刘金博：监督、数据整理、概念化。
朱壮：软件开发、方法学、正式分析。
李斌：撰写与编辑、监督、数据整理。
王欢：方法学、研究、数据整理。
陈松：撰写与编辑、监督、资源管理、项目规划、概念化。
韩峰：方法学、研究、正式分析。
王胜浩：方法学、研究、正式分析。
张照凡：方法学、正式分析。