可注射的且具有粘弹性click藻酸盐水凝胶，用于体内时空调控T细胞的释放

《Materials Today Advances》：Injectable and viscoelastic click alginate hydrogels for spatio-temporal T cell administration in vivo

　　乔恩·贝拉萨因（Jone Berasain）| 萨拉·曼萨诺（Sara Manzano）| 奥伊阿内·米克斯莱娜-伊里巴伦（Oihane Mitxelena-Iribarren）| 乌奈·赫拉斯（Unai Heras）| 艾尼奥亚·罗马-瓦莱拉（Ainhoa Romo-Valera）| 佩奥·阿斯科阿加（Peio Azcoaga）| 莱雷·伊图里亚加（Leire Iturriaga）| 莱雷·埃吉亚-门迪库特（Leire Egia-Mendikute）| 阿西斯·帕拉松（Asís Palazón）| 梅塞德斯·费尔南德斯（Mercedes Fernández）| 玛丽亚·M·卡法雷尔（María M. Caffarel）| 罗伯特·阿吉拉萨尔罗贝（Robert Aguirresarobe）| 阿玛亚·西皮特里亚（Amaia Cipitria）

西班牙圣塞巴斯蒂安Biogipuzkoa健康研究所再生与癌症生物工程研究小组

摘要
T细胞疗法在实体瘤中的效果有限，主要原因是T细胞难以穿透肿瘤组织。本研究开发了可注射的粘弹性海藻酸盐水凝胶，用于T细胞的局部和持续释放，旨在改善T细胞的给药、存活率、增殖和体内持久性。使用了氧化海藻酸盐（Alg），并将其与norbornene通过Diels-Alder共价点击交联反应进行功能化。实验中使用了不同浓度的海藻酸盐（1% Alg和2% Alg）。1% Alg水凝胶在完全交联状态下具有更好的注射性能，表现为较低的硬度、较大的孔径、粘弹性行为、较低的注射力以及较高的细胞存活率。体外实验表明，1% Alg水凝胶能够支持T细胞的存活和增殖，并促进持续释放长达10天。通过鸡的羊膜绒毛膜模型研究发现，基于水凝胶的T细胞给药方式相比一次性注射具有更好的局部递送效果、增殖和持久性，其中1% Alg的效果优于2% Alg。此外，在乳腺局部注射的小鼠模型中，1% Alg水凝胶显示出更高的T细胞在乳腺内的持久性和更高的组织整合性能。总之，我们开发出了这种可注射的粘弹性海藻酸盐水凝胶，能够支持T细胞的给药、局部注射、体内存活、增殖和持久性，为T细胞免疫疗法的空间和时间控制提供了新的可能性。

1. 引言
虽然T细胞疗法在血液系统恶性肿瘤中有效消除了循环肿瘤细胞，但在实体瘤中的效果仍受到物理屏障、代谢压力以及免疫抑制细胞和细胞因子的限制，这些因素会损害T细胞的浸润、存活和功能。因此，需要高剂量给药，但这会导致毒性增加。因此，需要寻找替代策略来增强T细胞在体内的局部给药、存活率、增殖和持久性，以延长治疗效果。对T细胞给药进行空间和时间控制可以增加T细胞与肿瘤细胞之间的持续接触，提高治疗效果，并减少高剂量给药所带来的毒性。可注射的水凝胶在T细胞局部给药方面展现出潜力，包括其保持注射细胞的能力、支持细胞功能的能力，以及通过微创技术植入的可能性。然而，目前描述的一些材料是合成的，如Grosskopf和Apple的聚合物纳米粒子水凝胶，或者Lizana-Vasquez和Torres-Lugo的热敏聚合物。这些合成材料的临床转化因不可预测的代谢和降解过程及其降解产物对身体的潜在影响而变得更加复杂。其他天然来源的可注射水凝胶，如甲基丙烯酸明胶（GelMA），则需要光引发剂才能交联，这给临床应用带来了额外的挑战，因为光引发剂及其衍生物可能具有细胞毒性，使用紫外线或可见光进行原位聚合可能会损伤细胞，并引发安全性问题。水凝胶的交联机制（非共价交联或共价交联）对其物理、机械、化学和生物性质起着关键作用，直接影响其是否适合注射和用于细胞治疗。非共价交联的水凝胶依赖于对环境刺激响应的可逆键，具有粘弹性和刺激响应的凝胶化特性，从而实现注射性能。然而，它们在体内往往表现出不稳定性，导致凝胶形成不确定、快速且不受控制的降解以及高爆发性释放。相比之下，共价交联的水凝胶具有稳定的键结构，主要提供弹性特性和长期耐用性，适合更持久的性能。不过，交联过程有时涉及有毒的引发剂或苛刻的反应条件，可能影响生物相容性。为了解决这个问题，最近的研究策略集中在自发的共价交联反应上，如Diels-Alder反应、逆电子需求Diels-Alder（IEDDA）和Schiff碱反应，这些反应还具有自修复性能，允许注射并具有高生物相容性。尽管如此，共价交联材料的降解仍然是临床转化的一个限制。为了解决这个问题，采用了加入基质金属蛋白酶敏感的交联剂、使用甲基丙烯酸化的可降解聚合物，或结合高降解性的生物材料（如明胶）与IEDDA点击化学反应等方法。此外，通过氧化改性天然生物材料也是一种改进其降解性能的策略，但其在注射中的适用性尚未得到证实。为了更好地模仿天然组织，生物材料领域通过在水中引入粘弹性作为水凝胶的基本属性而取得了进展。与纯弹性基质不同，粘弹性材料表现出时间依赖性的应力松弛和变形，这种动态行为能够调节重要的细胞过程，包括扩散、分裂、迁移和分化。特别是在T细胞治疗中，粘弹性至关重要，因为它可以直接调节T细胞的转录谱和激活状态。

2. 材料与方法
2.1. 材料
用于海藻酸盐合成、水凝胶制备和流变学表征的材料包括：
- 低分子量高聚葡萄糖醛酸海藻酸盐（LMW；MW 75 kDa）：Pronova UP VLVG；NovaMatrix，#42000501
- 过氧化钠（99.8%）：Sigma-Aldrich，#311448
- 纱布膜（Spectra/Por 6，MWCO 3.5 kDa）：Spectrum，#11495869
- 氨硼烷（97%）：Sigma-Aldrich，#12352116
- 2-N- morpholino-乙烷磺酸（MES）：Sigma-Aldrich，#E7750
- N-(3-二甲基氨基丙基)-N′-乙基碳二亚胺盐酸盐（EDC）：Sigma-Aldrich，#E6383
- N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）：Sigma-Aldrich，#130672
- 5-正丁烯-2-甲基胺（N）：TCI Chemicals，#N0907
- 3-(对苄氨基)-1,2,4,5-四嗪（T）：Conju-probe，#C6021
- 羟胺（Sigma-Aldrich，#11881405）
- 活性碳（Sigma-Aldrich，#C9157）
- 氧化氘（99.95%）：MagniSlov，#1034280009
- Dulbecco磷酸盐缓冲液（PBS，不含Ca2+和Mg2+，以及酚红）：Gibco?，#14190144
- 矿物油（N350粘度油标准品）：PSL Rheotek，#2700-V12
- 硅化剂：Sigmacote，Sigma-Aldrich，#SL2
- 无菌细胞过滤器：Fisherbrand?，#11587522
- Kimwipe组织纸：Kimberly-Clark，#7552

用于细胞培养和体内实验的材料包括：
- 1 mL注射器：Ico plus，#N15663
- 25G 5/8英寸针头：BD Microlance?，#300600
- L-谷氨酰胺：Gibco?，#25030081
- Pen Strep：Gibco?，#15140122
- pCDH-EF1-Luc2-P2A-tdTomato质粒（Luciferase/tdTomato质粒）：Addgene，#72486
- RPMI-1640：Gibco?，#11879020
- DMEM：Gibco?，#11995065
- pMDLg-pRRE质粒：Addgene，#12251
- pRSV-REV质粒：Addgene，#12253
- Turbofect转染试剂：Thermo Fisher Scientific，#R0531
- Calcein AM：Biomol Bioquest，#ABD-22002
- Etidium Homodimer-1：Sigma-Aldrich，#E1903
- 牛血清白蛋白（BSA）：Sigma-Aldrich，#A7906
- 形态素（PFA）：Sigma-Aldrich，#HT501128
- Triton X-100：Sigma-Aldrich，#HFH10
- Phalloidin 405结合物（PHA）：CruzFluor?，#SC363790
- 4′,6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）：Sigma-Aldrich，#MBD0015
- 24孔Transwell板：Corning，#353097
- IVISbrite? D-Luciferin钾盐：D-luciferin，Revvity，#122799
- Tissue-Tek?最佳切割温度化合物（OCT）：Sakura，#4583
- Harris′hematoxylin（H）：Sigma-Aldrich，#1092530500
- Eosin Y溶液（E）：Sigma-Aldrich，#318906
- Anti-CD3 epsilon抗体：Abcam，#52959
- 山羊正常血清：Invitrogen?，#10189722
- Anti-mouse Alexa Fluor? 647结合物：Cell Signaling Technology，#4410
- ProLong Gold抗褪色剂：Invitrogen?，#P36930

2.2. 改性海藻酸盐的合成
2.2.1. 海藻酸盐的氧化
如前所述，将LMW（< 75 kDa）和高聚葡萄糖醛酸海藻酸盐单体中5%的羟基在去离子水（diH2O）中以1% w/v浓度溶解，并与过氧化钠（NaIO4）反应，反应物摩尔量与待氧化的单体数量相当。反应混合物在室温（RT）下以250 rpm搅拌过夜。然后通过透析纯化，每天更换3次透析液，共3天。最后将纯化的氧化海藻酸盐冻干。

2.2.2. 氧化海藻酸盐的还原
部分氧化的LMW海藻酸盐用氨硼烷进行还原。将聚合物在1% w/v的diH2O中溶解，并与氨硼烷（BH3NH3）反应，反应物摩尔量与待还原的单体数量相当，室温下以250 rpm搅拌16小时。随后进行透析并冻干。

2.2.3. 通过碳二亚胺化学改性海藻酸盐
氧化和还原后的LMW海藻酸盐在MES缓冲液（0.1 M，pH 6.5）中溶解。然后分别向海藻酸盐溶液中加入EDC和NHS，每者摩尔量为5000。让EDC和NHS与海藻酸盐在室温下反应5分钟。为了用norbornene（N）功能团修饰氧化的LMW海藻酸盐骨架，引入的理论取代度（DStheo）为每条海藻酸盐链500个分子。对于四嗪（T）修饰，T的取代度（DStheo）为170。两种反应都在室温下以700 rpm连续搅拌18小时。然后使用羟胺进行淬火。反应溶液先按前述方法进行透析纯化，再用活性碳处理30分钟。最后，溶液进行无菌过滤并冻干。

2.2.4. 改性海藻酸盐的1H NMR表征
为了确认LMW海藻酸盐链的氧化和还原情况，并确定N和T的实际取代度（DSactual），进行了1H NMR分析。样品在1.5% w/v的氧化氘中溶解，每个测量使用Ultra Shield Plus 500 MHz光谱仪进行64次扫描。然后使用MestreNova软件（v12.03）分析光谱。

2.3. 水凝胶制备
冻干的N修饰（N-mod）和T修饰（T-mod）海藻酸盐聚合物分别溶解在PBS中。将溶解的N-mod和T-mod以1.8的norbornene:四嗪（N:T）摩尔比混合，最终海藻酸盐浓度分别为1%和2%（w/v）。将混合溶液注入直径5或8毫米、高2毫米的硅模具中，模具底部和顶部均覆盖有硅化玻璃片。然后将模具放入37°C的培养箱中凝胶化2.5小时。取出模具后获得未注入的圆柱形水凝胶。为了制备可注射的水凝胶，将N-mod和T-mod仔细混合后注入注射器中。经过2.5小时后，组装了一根直径为25微米、长度为5/8英寸的注射针头，以便能够注入水凝胶。2.4. 水凝胶的特性分析 2.4.1. 可降解性评估 通过在37°C的RPMI培养基中，并在CO2环境中孵育，监测水凝胶的湿重和干重变化来评估其可降解性。样品分别放置于预先称量的40纳米孔径的细胞过滤器中，并在每个时间点一起称重。在去除多余液体后，分别在第1天、第3天、第7天、第10天和第28天记录湿重；而在冻干后的第0天、第3天和第10天确定干重。计算时，从总重量中减去每个过滤器的重量。分析中使用了n=3个样本。2.4.2. 流变特性 使用ARES-G2流变仪（TA Instruments）和25毫米圆锥板几何结构（圆锥角为0.04弧度）来表征水凝胶前体溶液和交联水凝胶的流变特性。此外，在周围添加了矿物油以防止水凝胶脱水。分析中，混合了N-mod和T-mod溶液并立即将其滴加入流变仪的底板中。随后，研究了流动行为、交联动力学以及弹性性和粘弹性特性。非交联水凝胶的粘度测量范围为1至10 s-1的剪切率。接下来，在1 Hz的恒定频率下通过时间扫描实验分析交联动力学。一旦水凝胶完全凝胶化，再进行0.1至1 Hz的频率扫描，以确定储能模量（G’）和耗散模量（G”）。最后，通过施加50%的应变并持续5小时来进行应力松弛测试。在同一水凝胶上依次进行时间扫描、频率扫描和应力松弛实验。所有测量均在37°C的温度下进行，并通过应变扫描确认了线性粘弹性条件。数据分析使用了TA Instruments Trios软件（v5.1.1）。通过时间扫描中G'和G"的交叉点来确定凝胶化点。为了获得弹性模量，首先根据Rubber的弹性理论从G’和G”中推导出复合剪切模量（G*）。然后，使用G*值的平均值和泊松比（假设为0.5）来计算弹性模量（E）。网格尺寸是根据先前的描述[55]估算的。最后，通过应力松弛测试中材料松弛到初始模量50%所需的时间来确定应力松弛半衰期（τ1/2）。分析中使用了n=3个样本。2.4.3. 力学特性和可注射性测试 使用配备50 N载荷细胞的Texture Analyzer TA.XTPlus（Stable Micro Systems）进行注射力测量。混合N-mod和T-mod后，立即将其装载到带有25G 5/8英寸注射针头的1 mL注射器中。为了评估交联时间对可注射性的影响并模拟注射过程，在室温（RT）下，以1 mm/s的恒定速率分别在0分钟、15分钟、60分钟和180分钟时压缩活塞。注射力计算为挤出过程中力-位移曲线平台区域的平均力。分析中使用了n=3-4个样本。2.4.4. 通过微计算机断层扫描（μCT）进行3D孔隙率分析 在μCT成像前，将1% Alg和2% Alg样品快速冷冻并过夜冻干。使用配备Hamamatsu Photonics 100/250 X射线源和Hamamatsu C9300 1100万像素相机的SkyScan 1172高分辨率微计算机断层扫描系统对样品进行成像。水凝胶在48 kV的电压和167 μA的电流下进行扫描，未使用额外的光束滤光片。图像以6.85 μm的体素大小获取，并在192.5°的范围内以0.25°的旋转步长逆时针方向采集。最后，使用NRecon（NReconServer v1.7.4）在标准模式下重建横截面图像，然后使用ORS Dragonfly软件（Comet Technologies Canada Inc.，版本2024.1）进行3D体积渲染和分析。分析中使用了n=3个样本。2.5. 可注射水凝胶中T细胞行为和释放动力学的功能评估 2.5.1. T细胞系 Jurkat细胞系作为T淋巴细胞的模型进行培养。为了跟踪细胞，生成了Luciferase/tdTomato报告基因的Jurkat细胞系（Jurkat-TOM）。简而言之，为了产生慢病毒，HEK-293T细胞与标准包装质粒和包膜质粒以及由马德里“Alberto Sols”生物医学研究所（IIBm-CSIC）的Cancer Stem Cells and Fibroinflammatory Microenvironment小组提供的Luciferase/tdTomato表达载体共转染。24小时后，收集病毒上清液并通过0.45 μm过滤器过滤后用于转染Jurkat细胞。48小时后，使用H800S细胞分选仪（SONY）验证Jurkat-TOM细胞系的转染和分选是否成功。Jurkat和Jurkat-TOM细胞系在添加了10% v/v胎牛血清、1% L-谷氨酰胺和1% Pen Strep的RPMI-1640培养基中培养。对于HEK-293T细胞，使用相同补充剂的DMEM培养基。细胞在37°C的5% CO2环境中孵育。当Jurkat细胞达到1·106细胞/mL的汇合度时进行传代，HEK-293T细胞达到70%的汇合度时进行传代。根据已建立的T细胞输送水凝胶协议[56]，选择1·106细胞/mL的密度用于水凝胶封装。2.5.2. T细胞封装和可注射性 接下来，评估了含有T细胞的1% Alg和2% Alg的水凝胶的可注射性以及注射后T细胞的存活情况。通过将Jurkat细胞悬浮液加入RPMI 1640培养基中，然后与T-mod藻酸盐混合，最终浓度为1·106细胞/mL，将T细胞封装在水凝胶中。混合后，在0分钟、15分钟、60分钟和180分钟时，分别通过25G 5/8英寸注射针头将50 μL水凝胶注入含有1:2000 Calcein AM和1:1000 ethidium homodimer-1的Live/Dead染色溶液中。在室温（RT）下黑暗环境中孵育15分钟后，使用Axio Observer 7倒置荧光显微镜（Carl Zeiss Microscopy）拍摄图像。每个水凝胶获取100 μm的z-stack，步长为15 μm。然后使用Dragonfly软件（版本2022.2，Comet Technologies Canada Inc.，网站：https://dragonfly.comet.tech/）将z-stack折叠为2D最大投影图像进行量化。细胞活力通过计算活细胞与总细胞（活细胞和死细胞之和）的百分比来确定。分析中使用了n=3-4个样本。使用的Dragonfly模型可在此处找到：https://github.com/CipitriaLab/ORSDragonfly_Live-Dead-ininjectability-in-2D-projections.git。2.5.3. T细胞活力、增殖和形态 为了评估1% Alg和2% Alg用于T细胞输送的适用性，Jurkat细胞（1·106细胞/mL）被封装并培养10天。在第1天、第3天、第7天和第10天，使用Live/Dead和DAPI/PHA染色方法评估细胞活力和生长。将水凝胶放入含有calcein（1:2000）和ethidium homodimer-1（1:1000）的Live/dead溶液中以区分活细胞和死细胞。在室温（RT）下黑暗环境中孵育15分钟后，使用荧光显微镜拍摄图像。为了评估细胞形态和增殖，首先在室温（RT）下使用4% PFA固定水凝胶30分钟。然后，用3% BSA在PBS中洗涤两次。接着使用0.3% Triton X-100进行细胞膜通透化处理，并在室温（RT）下放置10分钟。去除Triton X-100并用3% BSA再次洗涤后，加入PHA（1:40）并在4°C的黑暗环境中孵育过夜。最后，用3% BSA和DAPI（1:1000）再次洗涤，并在室温（RT）下孵育30分钟。之后将水凝胶放入PBS中，使用LSM900共聚焦显微镜（Carl Zeiss Microscopy）进行成像。对于Live/Dead和DAPI/PHA染色成像，每个水凝胶在两个位置获取50 μm的z-stack，每组n=3个水凝胶。如前所述，将z-stack折叠为2D最大投影图像以量化细胞活力，即通过活细胞与总细胞（活细胞和死细胞之和）的比例进行计数，使用荧光显微镜成像。由于7天后形成了密集的细胞簇，通过从总细胞数中减去DAPI/PHA染色中识别的死细胞数量来确定活细胞数量。使用的Dragonfly模型可在此处找到：https://github.com/CipitriaLab/ORSDragonfly_Nuclei-counting-in-2D-projections.git，https://github.com/CipitriaLab/ORSDragonfly_Live-Dead-cell-proliferation-in-2D-projections.git。2.5.4. T细胞释放动力学 为了评估1% Alg和2% Alg随时间的T细胞释放动力学，首先将Jurkat细胞（1·106细胞/mL）封装并在其中培养10天。在第1天、第3天、第7天和第10天，使用Live/Dead和DAPI/PHA染色方法评估细胞活力和生长。将水凝胶放入含有calcein（1:2000）和ethidium homodimer-1（1:1000）的Live/dead溶液中以识别活细胞和死细胞。在室温（RT）下黑暗环境中孵育15分钟后，使用荧光显微镜拍摄图像。为了评估细胞形态和增殖，首先在室温（RT）下使用4% PFA固定水凝胶30分钟。然后，用3% BSA洗涤两次。接着使用0.3% Triton X-100进行细胞膜通透化处理，并在室温（RT）下的摇床中放置10分钟。去除Triton X-100并用3% BSA再次洗涤后，加入PHA（1:40）并在4°C的黑暗环境中孵育过夜。最后，用3% BSA和DAPI（1:1000）再次洗涤，并在室温（RT）下孵育30分钟。然后使用LSM900共聚焦显微镜（Carl Zeiss Microscopy）进行成像。对于Live/Dead和DAPI/PHA染色成像，每个水凝胶在两个位置获取50 μm的z-stack，每组n=3个水凝胶。如前所述，将z-stack折叠为2D最大投影图像以量化细胞活力。由于7天后形成了密集的细胞簇，通过从DAPI/PHA染色中识别的总细胞数中减去死细胞数量来确定活细胞数量。使用的Dragonfly模型可在此处找到：https://github.com/CipitriaLab/ORSDragonfly_Nuclei-counting-in-2D-projections.git，https://github.com/CipitriaLab/ORSDragonfly_Live-Dead-cell-proliferation-in-2D-projections.git。2.5.5. 通过细胞因子释放分析评估封装T细胞的功能表型 将Jurkat细胞（1·106细胞/mL）封装并在其中培养10天，使用2D培养的T细胞作为功能对照。在第1天和第10天收集来自封装组和2D对照组的条件培养基，快速冷冻并储存在-80°C以供后续分析。使用Olink? Target 48 Human Cytokine panel（Olink Proteomics）定量IL-2和IFN-γ的分泌，该工具利用邻近延伸测定（PEA）技术。在PEA中，与独特DNA寡核苷酸偶联的抗体对接近其目标蛋白质结合，从而实现杂交并延伸形成独特的DNA报告序列。随后通过实时qPCR放大和量化该报告序列，从而能够从少量样本中实现高度特异性和敏感的多路检测。该分析由COBIOMIC Bioscience平台（西班牙）根据制造商的说明进行。蛋白质浓度以绝对单位（pg/mL）报告，基于内部校准标准。分析中使用了n=3个样本。2.6. 使用体内CAM模型进行T细胞的时空给药 2.6.1. 卵子准备和水凝胶注射 从Granja Santa Isabel（西班牙）购买的受精1天的卵子，在37.5°C的55%湿润环境中垂直孵育10天，使用Ovation 56 Ex培养箱（Brinsea）并每45分钟旋转一次。如先前的描述[57]、[58]，在第10天，在卵子底部的空气室中钻孔，然后在上部感兴趣的位置再钻一个孔，并用移液填充器抽真空。在上方第二个孔周围打开了一个窗口片段，以便访问CAM。Jurkat-TOM细胞按照先前的描述被封装在1%藻酸盐和2%藻酸盐中，并装载到1毫升注射器中。将50微升含有T细胞的凝胶通过25G 5/8英寸的针头注入CAM，最好是在靠近血管的位置，深度为2毫米。作为阴性对照，同样密度和体积的Jurkat-TOM细胞被直接注入RPMI培养基中。最后，用封口膜封闭CAM上方的窗口，然后将卵继续在相同的环境条件下培养最多7天，但不进行旋转。

2.6.2. 卵的打开与IVIS成像
为了评估水凝胶的局部T细胞释放和保留能力，使用IVIS Lumina XRMS Series III（Perkin Elmer）通过追踪荧光素酶表达来测量近端CAM中的Jurkat-TOM细胞数量，持续7天。首先完全打开窗口，在水凝胶上加入150微升D-荧光素（30毫克/毫升），然后在黑暗中培养10分钟再进行成像。信号量以感兴趣区域内的总光子通量（每秒）和信号面积来表示。分析时使用了n=4-6个样本。

2.7. 使用体内小鼠模型进行时空T细胞释放
2.7.1. 小鼠中的水凝胶注射
还利用小鼠模型研究了使用1%藻酸盐的T细胞的体内局部持久性，并将其与直接注射进行比较。所有实验均按照欧洲法规进行，并获得了Biogipuzkoa动物实验委员会和Gipuzkoa地区政府的批准（伦理识别代码：PRO-AE-SS-341）。
Jurkat-TOM细胞被封装在1%藻酸盐和RPMI培养基中（1-10^6细胞/毫升）。在第0天，5-7周大的雌性B-NDG小鼠（Inovit）用3-5%异氟烷和1-2升/分钟的氧气麻醉，并在后续操作中保持1-3%异氟烷和0.5-1升/分钟的氧气。使用25G 5/8英寸的针头将1%藻酸盐或培养基注射到右侧第四乳腺中。对于1%藻酸盐组和直接注射组，每组使用了n=9只小鼠，并观察了7天。

2.7.2. 体内IVIS成像
通过生物发光（BLI）成像技术使用IVIS监测荧光素酶活性，持续7天。腹膜内注射D-荧光素（150毫克/千克溶于PBS），10分钟后用异氟烷麻醉小鼠进行成像。信号量以感兴趣区域内的总通量（每秒）来表示。感兴趣区域被定义为注射区周围的圆形框。在第1、2、4和7天进行了纵向活体动物成像。

2.7.3. 体外IVIS成像
在第7天，为了对注射的乳腺进行体外成像，在处死前腹膜内注射D-荧光素（150毫克/千克溶于PBS）。15分钟后处死小鼠并解剖器官。取出注射过的乳腺，放在含有D-荧光素（1毫克/毫升溶于PBS）的板上，并使用IVIS进行成像，如前所述。

2.7.4. 组织学分析
为了进行组织学和免疫荧光分析，从每组随机选择的6只小鼠中收集乳腺样本，并在OCT中快速冷冻。使用Leica Microsystems的CM1950冷冻切片机在-35°C条件下获得25微米厚的冷冻切片。按照标准协议用H&E染色切片，以评估乳腺组织的状态和水凝胶的整合情况。

2.8. 统计分析
所有实验均使用了n=3-9个样本。统计分析使用GraphPad Prism 10软件（GraphPad Software Inc.）进行。首先使用Shapiro-Wilk检验评估每个分布的正态性。对于正态分布的数据，使用ANOVA和t检验进行统计比较。条形图表示平均值±标准差。对于非正态分布的数据，使用Kruskal-Wallis和Mann-Whitney检验进行分析。在比较配对数据时，使用Friedman检验。箱形图显示了图表中的中位数（线）、第一和第三四分位数（箱）以及最小和最大值（须）。在所有比较中，p值小于0.05被视为具有统计学意义。在图形插图中，*表示在每个实验组内0分钟与其他时间点之间的统计学上显著的比较（1%藻酸盐、2%藻酸盐或培养基），而#表示同一时间点不同实验组之间的差异（1%藻酸盐 vs 2%藻酸盐 vs 培养基）（* p < 0.05, ** p < 0.01, *** p < 0.001）。

3. 结果
3.1. 可降解藻酸盐的功能化实现了IEDDA点击交联
为了将低分子量藻酸盐转化为可降解聚合物，藻酸盐被氧化。具体来说，使用过氧化钠氧化了藻酸盐主链中5%的羟基，这一过程将尿酸残基转化为能够水解的开链结构，如先前的报道[39]、[59]所述。然后，使用氨硼烷还原醛基，以避免与点击反应片段发生反应。通过1H NMR分析确认了氧化和还原反应（补充图S1 A）。
氧化后的低分子量藻酸盐随后通过 carbodiimide 化学方法用N和T基团进行功能化，DStheo分别为500和170。两种不同批次的改性藻酸盐的修改效率通过1H NMR光谱和DSactual得到验证，见补充图S1 B、C；补充表S1。这些值用于保持所需的最终聚合物浓度的N:T比率为1.8:1。交联反应的化学示意图见补充图S2。为了调节机械性能、注射性和细胞释放曲线，制备了最终藻酸盐浓度为1%（重量/体积）和2%的水凝胶。从这一点开始，样品将分别称为“1%藻酸盐”和“2%藻酸盐”。

3.2. 点击藻酸盐水凝胶的粘度、交联动力学、硬度、粘弹性和孔隙率可以通过浓度进行调整
为了对1%藻酸盐和2%藻酸盐进行流变学表征，进行了粘度曲线、时间扫描、频率扫描和应力松弛测试，以评估水凝胶的粘度、交联动力学、硬度和粘弹性。通过应变扫描测试确保了线性粘弹性条件（补充图S3）。粘度曲线显示，在交联之前，1%藻酸盐和2%藻酸盐的粘度都非常低（<10 Pa·s）（图1 A），其中1%藻酸盐的粘度低于2%藻酸盐。虽然1%藻酸盐表现出牛顿行为，但2%藻酸盐的粘度随剪切作用降低，伴随有凝胶化的视觉迹象，这是由于交联速度更快所致。

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图1. 1%藻酸盐（洋红色）和2%藻酸盐（蓝色）的流变学和特性。流动曲线（A）、1%藻酸盐（B）和2%藻酸盐（C）的时间扫描、频率扫描（D）、弹性模量（E）、网孔大小（F）、应力松弛曲线（G）、应力松弛时间τ1/2（H）、1%藻酸盐（I）和2%藻酸盐（J）的μCT图像、孔隙率（K）和孔隙体积（L）。条形图表示平均值±标准差，n=3每组。1%藻酸盐和2%藻酸盐之间的比较使用t检验进行。统计显著的差异用#表示。
时间扫描分析显示了G’和G’’随时间的演变（图1 B、C）。最初，1%藻酸盐和2%藻酸盐的G’’值都高于G’，表明材料在交联前的液态行为。凝胶化点在这里定义为G'和G''的交叉点，在1%藻酸盐中出现在2%藻酸盐之后的约40分钟和15分钟（图1 B、C）。当G’达到平台期时，确认完全交联，表明水凝胶已经完全交联，1%藻酸盐的G’为13 Pa，低于2%藻酸盐的184 Pa（图1 B、C）。随后的频率扫描分析确认了材料的凝胶状行为，因为G'和G''与频率无关（图1 D）。此外，频率扫描中的G'和G''值与时间扫描中的观察结果一致。
此外，由于弹性模量（E）是从G'和G''计算得出的，1%藻酸盐的硬度显著较低（39 ± 7 Pa），而2%藻酸盐的硬度为553 ± 117 Pa（图1 E）。接下来，基于G’值估算了水凝胶的网孔大小，1%藻酸盐的结果（91.36 ± 3.11 nm）显著高于2%藻酸盐的35.66 ± 2.67 nm（图1 F），表明其网孔更开放且孔隙率更高（图1 F）。应力松弛测试显示1%藻酸盐在2小时内 normalize 模量降低了50%，而2%藻酸盐即使在5小时后也没有显著放松（图1 G、H）。μCT用于定量分析冻干水凝胶的物理和结构特性（图1I-L，补充图S4）。1%藻酸盐的孔隙率显著高于2%藻酸盐（65.55 ± 4.80% vs 53.70 ± 2.10%）（图1 K）。此外，1%藻酸盐的中位孔隙体积（2.17 x 10^-5 ± 2.81·10^-6 mm^3）显著高于2%藻酸盐的1.44 x 10^-6 ± 9.8·10^-7 mm^3（图1 L）。通过支架高度上孔隙率的均匀分布证明了组成的均匀性和交联的一致性（补充图S4）。特别是，在冻干水凝胶的顶部、中部和底部700微米切片之间没有发现统计学上的孔隙率差异（补充图S4 C）。关于冻干水凝胶的孔径分布，两种水凝胶之间也没有观察到统计学差异（补充图S4 D）。最后，通过28天内初始质量损失约90%来确认水凝胶的可降解性（补充图S5 A）。此外，在3天后观察到1%藻酸盐的干重显著下降（补充图S5 B）。

3.3. 最佳的注射性特征是低注射力和高细胞存活率
3.3.1. 点击藻酸盐水凝胶的机械性能和注射性测试
为了机械评估注射性和临床注射的适用性，测量了1%藻酸盐和2%藻酸盐在凝胶化过程中的注射力。注射力计算为挤压过程中力-位移曲线平台区域的平均值（补充图S6）。在凝胶化过程开始时，1%藻酸盐和2%藻酸盐都需要最小的注射力，分别为0.31 ± 0.04 N和0.43 ± 0.21 N（图2 A）。15分钟后，2%藻酸盐的注射力较高，尽管没有统计学意义。这种增加与凝胶化点一致，这从时间扫描中G′和G″的交叉可以看出。相比之下，1%藻酸盐的值基本保持不变（0.43 ± 0.14 N），与较慢的凝胶化动力学和较晚的凝胶化点相符。随着更多交联的形成，2%藻酸盐在60分钟、120分钟和180分钟时的注射力分别显著增加，为9.91 ± 1.33 N、8.85 ± 0.91 N和11.55 ± 3.84 N。然而，1%藻酸盐仅在完全交联后的180分钟时显示出统计学上更高的值，达到2.25 ± 0.84 N。在此之前，60分钟和120分钟时的值与0分钟时没有统计学差异，分别为0.82 ± 0.59 N和1.79 ± 1.92 N。比较1% alginate和2% alginate的注射力时，从15分钟开始，2% alginate的注射力在统计上显著高于1% alginate（图2 A）。下载：下载高分辨率图像（828KB）下载：下载全尺寸图像。图2显示了1% alginate（洋红色）和2% alginate（蓝色）的注射性能测试结果，包括注射力分析（A）、注射后的水凝胶形态（B）、注射后的T细胞存活率（C）以及活细胞/死细胞染色图像（D）。箱形图表显示了中位数、第一和第三四分位数以及最小值和最大值；每组n=3-4。1% alginate与2% alginate之间的比较使用了Mann-Whitney检验。统计学上的显著差异用#表示。在同一组内，随时间变化的比较分别使用Mann-Whitney检验（A）和Friedman检验（C）进行，显著差异用*表示。

在外观和实际注射性能方面，两种凝胶在液态时都表现出很少的阻力，易于注射（图2 B）。但由于2% alginate在15分钟时发生了交联，因此需要更大的注射力，并且阻力较大。此外，图像显示其质地较为粗糙（图2 B）。相比之下，无论是否发生凝胶化，1% alginate在180分钟之前都易于注射，且质地较为光滑（图2 B）。这些结果与流变学分析一致（图1）：2% alginate由于交联速度更快、硬度更高且具有弹性，导致质地粗糙；而1% alginate由于交联速度较慢、硬度较低且具有粘弹性，因此质地更光滑，注射也更容易。

3.3.2 海藻酸水凝胶注射后细胞封装和存活情况
在机械评估了注射性能之后，分析了注射对T细胞存活率的影响，以评估水凝胶注射细胞的 suitable 性。在N-mod和T-mod混合后立即注射水凝胶，结果显示1% alginate和2% alginate的T细胞存活率都很高，分别为93.32 ± 5.18%和94.51 ± 2.19%（图2 C, D）。此外，在15分钟时，两种alginate的细胞存活率均没有显著下降。然而，从60分钟开始，2% alginate的细胞存活率相比0分钟时有所下降，分别为77.74 ± 1.78%、67.15 ± 2.18%和63.53 ± 9.31%。相比之下，1% alginate在所有时间点的细胞存活率都较高，分别为96.81 ± 1.05%、83.48 ± 11.09%和74.44 ± 15.11%（图2 C, D）。尽管差异在统计上不显著（图2 C, D），但在所有时间点1% alginate的细胞存活率始终高于2% alginate。

3.4 点击海藻酸水凝胶能够促进T细胞增殖并实现高细胞释放，同时维持细胞表型
3.4.1 点击海藻酸水凝胶中的T细胞存活率和增殖
为了评估1% alginate和2% alginate中的细胞存活率、增殖和形态，将Jurkat T细胞封装在未注射的圆柱形水凝胶中并培养10天。在第1天、第3天、第7天和第10天进行了活细胞/死细胞和DAPI/PHA染色，以量化细胞存活率、增殖和形态。活细胞/死细胞染色显示，两种alginate在10天内均保持了高细胞存活率（补充图S7）。此外，从第3天开始，两种alginate中的细胞数量都有显著增加（图3 A）。值得注意的是，从第3天开始，1% alginate中的T细胞增殖显著高于2% alginate（图3 A）。3D共聚焦图像的最大投影也显示了这一趋势，两种水凝胶之间的细胞形态和组织结构存在明显差异（图3 B）。DAPI/PHA染色显示，2% alginate中形成了紧凑的球形细胞簇，而1% alginate中则形成了分散的较大细胞聚集体（图3 B）。

3.4.2 点击海藻酸水凝胶促进T细胞释放
为了分析这些水凝胶中的细胞释放情况，将50 μL的水凝胶注入Transwell中并培养10天。在第1天、第3天、第7天和第10天，计算了培养基中的细胞数量。为了直观评估释放情况，将Jurkat-TOM细胞封装在未注射的圆柱形凝胶中并在孔板中培养，不使用Transwell系统。在相同的时间点，通过荧光成像观察了Jurkat-TOM细胞的释放情况。两种水凝胶都表现出将活细胞释放到培养基中的能力（图3 C, D）。在第3天时，两种alginate中的释放细胞数量均有增加，尤其是在1% alginate中（图3 C）。从第7天开始，两种alginate中的释放细胞数量显著增加（图3 C）。荧光图像进一步证实了这一点，显示出1% alginate中的Jurkat-TOM细胞数量随时间显著增加（图3 D）。

3.4.3 基于细胞因子分泌分析的T细胞功能表型
为了评估封装后的T细胞功能完整性，在10天内监测了T细胞的细胞因子分泌情况。具体而言，量化了1% alginate中的IL-2和IFN-γ分泌水平，并与标准2D培养进行了比较。分析显示，封装后的T细胞与2D培养中的细胞在细胞因子分泌方面没有显著差异，表明1% alginate完全保留了T细胞的功能（补充图S8）。此外，这种功能状态随时间保持稳定，因为从第1天到第10天细胞因子分泌量没有显著变化（补充图S8）。

3.5 点击海藻酸水凝胶改善T细胞在体内的给药和持久性
3.5.1 在体内CAM模型中使用点击海藻酸水凝胶进行T细胞给药和局部持久性
在体内CAM模型中，通过IVIS的BLI分析评估了T细胞的输送和时空持久性。Jurkat-TOM细胞被封装在1% alginate和2% alginate中，并在 proximal CAM中注射。鸡胚胎在水凝胶注射后能够继续发育。在处死前，注射部位附近的CAM区域显示1% alginate和2% alginate水凝胶周围有血管，表明其具有生物相容性和正确的组织整合（图4 A）。BLI结果显示，两种alginate均支持T细胞的存活和增殖，如与第0天相比总通量的增加所示（图4 B）。然而，只有1% alginate在7天时的增加在统计上显著（图4 B），而2% alginate则没有。值得注意的是，从第3天开始，在接受批量注射的鸡蛋中未检测到BLI信号（图4 B，补充图S9）。考虑到这些结果及体外实验结果，选择了1% alginate用于体内小鼠模型。

3.5.2 在小鼠模型中使用点击海藻酸水凝胶进行T细胞给药和局部持久性
为了评估T细胞在小鼠模型中的移植效果和时空持久性，将Jurkat-TOM细胞封装在1% alginate中或培养基中，并注射到第四个乳腺中。通过体内和体外IVIS成像评估了目标器官中的T细胞持久性。组织学和免疫荧光分析评估了水凝胶的整合情况以及T细胞的检测情况。在第1天，培养基和1% alginate中的BLI信号相似，但从第4天开始，使用培养基的组中的信号显著降低（图5 A, B）。在7天时，1% alginate组的信号强度仍可检测到，并且局限于注射部位；而在接受批量注射的组中，信号几乎不可检测（补充图S10）。宰杀后对乳腺切除组织的体外IVIS成像证实了这些结果，只有注射了1% alginate的乳腺中检测到BLI信号（图5 C, D；补充图S11）。

进一步使用CD3免疫荧光染色确认了乳腺中的T细胞（图5 E）。注射的T细胞仅在使用了1%海藻酸盐作为注射方法的情况下在乳腺中被检测到（图5 E2），而在仅通过培养基接受T细胞的小鼠中则未检测到T细胞（图5 E1）。使用H&E染色的注射乳腺组织学分析（图5 F）也显示1%海藻酸盐成功整合到了乳腺组织中，并观察到细胞和组织通过水凝胶的渗透（图5 F2）。4. 讨论在本研究中，我们开发了可注射的、具有粘弹性的点击海藻酸盐水凝胶，利用低分子量氧化海藻酸盐并通过自发的IEDDA反应实现N:T点击交联，以提高T细胞疗法的局部递送效果和效力，从而优于一次性注射给药。这一平台解决了许多现有生物材料的局限性，这些材料通常依赖于刚性结构、合成性质或外部触发因素（如紫外线和光敏剂），这些因素阻碍了临床应用[18]、[21]、[22]。通过调整海藻酸盐聚合物浓度和N:T交联的比例，我们制备出了一种柔软、粘弹性且可降解的基质，即使在完全交联后仍然可注射，具有良好的生物相容性和临床相关性[39]、[60]。这些特性保护了T细胞的活力和表型，同时增强了它们的增殖并改善了在体内的时空递送。这项工作不同于那些专注于刚性材料的设计，为临床可注射的T细胞给药装置开辟了一条新途径，提出了柔软而稳定的可注射水凝胶。最近的研究将“易于注射”的水凝胶定义为需要小于12牛顿的手动力（使用5毫升注射器和19 G或31 G的针头，以0.2毫米/秒的速度）[61]。在本研究中，注射性分析表明1%海藻酸盐所需的注射力明显低于2%海藻酸盐，始终低于12牛顿的临床阈值。这意味着所有临床医生都可以轻松使用1%海藻酸盐进行注射，无论年龄或性别[61]。虽然共价网络中的注射性通常通过动态键或原位凝胶化实现[28]、[62]、[63]、[64]，但我们的结果表明，1%海藻酸盐较软、交联较少的结构即使在完全交联状态下也能在剪切条件下促进流动，从而减少了阻力。剪切力尤其重要，因为它们可能在针头抽出过程中对细胞造成损伤，影响细胞活力，而细胞活力对于给药后的治疗效果至关重要[65]、[66]、[67]。此外，较低的海藻酸盐浓度以及随之减少的交联反应减少了过程中的N2气体生成，保持了注射后的高细胞活力[68]。这体现在注射后细胞活力的分析中，1%海藻酸盐组的细胞活力保持在75%以上，而2%海藻酸盐组下降到63%。关键的是，未注射的圆柱形水凝胶在整个10天研究期间都显示出高细胞活力，证实水凝胶本身具有细胞相容性，术后观察到的细胞死亡主要是由剪切应力而非材料毒性引起的。流变学特性确认聚合物浓度显著影响交联动力学和粘弹性。1%海藻酸盐较低的浓度导致结构更柔软、更多孔隙和更具渗透性，从而增加了营养物质的扩散、细胞增殖和迁移，相比2%海藻酸盐[69]、[70]。一些2D研究表明较硬的基底可以促进T细胞增殖和IL-2分泌[71]、[72]，但这些发现与3D环境不同[73]。一项使用纳米纹理弹性平台的研究表明，T细胞主要通过变形虫样迁移移动，其特征是圆形形态[74]、[75]。Weiden等人使用聚异氰酸肽水凝胶（即将软水凝胶的模量定为30 Pa，硬水凝胶的模量定为400 Pa），并发现随着硬度的增加，T细胞的迁移能力实际上会降低，这是由于孔径变小和物理限制[76]。这些结果与我们的观察一致，表明2%海藻酸盐较小的孔径和较高的硬度可能会阻碍T细胞的释放，反而导致T细胞在水凝胶内聚集。此外，在1%海藻酸盐中，早在第1天就观察到细胞存在于水凝胶外部（图3），即使在基质显著降解之前（补充图S5）。这表明1%海藻酸盐中的T细胞释放是由流变学特性和孔隙性共同促进的主动迁移，并进一步受到水凝胶降解的增强[10]。基质的粘弹性不仅调节单个细胞的行为，还调节它们的集体行为，反映了细胞如何通过动态过程与ECM相互作用，这些过程的时间尺度从几毫秒到几小时不等[27]、[40]、[77]、[78]。1%海藻酸盐在10^3-10^4秒内表现出粘性松弛，这个时间尺度明显长于离子交联海藻酸盐（10^-10^1秒）和大多数天然软组织[27]、[79]。尽管本研究中刚度和粘弹性没有分离，但据报道我们范围内的应力松弛率对各种细胞类型有不同的影响，这表明它们也可能影响T细胞的反应。例如，Roth等人描述的类似我们的τ1/2值表明，“快速松弛”的基质（τ1/2 = 10^4秒）比缓慢松弛的系统（τ1/2 = 10^5秒）更能促进神经突起的生长和分化[43]。此外，Morgan等人观察到10^4到10^5秒的松弛时间决定了细胞骨架的组织[77]。在免疫细胞中，τ1/2为10^3秒的缓慢松弛基质有利于促炎单核细胞的极化，而快速松弛则保持未成熟的表型[80]。具体到T细胞反应，基质刚度和粘弹性都对它们的激活、功能和分化起着关键作用[48]、[49]、[50]。最近，Jeffreys等人证明结合刚度和应力松弛对谱系偏移有显著影响。他们的研究表明，软粘性（G' = 400 Pa，τ1/2 = 10秒）和软弹性（G' = 400 Pa，τ1/2 = 100秒）的基质在7天时显著驱动T细胞的谱系分化。相比之下，硬弹性基质（G' = 1000 Pa，τ1/2 = 100秒）支持髓系谱系的发展，强调了这些机械信号在T细胞分化中的协同作用。另一项比较弹性微球和粘弹性微球的研究表明，后者能更有效地激活T细胞[48]。此外，据报道ECM的粘弹性调节T细胞的转录谱，其中缓慢松弛的基质（τ1/2 = 10^3 - 10^4秒）增强激活标志物，而快速松弛的基质（τ1/2 = 1 - 10秒）促进记忆标志物的表达。1%海藻酸盐中的最高增殖表明其特定的应力松弛特性可能有助于更好地激活T细胞，促进其增殖和迁移，同时保持功能完整性[83]。总的来说，这些发现强调了将粘弹性特性纳入基质以驱动T细胞增殖和释放的重要性。遵循Adu-Berchie等人建立的协议[81]，我们7天的监测期足以证明使用1%海藻酸盐水凝胶相比传统的一次性注射可以改善T细胞的局部保留和持久性，同时遵守伦理动物福利“精炼”原则。将这种水凝胶与某些可植入系统进行比较，海藻酸盐基质已与功能化二氧化硅微粒结合使用，以递送T细胞长达12天[82]，而患者来源的冻干淋巴结可以实现长达24天的持续释放[83]。尽管这些平台有效，但它们需要手术放置。相比之下，1%海藻酸盐水凝胶提供了一种侵入性较小的替代方案，因为它可以通过注射器注射。另外，原位形成的壳聚糖水凝胶可以在14天内递送T细胞[84]，但在体内的凝胶化动力学方面可能存在挑战。我们预先制备但可注射的1%海藻酸盐提供了一种更稳健且可预测的材料。朝着更复杂架构的发展，协同原位疫苗增强T细胞库（SIVET）在局部递送T细胞的同时招募宿主细胞[81]。虽然SIVET是一个复杂的多功能系统，但它依赖于大孔隙结构和多种招募因素来促进T细胞运动。同样，粘弹性对这些大孔隙透明质酸（HA）支架中T细胞运动的机械贡献尚不明确；因此，T细胞迁移受到固定孔隙架构的限制。相比之下，1%海藻酸盐通过其柔软的基质和固有的粘弹性实现了T细胞的移动。此外，虽然微针贴片适用于表面应用[85]，但可注射水凝胶在到达难以到达的区域时具有更大的灵活性。作为下一步，验证这种水凝胶在更复杂的生理环境中进行时空T细胞免疫治疗的有效性是必不可少的。总之，我们开发了使用低分子量氧化海藻酸盐和自发N:T点击交联的可注射粘弹性点击海藻酸盐水凝胶。1%海藻酸盐水凝胶柔软、粘弹性、可降解，重要的是即使在完全交联后仍然可注射，且不会损害封装的T细胞的活力。我们证明1%海藻酸盐水凝胶作为T细胞储存库，增强了T细胞的给药、存活、增殖、局部持久性和体内长时间释放。通过与一次性注射相比，这种可注射水凝胶提高了T细胞疗法的局部递送效果和效力，未来可能在局部体内递送T细胞免疫治疗中得到应用。红色列作者贡献声明María Caffarel：写作 – 审阅与编辑、验证、资源、方法学、资金获取。Robert Aguirresarobe：写作 – 审阅与编辑、验证、监督、资源、项目管理、方法学。Asís Palazón：写作 – 审阅与编辑、验证、资源、资金获取。Mercedes Fernandez：写作 – 审阅与编辑、方法学。Ainhoa Romo-Valera：写作 – 审阅与编辑、研究。Leire Egia-Mendikute：写作 – 审阅与编辑、验证、方法学。Leire Iturriaga：写作 – 审阅与编辑、研究。Oihane Mitxelena-Iribarren：写作 – 审阅与编辑、软件、数据管理。Peio Azcoaga：研究、方法学、写作 – 审阅与编辑。Sara Manzano：写作 – 审阅与编辑、方法学、研究。Unai Heras：写作 – 审阅与编辑、软件、数据管理。Amaia Cipitria：写作 – 审阅与编辑、原始稿件撰写、验证、监督、资源、项目管理、方法学、资金获取、概念化。Jone Berasain：写作 – 审阅与编辑、原始稿件撰写、可视化、验证、软件、方法学、研究、资金获取、形式分析、数据管理、概念化。利益冲突声明作者声明没有相互竞争的财务利益数据可用性所有原始和处理数据以及使用的Dragonfly模型都可在公开可访问的Zenodo存储库中找到：https://doi.org/10.5281/zenodo.16961174。此外，Dragonfly模型也可在GitHub上找到，链接在方法部分提供。7. 资金来源J.B、U.H和A.R.V感谢Hezkuntza Saila、Eusko Jaurlaritza提供的资助（分别为PRE_2024_2_0062、PRE_2024_2_0005和PRE_2024_2_0009）。S.M.获得了Carlos III健康研究所（ISCIII）的Sara Borrell奖学金（CD23/00059）的资助，并得到了欧盟的共同资助。O.M.I.获得了西班牙抗癌科学协会基金会（POSTD234723MITX）的博士后奖学金。M.M.C感谢西班牙科学与创新部（CNS2023-145020）和ISCIII（PI21/01208）的资助，并得到了欧盟的共同资助。R.A感谢María de Maeztu Excellence Unit CEX2023-001303-M（由MCIN/AEI/10.13039/501100011033资助）、Hezkuntza Saila（IT1503-22资助）和Osasun Saila（Eusko Jaurlaritza，资助号2024333015）的资助。A.C.、A.P和M.M.C感谢Osasun Saila（资助号CART-gel 2022333036；CART-gel - II，2023333027；CART-gel - III，2024333001）和IKERBASQUE巴斯克科学基金会的资助。A.C.还感谢西班牙抗癌科学协会基金会（LABAE223466CIPI）、西班牙科学与创新部（MCIN/AEI/10.13039/501100011033/FEDER UE，资助号PID2021-123013OB-I00）以及欧洲研究委员会Consolidator Grant（DORMATRIX，101123883）的资助。