一种仿生纳米平台能够实现shTHY1介导的免疫调节和软骨重塑，从而用于治疗骨关节炎

《Materials Today Advances》：A biomimetic nanoplatform enables shTHY1-mediated immunomodulation and cartilage remodeling for osteoarthritis therapy

　　沈月胡 | 庄莉 | 李小菲 | 张 Lingxiao | 张雅卿
上海交通大学医学院附属新华医院小儿骨科，上海，中华人民共和国

**摘要**
骨关节炎（OA）的特征是存在慢性炎症微环境，伴随着活性氧（ROS）的增加、滑膜免疫失调以及软骨的进行性退化。虽然传统药物治疗在阻止疾病进展方面往往效果有限，但我们报道了一种仿生性的、对ROS有响应的纳米粒子（NPs）递送系统，该系统表面涂覆有巨噬细胞膜（MM-shTHY1-NPs），以实现靶向治疗。巨噬细胞膜（MM）的涂层不仅提高了纳米粒子在炎症滑膜组织中的滞留率和靶向性，还具有清除细胞因子的能力，有助于缓解炎症微环境。在氧化性的关节微环境中，纳米粒子中的ROS响应结构——通过二硒化物键的促进——触发shTHY1有效载荷的定点释放。重要的是，我们展示了THY1沉默在OA微环境重塑中的治疗相关性；体外和体内实验均表明，shTHY1的递送能有效促进巨噬细胞从促炎型M1表型转变为抗炎型M2表型。这种表型转变继而重塑了软骨细胞的微环境，抑制了基质金属蛋白酶的表达并减缓了软骨的退化。RNAi介导的THY1沉默与巨噬细胞膜清除尘子的能力之间的协同作用增强了治疗效果。我们的发现表明，这种细胞膜涂层的纳米平台为炎症性关节疾病的治疗提供了一种有前景的策略，在生物安全性、定点递送和转化可行性方面具有潜在优势。

1. **引言**
全球有2.4亿人患有症状性且限制功能的骨关节炎（OA），这严重影响了患者的生活质量和社会经济状况，引起了全球的关注[1]-[2]。作为一种慢性疾病，OA在临床上表现为持续的炎症、关节软骨结构的退化以及随后形成的骨赘[3]。目前OA的主要临床治疗方法包括非甾体抗炎药（NSAIDs）、皮质类固醇和基于透明质酸的辅助疗法[4]-[5]。尽管这些治疗方法可以有效缓解疼痛和炎症，但它们并不能从根本上阻止OA的进展[6]-[7]。此外，长期使用NSAIDs和皮质类固醇会导致一系列不良反应[8]。因此，迫切需要对OA的机制进行进一步研究，以开发有效的治疗策略[9]-[10]。

作为生命的基本单位，细胞不断与其周围环境进行互动和物质交换，并且可以在特定的微环境中积累[11]。这一见解对仿生药物的开发具有重要意义。特别是涉及细胞膜涂层的纳米粒子（NPs）的仿生药物递送系统，已经引起了医疗专业人员的广泛关注[12]。Tasciotti首次报道了白细胞膜涂层的纳米粒子，这些粒子可以延长药物的循环时间并增强肿瘤的积累[13]。Zhang描述了用红细胞（RBCs）和中性粒细胞的双重细胞膜包覆的纳米粒子，用于治疗关节炎[14]。作为免疫细胞，巨噬细胞在人体生理环境中起着关键作用，并与各种炎症性病理的发生和发展密切相关。值得注意的是，巨噬细胞在OA的进展中也起着重要作用[15]。在炎症的不同阶段，各种病原性刺激或不良微环境可以诱导巨噬细胞向M1或M2表型极化，从而实现特定功能[16]-[17]。在OA的进展过程中，M1巨噬细胞会刺激软骨细胞的代谢活动，导致细胞外基质（ECM）的降解；相反，M2巨噬细胞则会增强软骨细胞的合成活性，发挥保护作用。因此，协调巨噬细胞的极化，特别是从促炎型M1表型转变为抗炎型M2表型，是治疗OA的一个实际策略。

然而，巨噬细胞的极化状态并不是一个孤立的现象，而是由滑膜微环境中的多种细胞成分精确调控的[18]。最近，滑膜成纤维细胞（SFs）的异质性及其在OA中的关键作用已成为重要的研究焦点[19]。最新研究表明，THY1+/CD90+的基底成纤维细胞与炎症性间质状态相关，并表现出促炎和侵袭性表型[20,21]。这些成纤维细胞通过IL-6、TNF-α、IL-1β和CCL2等细胞因子和趋化因子与滑膜巨噬细胞进行相互作用，从而维持滑膜炎并促进巨噬细胞向促炎型M1表型的极化[22]。这种间质-免疫相互作用不仅放大了关节内的氧化应激，还通过上调基质金属蛋白酶（MMPs）加速了细胞外基质（ECM）的降解，包括II型胶原蛋白的丢失。因此，我们假设RNAi介导的THY1沉默可以减弱THY1相关的滑膜成纤维细胞的促炎激活，中断成纤维细胞-巨噬细胞的炎症相互作用，减少滑膜微环境中的M1极化信号，最终实现软骨保护[23]。

在这项研究中，我们开发了一种对活性氧（ROS）有响应的纳米粒子（NP）递送系统，该系统表面涂覆有巨噬细胞膜（MMs）（简称MM-NPs），用于治疗OA[24,25]。首先，我们设计了由长链聚合物自组装形成的ROS响应型纳米粒子。通过简单的两步酰胺化反应，合成了HA-SA-SD聚合物长链（由透明质酸（HA）、硬脂酸（SA）和硒代半胱氨酸二盐酸盐（SD）组成），并将针对THY1的短发夹RNA（shTHY1）封装在颗粒内，形成shTHY1-NPs。由于SA-SD段中存在二硒化物键（Se-Se键），该聚合物在ROS水平升高和pH值较低的病理部位会发生降解，从而加速药物释放。二硒化物键的键解离能低于二硫键，因此更容易被氧化切割。在H2O2存在下，Se–Se键可以被氧化成高价硒基团，导致聚合物段的水溶性增加和结构稳定性降低，最终促进纳米粒子的解组装和shTHY1的释放。外层的巨噬细胞膜（MM）不仅通过仿生效应提高了NPs及其载荷向病变部位的靶向递送效率，还充当了促炎因子的清除剂，中和炎症微环境（图1）。随后，我们对MM-shTHY1-NP系统治疗OA的体内疗效进行了深入研究。

**图1.** 巨噬细胞膜涂层的ROS响应shTHY1纳米粒子（MM-shTHY1-NPs）用于骨关节炎（OA）治疗的示意图。在骨关节炎关节中，过量的ROS和炎症细胞因子激活THY1+（CD90+）滑膜成纤维细胞，促进促炎型M1巨噬细胞的极化，加速软骨基质的降解（MMP13↑，Col II↓）。MM-shTHY1-NPs利用巨噬细胞膜的伪装作用提高在炎症滑膜中的靶向性和细胞因子清除能力，而ROS/酸性微环境触发Se–Se键的切割和纳米粒子的降解，实现按需、定点的shTHY1释放。递送的shTHY1抑制THY1驱动的滑膜炎症，将巨噬细胞从M1表型重新编程为修复型M2表型（CD206↑），降低TNF-α/IL-1β和ROS，最终保护软骨，并提高生物安全性和在关节内的滞留时间。

2. **材料与方法**
2.1. **材料**
上海国家药业集团提供了透明质酸（HA）、硬脂酸（SA）、硒代半胱氨酸二盐酸盐（SD）、DMSO、过氧化氢（H2O2）和N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）。anti-iNOS（K010080P）、anti-CD206（K006619P）、CCK-8试剂盒（CA1210）和ROS检测试剂盒（CA1410）由Solarbo（中国）提供。所有其他化学物质和试剂均为分析级。
2.2. **MM-sh THY1-NPs的制备**
2.2.1. ROS响应sh THY1-NPs的制备
1) 将300 mg硬脂酸溶解在30 mL无水DMSO中。随后，向SA溶液中加入300 mg溶于6 mL DMSO中的EDC，在室温下激活30分钟。接着，向激活后的SA溶液中加入200 mg溶于10 mL DMSO中的SD，在室温下反应6小时。透析并冻干。
2) 将100 mg HA溶解在5 mL MES缓冲液中。然后，向HA溶液中加入100 mg溶于0.5 mL MES缓冲液中的EDC，在室温下搅拌1小时。缓慢滴加30 mL DMSO中的100 mg SD-SA溶液，在室温下反应8小时。8小时后，用丙酮沉淀，洗涤三次，并在真空下干燥30分钟。将粉末分散在蒸馏水中，透析并冻干。
2.2.2. 仿生巨噬细胞MM-sh THY1-NPs的制备
巨噬细胞膜的制备方法如先前报道[26]。简要来说，RAW264.7细胞在4°C的缓冲液中的浓度为2.0 × 10^6细胞/mL，然后用微型挤压机裂解。细胞提取物与1 M蔗糖混合，达到最终浓度0.25 M，然后在4°C下以2000×g离心10分钟。收集上清液，再次以3000×g离心30分钟。为了纯化，将得到的细胞膜用含有0.25 M蔗糖的冷却TM缓冲液冲洗两次。使用比色酸（BCA）蛋白质测试测量分离出的巨噬细胞膜中的总蛋白质含量。
2.3. **sh THY1-NPs和MM-sh THY1-NPs的表征**
使用NanoZetasizer测量不同浓度H2O2下sh THY1-NPs和MM-sh THY1-NPs的zeta电位和粒径，并使用SEM和TEM观察纳米粒子的形态[27]。通过测量sh THY1-NPs和MM-sh THY1-NPs在pH 4.5或pH 7.4的PBS中分散一周后的大小和PDI变化来监测纳米粒子的稳定性。使用改良的透析方法确定sh THY1的体外释放曲线。简而言之，将纳米粒子放入透析袋（MWCO: 3000 Da）中，以100 rpm振荡。在不同时间点收集样品进行PCR分析。使用Western blot（WB）确认巨噬细胞和sh THY1的表达。使用FTIR（iS10，Nicolet，美国）和UV-Vis（UV6100S，MAPADA，中国）检测特征官能团。通过量化纳米粒子制备后释放的游离shTHY1量来确定shTHY1在纳米粒子中的包封效率和装载能力。简而言之，将纳米粒子悬浮液转移到超滤管（MWCO 100 kDa）中，以5000 rpm离心15分钟，以分离游离的shTHY1和与纳米粒子结合的shTHY1。收集含有游离shTHY1的滤液，根据制造商的说明使用Quant-iT RiboGreen RNA检测试剂盒进行定量。然后建立标准校准曲线，计算包封效率（EE）和装载能力（DL）。
2.4. **细胞系**
iCell Bioscience Inc.提供了类似于小鼠巨噬细胞的RAW 264.7细胞和来自大鼠软骨细胞的大鼠软骨细胞（RCC）。细胞在含有10% FBS和1% PS的DMEM培养基中，在37°C和5% CO2气氛下培养。Thy1敲低载体从公共蛋白质/质粒库（PPL）购买。慢病毒包装质粒pVSVG、gag-pol和rev来自南京BiYuntian Biotechnology。质粒信息：Thy1的GenBank ID为21838，GFP作为报告蛋白。质粒PPL50556-3a的目标序列为CCGCCATGAGAATAACACCAA，阴性对照目标序列为GTTCTCCGAACGTGTCACGT。
2.5. **QT-PCR检测**
使用qRT-PCR定量mRNA水平。首先将巨噬细胞接种在六孔板中，培养一天直至达到70-80%的汇合度。在12小时暴露于LPS（1 μg/mL）后，加入不同的物质组并继续培养24小时。按照供应商的说明提取总RNA，然后使用逆转录酶试剂盒进行逆转录。使用实时PCR系统确定Cq值（表S1）。
2.6. **体外细胞摄取实验**
为了研究细胞摄取，通过异硫氰酸酯-胺反应将FITC共价结合到含有氨基的HA-SA-SD聚合物上。然后使用产生的FITC标记的纳米粒子制备MM涂层纳米粒子，用荧光信号追踪纳米粒子的内吞作用，而不是shTHY1本身。与之前的方法类似，将巨噬细胞接种在十二孔板中，然后在37°C下与PBS、sh THY1、sh THY1-NPs和MM-sh THY1-NPs共培养。在特定时间点，用4%的甲醛固定细胞，在荧光显微镜（Nikon，日本）下观察，并使用ImageJ软件定量分析图像的平均荧光强度。
2.7. **体外细胞相容性**
使用CCK-8试剂盒（CA1210，Solarbio，中国）评估MM-sh THY1-NPs对细胞的安全性。将巨噬细胞和RCC细胞以每孔50,000个细胞的浓度接种在96孔板中。然后将细胞与sh THY1、sh THY1-NPs和MM-sh THY1-NPs共培养48小时。之后，用5 mg/mL的CCK-8溶液处理细胞，并在37°C下保持4小时。最终，使用微孔读数器（Infinite M200 Pro，瑞士）在490 nm处测量吸光度，确定细胞活力。
2.8. **细胞内ROS检测**
使用ROS检测试剂盒检测细胞内的ROS水平。简而言之，将大鼠软骨细胞（RCC）接种在24孔皿中。然后加入PBS、sh THY1、sh THY1-NPs和MM-sh THY1-NPs并培养24小时。随后去除培养基，加入ROS工作溶液。半小时后，使用荧光显微镜对细胞进行了检测和拍照。利用ImageJ软件测量了图像中的平均亮度水平。

2.9. 免疫组化
为了进行组织学分析，收集了经过各种处理的大鼠膝关节，分别进行Hematoxylin和Eosin (H&E) 染色、Masson染色以及Safranin O/Fast Green染色。对于免疫组化分析，膝关节切片分别与初级抗体（抗MMP13和抗胶原蛋白）孵育。

2.10. 动物模型
从实验动物中心购买了雄性Sprague-Dawley (SD) 大鼠（240-280克）。所有动物实验均按照大学的动物实验指南进行，并获得了大学动物伦理委员会的批准。为了创建骨关节炎（OA）模型，对这些大鼠的右膝关节进行了前交叉韧带切除术（ACLT）。如前所述，使用假手术大鼠作为对照组。该模型通过前抽屉测试进行了验证。手术后一周，ACLT大鼠被随机分配到五个组（n=5），并给予不同配方的关节内注射，而假手术大鼠作为健康对照组。每组大鼠在术后第1天、第3天、第5天和第7天接受关节内注射。所有大鼠在第28天被安乐死，然后取出关节进行免疫组化分析。

2.11. 体内保留评估
九只雄性SD大鼠（240-280克）的右膝关节接受了ACLT以建立OA模型，左膝关节进行了假手术。两个月后，评估了这些配方在健康和OA膝关节中的保留能力。使用来自Caliper Life Sciences公司的体内成像系统，在注射后12小时、24小时、48小时、72小时和120小时对这些大鼠的膝关节进行了成像。

2.12. 统计分析
所有统计计算使用GraphPad Prism 8.0（美国加州拉霍亚）进行。统计显著性通过Student's t检验或单因素方差分析（one-way ANOVA）进行评估。数据以平均值±标准差（SD）显示，P值小于0.05表示具有统计显著性。

3. 结果与讨论
3.1. MM-sh THY1纳米颗粒的制备和表征
ROS响应性纳米颗粒是通过两亲性聚合物HA-SA-SD的自组装合成的。HA-SA-SD纳米颗粒的合成过程如图1A所示。在水溶液中，两亲性HA-SA-SD聚合物自组装成类似微胶束的纳米颗粒，其中的硬脂酸段驱动疏水聚集，而HA链形成亲水外壳。在纳米颗粒形成过程中，带负电的shTHY1通过与含氨基的SD段的静电相互作用以及自组装过程中的物理包裹而被嵌入，而不是简单地分散到疏水核心中。shTHY1的效率（EE）和分布宽度（DL）分别为82.4±2.7%和6.3±0.5%，表明HA-SA-SD聚合物能够在纳米颗粒自组装过程中有效地装载shTHY1。之后，使用简单的自组装技术制备了sh THY1包封的纳米颗粒。扫描电子显微镜（SEM）分析显示这些纳米颗粒大致呈球形，平均粒径约为168纳米（图1B）。紫外光谱（UV）和红外光谱（IR）（图S1）确认了HA-SA-SD聚合物的成功合成。为了评估ROS的反应性，将纳米颗粒暴露在不同浓度的过氧化氢中，并在不同时间间隔记录溶液的透射率。鉴于OA关节中的ROS水平持续升高，而由于局部生成的动态性、扩散和抗氧化清除作用，难以精确定义自由H2O2的瞬时浓度，因此在此使用0.1 mM H2O2作为与疾病相关的氧化触发剂，以模拟OA中的增强氧化应激微环境。根据图1C，在暴露于0.1 mM过氧化氢后，颗粒混合物在2小时内变得完全透明。相反，PBS中的颗粒仅表现出轻微的吸光度下降，这是由于颗粒的部分沉降。此外，我们还评估了sh THY1-NPs在不同pH环境中的药物释放情况。如图1D所示，在pH 4.5时，sh THY1-NPs的药物释放率为82.5%，而在pH 7.2时仅为21.3%，表明这些纳米颗粒对ROS具有优异的反应性。我们还研究了sh THY1-NPs在不同pH条件和H2O2浓度下的尺寸变化。如图S2–S3所示，sh THY1-NPs的流体动力学直径在酸性和氧化环境中随时间呈现出明显的变化，进一步证实了其对刺激的反应性。尽管在本研究中没有单独进行MM-shTHY1-NPs的直接释放表征，但先前的报告表明鼠巨噬细胞/细胞膜包覆的刺激响应性纳米平台表明，膜包覆通常起到仿生外壳的作用，不会消除纳米颗粒核心的固有反应性。相反，它可能减少过早释放并适度调节释放动力学，同时仍允许病理微环境触发的货物释放。为了制备MM-NPs，使用RAW264.7鼠巨噬细胞的膜来包裹ROS敏感的纳米颗粒（图1E）。图1F显示，MM-NPs在TEM下呈现出球形核壳结构，每个纳米颗粒都被单层细胞膜包围，涂层的厚度约为9纳米，与细胞膜的厚度相匹配。根据动态光散射（DLS）分析，MM-NPs的zeta电位低于自由颗粒（图1G），但与巨噬细胞表面的zeta电位一致。此外，DLS分析显示，施加细胞膜涂层后，纳米颗粒的尺寸从大约168纳米增长到约207纳米（图1H），这与巨噬细胞双层膜的结合相符。为了进一步确定巨噬细胞膜涂层是否影响纳米颗粒的微环境响应行为，我们还评估了MM-shTHY1-NPs在氧化和酸性条件下的水解和释放情况。如图S4所示，即使在膜涂层后，MM-shTHY1-NPs仍显示出明显的H2O2响应性水解和pH触发的shTHY1释放。这些结果表明，巨噬细胞膜涂层并没有消除含Se纳米颗粒核心的固有刺激响应行为，尽管由于额外的膜屏障，响应动力学略有减弱。Western blotting验证了巨噬细胞膜和MM-NPs表面都存在重要的膜抗原，如TNFR2、CD36和CCR2，表明巨噬细胞膜在MM-NPs上的存在与巨噬细胞上的膜相同（图1I–K）。Western blotting还确认了关键的巨噬细胞膜蛋白，包括TNFR2、CD36和CCR2，都保留在MM-NPs的表面上，表明涂层过程成功保留了生物活性膜成分（图1I–K）。重要的是，这些与膜相关的蛋白不仅是结构标志物，还可能赋予MM-NPs功能性抗炎特性。具体来说，TNFR2可能作为诱饵受体结合可溶性TNF-α，从而降低其生物利用度和下游炎症信号传导。CCR2可能有助于在炎症微环境中隔离趋化因子（如CCL2），从而帮助减轻炎症细胞的募集和信号放大。此外，CD36作为清除受体，可能有助于识别和吸附氧化脂质或与损伤相关的炎症信号，进一步缓冲局部炎症负担。因此，我们系统中的巨噬细胞膜涂层不仅起到了定位壳的作用，还充当了有助于清除炎症介质和调节微环境的生物活性治疗界面。为了进一步评估巨噬细胞膜涂层的细胞因子清除能力，将重组TNF-α和IL-1β与不同纳米颗粒配方一起孵育，并通过ELISA定量上清液中的剩余细胞因子水平。如图S5所示，MM涂层的纳米颗粒表现出明显的炎症细胞因子缓冲活性。2小时后孵育后，MM-NPs和MM-shTHY1-NPs对TNF-α的清除效率分别为52.4±3.8%和57.9±4.1%，对IL-1β的清除效率分别为38.7±3.5%和43.5±3.9%。这些发现直接证明巨噬细胞膜涂层有助于清除促炎细胞因子，从而与shTHY1的递送协同作用，调节局部炎症微环境。同时，sh THY1的负载成功减少了细胞内的THY1表达。

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图1. MM-sh THY1-NPs的制备和表征。(A) 纳米颗粒制备的示意图。(B) ROS响应性纳米颗粒的代表性SEM图像。比例尺：50纳米。(C) 不同H2O2浓度（0.50 mM和0.1 mM）下纳米颗粒的水解速率。(D) sh THY1-NPs的体外药物释放曲线。(E) 通过挤出方法制备MM-NPs的示意图。(F) MM-NPs的代表性TEM图像。比例尺：200纳米。(G) 通过DLS分析的纳米颗粒和MM-NPs的zeta电位。(I) 通过Western blot分离的纳米颗粒、巨噬细胞膜衍生囊泡的特征蛋白带。(J) TNFR2和(CR2)在纳米颗粒、巨噬细胞和MM-NPs中的积分密度定量分析。所有实验重复五次（n=5），数据以平均值±标准差表示。统计分析使用单因素方差分析进行。***P < 0.001。

3.2. MM-sh THY1-NPs的生物相容性和细胞摄取
生物相容性是生物材料在体内的有效性的前提。在本研究中，我们使用CCK-8和活死染色试验评估了材料的细胞毒性。如图2A所示，将材料与RAW264.7细胞和软骨细胞（RCC）共培养48小时后，大多数细胞仍然存活。此外，我们还使用CCK-8试验评估了细胞活力。如图2B和C所示，48小时后，所有材料组的细胞活力均保持在90%以上，与对照组相比没有显著差异（p > 0.05）。这表明我们的材料具有良好的生物相容性。

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图2. MM-sh THY1-NPs的生物相容性和细胞摄取。(A) RAW264.7巨噬细胞和RCC软骨细胞与不同组材料共培养24小时的代表性活/死染色图像（绿色表示活细胞；红色表示死细胞）。比例尺，200微米。(B) 和 (C) 使用CCK-8试验分别对RAW264.7巨噬细胞和RCC软骨细胞的细胞活力进行统计分析（n=3）。(D) RAW264.7巨噬细胞与FITC标记的纳米颗粒共培养不同时间点的LSCM图像，以及 (E) 荧光强度的统计分析（n=3）。比例尺，200微米 ***P < 0.01; ***P < 0.001。

接下来，我们评估了不同配方在巨噬细胞中的内化行为。如图2D–E和图S6所示，随着孵育时间的延长，细胞内荧光逐渐增加，表明存在明显的时间依赖性内化过程。此外，不同配方的比较分析显示，MM-shTHY1-NPs组中的细胞内荧光强度显著高于shTHY1-NPs组，表明巨噬细胞膜涂层增强了巨噬细胞的内化作用。由于没有进行更广泛的细胞选择性评估，我们将这些结果描述为巨噬细胞内化的增强，而不是巨噬细胞特异性靶向的直接证据。所有代表性图像都标准化到相同的放大倍数和显示大小，以确保组间的有效比较。

3.3. MM-sh THY1-NPs对巨噬细胞M1-M2极化的效应
在典型的炎症反应中，巨噬细胞作为有效的效应细胞，大致分为M1和M2亚群，分别执行促炎和抗炎功能，以响应微环境中的不同刺激。在评估纳米颗粒对巨噬细胞极化的影响之前，我们首先量化了shTHY1处理后的THY1下调效率。如图S7所示，与PBS组相比，自由shTHY1显著降低了THY1的mRNA表达，而纳米颗粒介导的递送进一步增强了这种抑制效果。值得注意的是，MM-shTHY1-NPs产生了最强的THY1表达抑制作用，证实了RNAi纳米平台的有效基因沉默能力。M1巨噬细胞活化可以由LPS或IFN-γ诱导，而M2巨噬细胞极化可以由IL-4和/或IL-13诱导。在OA关节中，巨噬细胞主要表现出M1表型，分泌大量炎症细胞因子。因此，我们使用LPS和IFN-γ刺激巨噬细胞，并评估MM-sh THY1-NPs重新编程M1巨噬细胞的能力。LPS和IFN-γ诱导后，免疫荧光染色主要显示绿色荧光，表明巨噬细胞处于M1状态（图3A）。与PBS组相比，sh THY1、sh THY1-NPs和MM-sh THY1-NPs处理组的iNOS表达显著降低，而CD206表达显著增加（图3B–C）。其中，MM-sh THY1-NPs组的iNOS表达最低，CD206表达最高，表明MM-sh THY1-NPs可以促进巨噬细胞从M1极化为M2极化。我们进一步使用Western blot分析检测了巨噬细胞中的M1和M2标记物。如图3D–F所示，MM-sh THY1-NPs组的iNOS表达约为PBS组的45%，CD206表达约为PBS组的231%，进一步证实MM-sh THY1-NPs可以促进巨噬细胞从M1极化为M2极化。

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图3.MM-sh THY1纳米颗粒对巨噬细胞M1-M2极化的影响。(A) 免疫荧光图像显示在不同条件下促炎性M1生物标志物(iNOS；绿色)和抗炎性M2生物标志物(CD206；红色)的表达情况。刻度尺，100微米。(B) 和 (C) 分别在不同条件下对iNOS和CD206表达的定量分析。(D) 西部印迹分析显示用不同材料处理后M1（iNOS）向M2（CD206）极化的表型转变，以及对iNOS (E) 和 CD206 (F) 的定量分析。P < 0.05；***P < 0.01；****P < 0.001。(G) 免疫荧光染色显示不同组中的细胞内ROS水平，以及 (H) 定量分析（n = 3）。刻度尺，100微米。(I) 流式细胞术分析不同组中的细胞内ROS表达。(J) 流式细胞术分析不同组中的Annexin V-FITC/PI比率。***P < 0.05；***P < 0.01；****P < 0.001。为了阐明shTHY1是否在成纤维细胞水平上起上游作用，我们首先评估了THY1在滑膜成纤维细胞中的沉默效率。如图S8A所示，与PBS组相比，游离的shTHY1显著降低了THY1 mRNA的表达，而shTHY1-NPs进一步增强了这种抑制效应。值得注意的是，MM-shTHY1-NPs产生了最明显的THY1下调，表明纳米颗粒平台，特别是在巨噬细胞膜修饰后，提高了滑膜成纤维细胞中THY1的沉默效率。接下来，我们检查了抑制成纤维细胞相关的THY1信号是否影响下游巨噬细胞的极化。如图S8B所示，shTHY1干预在炎症条件下降低了iNOS的表达并增加了Arg1的表达，在MM-shTHY1-NPs组中观察到了最强的效果。这些发现表明，在滑膜成纤维细胞中沉默THY1可以减弱成纤维细胞产生的促炎信号，从而减弱M1极化的压力，促进巨噬细胞向修复性M2表型的转变。因此，MM-shTHY1-NPs似乎通过中断成纤维细胞-巨噬细胞之间的炎症相互作用至少部分地重塑了OA滑膜微环境，这为下面显示的巨噬细胞极化结果提供了机制基础。为了进一步研究巨噬细胞极化的机制，我们通过西部印迹分析检查了NF-κB相关信号通路。如图S9所示，基于shTHY1的处理改变了p-p65和IκBα的表达，表明纳米平台对巨噬细胞极化的调节作用至少部分与抑制NF-κB激活有关。这些发现为观察到的M1到M2的表型转变提供了初步的机制支持。

3.4. MM-sh THY1-NPs的体外抗炎和软骨保护作用
关节软骨主要由软骨细胞和细胞外基质（ECM）组成。ECM为软骨细胞提供保护，而软骨细胞调节ECM的合成和降解。在正常情况下，软骨细胞分泌II型胶原蛋白和聚集蛋白，这些是ECM的重要组成部分。在OA进展过程中，氧化应激和炎症因子导致软骨细胞表达胶原蛋白和基质金属蛋白酶，如II型胶原蛋白和MMP-13。这些蛋白质导致细胞外基质（ECM）的降解和软骨细胞的凋亡。在这项研究中，我们通过测量软骨生成和代谢中的炎症因子和标志蛋白的表达，评估了MM-sh THY1-NPs的体外抗炎和软骨保护作用。巨噬细胞和RCC细胞共培养，并用LPS和IFN-γ诱导M1分化，然后加入sh THY1、sh THY1-NPs和MM-sh THY1-NPs。图3G和H显示，与PBS组相比，处理组的ROS水平降低，其中MM-sh THY1-NPs组的恢复效果最好，是对照组的2.4倍。使用流式细胞术进一步定量细胞ROS，结果一致，MM-sh THY1-NP组的恢复效果最好（图3I），表明MM-sh THY1-NPs显著降低了细胞内ROS。Annexin-V/PI分析显示不同组间的软骨细胞凋亡率没有显著差异（p > 0.05，图3J和S10）。
此外，我们检查了与软骨合成和代谢相关的蛋白质表达。如图4A-C所示，在LPS和IFN-γ刺激后，软骨细胞中的II型胶原蛋白表达显著降低，MMP13表达显著增加。与PBS组相比，sh THY1、sh THY1-NPs和MM-sh THY1-NPs处理组的II型胶原蛋白表达显著增加，MM-sh THY1-NP组的治疗效果最好。PCR和ELISA进一步确认处理组中的IL-1β和TNF-α表达显著受到抑制（图4D-G）。这些结果表明，MM-sh THY1-NPs显著减轻了软骨细胞中的炎症应力，并将软骨细胞微环境从分解状态转变为更合成的状态，这体现在MMP13的减少和II型胶原蛋白的增加上。这种有益的转变与巨噬细胞从促炎性M1表型向修复性M2表型的极化密切相关。

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图4. MM-sh THY1-NPs的体外软骨保护作用。(A) 软骨细胞生长和代谢标志物（绿色：MMP13，红色：胶原蛋白；蓝色：DAPI）的免疫荧光染色，以及(B) 胶原蛋白荧光强度的定量分析，(C) MMP13荧光强度的定量分析。刻度尺，100微米。(D) TNF-α的炎症细胞因子表达水平的qRT-PCR分析，以及(E) IL-1β的(F) ELISA定量分析。（N = 5）。*P < 0.05；**P < 0.01；***P < 0.001。

3.5. MM-sh THY1-NPs在体内的靶向能力和治疗效果
先前的实验已经证明了MM-sh THY1-NPs在体外具有抗炎作用和软骨微环境重塑能力。为了进一步评估MM-sh THY1-NPs在OA中的疗效，建立了ACLT诱导的OA模型。对照组中明显出现了OA病理特征性的软骨降解和炎症。如图5A所示，在大鼠中构建OA模型后，分别将PBS、sh THY1、sh THY1-NPs和MM-sh THY1-NPs注射到膝关节中，并继续进行治疗。手术后的第28天，对大鼠进行安乐死，并收集关节进行进一步分析。
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图5. MM-sh THY1-NPs在体内的靶向能力和治疗效果。(A) 评估MM-sh THY1-NPs对骨关节炎治疗效果的示意图。(B) 注射sh THY1-NPs和MM-sh THY1-NPs后骨关节炎的靶向情况和体内滞留时间。(C) 大鼠膝关节的H&E染色、Masson染色和Safranin O-fast染色。刻度尺，50微米。(D) 大鼠膝关节的改良Mankin评分。***P < 0.01；****P < 0.001，n = 3。
为了评估MM-sh THY1-NPs在体内的治疗效果，使用染料试验评估了纳米颗粒注射后的靶向和滞留时间。如图5B所示，sh THY1-NPs和MM-sh THY1-NPs在12小时内积聚在膝关节中。24小时后，shTHY1-NPs组的荧光强度逐渐减弱，而MM-sh THY1-NPs组的荧光强度持续到120小时。MM-sh THY1-NPs在关节内的长时间滞留可能是由于巨噬细胞膜介导的生物模拟“自我相似”识别的综合效应，这可能会减少快速的吞噬清除，以及HA骨架的固有关节亲和力，这可能通过炎症关节微环境中的CD44相关相互作用进一步增强局部黏附/滞留。这归因于巨噬细胞膜的修饰，使纳米颗粒能够在OA部位停留更长时间。
进一步使用HE染色、Masson染色和Safranin O-Fast Green染色进行组织学评估，以评估软骨组织的变化。如图5C所示，对照组具有完整且平滑的软骨表面，细胞分布均匀，软骨基质染色清晰。相比之下，PBS组表现出严重的软骨损伤和降解，软骨层显著变薄，细胞数量减少，软骨基质退化，这是典型的OA病理特征。sh THY1和sh THY1-NPs组也显示了软骨磨损和软骨基质丢失。相比之下，MM-sh THY1-NP组具有完整且平滑的软骨表面，细胞分布均匀，没有软骨基质降解，软骨ECM染色明显优于其他组。此外，使用改良的Mankin评分来评估每组的软骨损伤。如图5D所示，MM-sh THY1-NP组的Mankin评分显著低于其他治疗组，表明关节内注射MM-sh THY1-NPs可以改善OA软骨损伤。

3.6. MM-sh THY1-NPs缓解体内OA的机制
使用免疫组化评估了每组的软骨损伤和修复情况。如图6A-D所示，与对照组相比，PBS、sh THY1、sh THY1-NPs和MM-sh THY1-NP组的Col-I和Col-II表达显著增加，MMP-13表达也显著增加。相比之下，MM-sh THY1-NP组的Col-I和Col-II表达水平显著高于其他治疗组（P < 0.05）。MM-sh THY1-NP组的MMP-13表达也显著低于PBS、sh THY1和sh THY1-NP组（P < 0.05）。这些体内发现进一步表明，MM-sh THY1-NPs将软骨微环境从降解的分解状态转变为修复的合成状态，这反映在MMP13表达的减少和胶原蛋白II生成的恢复上，这与观察到的OA滑膜中巨噬细胞表型转变一致。

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图6. MM-sh THY1-NPs在体内缓解OA的机制。(A) OA大鼠软骨中胶原蛋白（Col）和MMP13的IHC染色。刻度尺，100微米。(B) 膝关节软骨区域中胶原蛋白I的定量分析，(C) 胶原蛋白II的定量分析，以及(D) MMP13的荧光强度。(E) 用不同材料处理后大鼠膝关节切片中促炎性M1生物标志物(iNOS；绿色)和抗炎性M2生物标志物(CD206；红色的免疫染色。***P < 0.01；****P < 0.001，n = 3。刻度尺，50微米。
为了进一步分析MM-sh THY1-NPs缓解OA的机制，使用免疫组化（IHC）检测巨噬细胞表型。使用iNOS和CD206进行免疫荧光（IF）分析以分析巨噬细胞类型（图6E）。定量分析（图S11）显示PBS组的iNOS荧光强度显著增加，表明巨噬细胞被刺激极化为M1表型，而CD206的荧光强度与对照组没有显著差异。随后，用sh THY1、sh THY1-NPs和MM-sh THY1-NPs处理后，iNOS的荧光强度显著降低，CD206的荧光强度显著增加。这些结果表明，MM-sh THY1-NPs促进了OA滑膜中M1向M2巨噬细胞的极化。尽管sh THY1对增强纳米颗粒的滞留作用影响有限，但巨噬细胞膜修饰的纳米颗粒可以诱导巨噬细胞的主动摄取，从而提供最佳的M1到M2极化效果。
此外，还评估了每个处理组治疗后相关炎症因子的表达。PBS组的TNF-α表达显著上调（图S12）。然而，这种上调在使用不同纳米颗粒治疗后不同程度地得到了逆转，其中MM-sh THY1-NP组的抑制作用最为显著。这些实验结果支持和验证了MM-sh THY1-NPs在调节巨噬细胞极化方面的有效性，突出了它们作为OA治疗的潜力。
为了进一步评估MM-shTHY1-NPs的体内系统安全性，在治疗周期结束时收集了大鼠的主要器官和血液样本。对心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏进行H&E染色，未在任何组中发现明显的病理异常，包括炎症浸润、坏死或结构损伤（图S13）。此外，血清生化分析显示，作为肝功能指标的丙氨酸氨基转移酶（ALT）和天冬氨酸氨基转移酶（AST），以及作为肾功能指标的血尿素氮（BUN）和肌酐（CREA）均保持在正常生理范围内，组间没有显著差异。总体而言，这些结果表明MM-shTHY1-NPs在关节内给药后的良好体内生物相容性和低系统毒性。
为了从功能角度进一步评估治疗效果，我们还评估了不同实验组的机械痛阈值和关节活动范围（ROM）。如图S14所示，OA诱导显著降低了机械痛阈值并损害了关节活动度。相比之下，MM-sh THY1-NPs的治疗显著恢复了痛阈值并改善了ROM，在测试的配方中显示出最明显的功能恢复。这些发现进一步支持了MM-sh THY1-NPs在行为和功能层面上对OA进展的有益效果。根据我们之前的研究，在体内敲低THY1基因表达可以减缓骨关节炎（OA）的进展。因此，我们设计了一种模仿巨噬细胞的基因传递系统，其中ROS响应性聚合物HA-SA-SD表面包裹有巨噬细胞膜，从而能够主动靶向炎症组织。我们的材料提供了一种基于细胞功能的策略，可以在无需额外靶向分子的情况下定位炎症部位。一旦MM-sh THY1-NPs到达炎症部位，其ROS响应特性会使其释放sh THY1，从而缓解骨关节炎。体外和体内的实验表明，MM-shTHY1-NPs能够抑制滑膜成纤维细胞中的THY1相关炎症反应，中断成纤维细胞与巨噬细胞之间的炎症交互作用，促进巨噬细胞向M2表型极化，并最终延缓骨关节炎的进展。因此，这种模仿巨噬细胞的系统在进一步应用方面具有巨大潜力。

**作者贡献声明：**
胡欣月：概念构思、资金筹集、研究实施、方法设计、初稿撰写。
李庄：概念构思、研究实施、方法设计、初稿撰写。
李晓飞：研究实施、方法设计。
张凌霄：概念构思、资金筹集、项目管理、监督、审稿与编辑。
张雅青：概念构思、资金筹集、项目管理、监督、审稿与编辑。