一种基于熵驱动原理的、具有选择性铜螯合功能的协调体系，用于针对性干预威尔逊病（Wilson's Disease）

《Materials Today Advances》：An Entropy-Driven, Selective Copper-Sequestering Coordination Framework for Gut-Restricted Intervention of Wilson's Disease

　　田志刘|姚晓|崔小琳|唐 Futao|袁成|赵鑫|梁翔|吴宇格|张世一
上海交通大学生物医学工程学院，中国上海

**引言**
铜（Cu）是一种必需的微量元素，作为参与线粒体呼吸[1]、抗氧化防御[2]和神经递质合成[3]的酶的辅因子发挥作用。相反，铜也可能催化氧化应激[4]，触发调控性细胞死亡（铜死亡）[5]，并引发炎症[6]。因此，铜的稳态通过转运蛋白和铜结合蛋白（如ATP7A/B和金属硫蛋白）网络受到严格调控[7]。异常的铜积累与多种病理状况有关[8]。特别是在威尔森病（WD）中，由于ATP7B基因突变导致胆汁中铜排泄受损，铜过载可引发威胁生命的肝脏和神经系统症状[9]。除了WD之外，阿尔茨海默病（AD）患者[10]和各种癌症患者[11]的血清铜水平也升高。流行病学研究进一步将高血清铜水平与动脉粥样硬化（AS）的风险增加联系起来[12]，并且在人类动脉粥样硬化斑块[13]和肿瘤组织[11, 14]中也证实了铜的富集增加。

迄今为止，FDA已批准了铜螯合剂（如D-青霉胺和三乙撑四胺）和醋酸锌用于WD治疗，它们分别通过促进尿液中铜的排泄和抑制胃肠道对铜的吸收来发挥作用[15]。值得注意的是，铜螯合剂在AD[16]、AS[17]和癌症[18]的临床前和临床研究中也得到了探索。然而，铜螯合剂固有的离子选择性差以及系统暴露常常导致副作用[19]，例如铁缺乏性贫血[20]。更重要的是，螯合剂引起的铜重新分布，尤其是D-青霉胺（DPA），但也见于三乙撑四胺，在部分WD患者中可能会加剧神经系统症状[21]。另一种有前途的铜隔离剂四硫钼酸盐（TTM）通过在血液中形成稳定的白蛋白-铜三聚体（TPC）来限制铜的生物利用度[22]，因此比传统螯合剂在WD患者中引起的神经系统恶化更少[23]。然而，最新发现表明，TPC在循环中滞留而没有有效排泄，这引发了重大的长期安全性问题[24]。相比之下，醋酸锌的耐受性更好；然而，其治疗效果明显较慢，通常需要几个月才能看到明显效果[9]，并且有一部分患者没有任何临床反应[25]。这些局限性突显了需要替代的铜降低疗法的必要性。

普鲁士蓝（PB）及其类似物（PBAs）具有开放的三维结构，其中含有大的间隙位点和通道，通过电化学梯度或化学亲和力促进可逆的离子交换和传输[26]。PB/PBAs的固有结构特征，包括晶格水和碱金属的占据情况，已被广泛研究，这些特征决定了它们的离子交换能力和动力学，为从可充电电池到临床解毒剂的各种应用奠定了基础[27]。然而，将这种多用途的离子交换能力转化为体内生理相关离子的精确管理时却面临关键挑战。传统的间隙位点交换在含有多种竞争性离子的复杂生物流体中往往缺乏必要的选择性和耐干扰性，例如在铜/铯中毒治疗中使用PB时观察到的电解质失衡（如低钾血症）[28]。然而，在PBAs中经常被忽视的是，它们的氰化物配体调控的协调框架具有内在的离子选择性，类似于金属蛋白中的金属特异性协调环境[29]。值得注意的是，据报道，在结晶度差的PBAs中，晶格位点的离子交换可以调节心脏组织中的铁水平[30]；然而，其背后的离子选择性尚未得到评估或阐明。到目前为止，PBAs晶格位点上的离子选择性的结构决定因素仍然 largely 未得到探索。

在这里，我们筛选了基于锌的PBAs作为口服铜隔离剂，与其FDA批准的铜降低剂（三乙撑四胺和醋酸锌）进行比较（图1）。我们合成了28种晶体粉末，涵盖了所有五种基于锌的PBAs的晶体相。在这些粉末中，我们发现了一种独特的选择性Zn–Cu晶格位点交换，在缺乏水分的Zn3[Fe(CN)6]2框架（ZF3）中，这种交换受到生理相关离子的干扰，不同于PBAs中的传统间隙位点交换。这种晶格交换还受到水和钾含量的调节：较低的水分含量增强了铜的选择性，而适当的钾含量促进了Zn–Cu的快速替代。这种由熵驱动的交换使得ZF3在生理条件下能够稳定地隔离铜，从而有效限制其生物利用度。使用X射线荧光技术，我们确认口服ZF3在大鼠体内不会被吸收，而是通过粪便排出，同时促进了粪便中铜的排泄。在铜过载的大鼠模型中，口服ZF3减少了全身和肝脏中的铜积累，其螯合作用与三乙撑四胺（TETA）相当，同时在维持锌稳态和改善肝脏病理方面表现出更好的效果。在ATP7B缺乏的小鼠模型中，口服ZF3比醋酸锌更有效地抑制了胃肠道对铜的吸收，并且在短短3天内促进了全身铜的排泄。我们的发现揭示了基于锌的PBAs中的独特结构-亲和力关系，其中基本上无水的Zn3[Fe(CN)6]2框架实现了选择性的Cu–Zn晶格交换，为口服铜隔离提供了独特的范例，具有超越当前疗法的转化意义。

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**图1.** Zn基PBAs作为口服铜隔离剂的筛选示意图，与FDA批准的铜降低剂进行比较。

**结果与讨论**
**筛选选择性铜隔离剂**
为了识别类似于口服铯/铊解毒剂（Fe4[Fe(CN)6]3晶体）的铜隔离剂，我们首先考虑了化学组成的相似性。由于锌和铁的日摄入量和血液浓度相当[31]，我们从无机晶体结构数据库（ICSD）中筛选了基于锌的PBAs，并确定了五种不同的晶体结构（表S1）。然后，我们通过调整合成参数（包括热处理条件和前体中的锌/铁比例）合成了系列基于锌的PBAs（图1a，表S2）。总共合成了28种晶体材料，并将其分为两类：ZF2系列（使用K4[Fe(CN)6]合成）和ZF3系列（使用K3[Fe(CN)6]合成），每类各有14种材料（图1a，图S1）。还购买了普鲁士蓝晶体粉末（Fe4[Fe(CN)6]3）作为对照，通过粉末X射线衍射（PXRD）进行了确认（图S2）。新合成的ZF3系列和ZF2系列首先通过PXRD进行了表征。这些样品的晶体相与ICSD中提到的基于锌的PBAs相符（图S3-4）。然后，我们制备了一种含有Na+（100 mM）、K+（100 mM）、Ca2+（10 mM）、Mg2+（10 mM）、Fe2+（1 mM）、Zn2+（1 mM）和Cu2+（1 mM）的体外混合离子水溶液，以模拟胃肠道环境中的离子干扰条件。使用该溶液筛选新合成的ZF3系列和ZF2系列的选择性铜隔离能力（图1a）。根据每种离子的去除百分比，我们定义并计算了选择性系数（S），以定量比较不同样品之间的铜结合选择性（表S3）。所有样品的合成参数、晶体相特征和选择性系数进一步一起绘制在图1b-c中。有趣的是，对于ZF3系列，最终晶体相（即Zn3[Fe(CN)6]2和Zn3[Fe(CN)6]2·14H2O）由热处理决定，与前体中的锌/铁比例无关。而对于ZF2系列，前体中的锌/铁比例决定了最终晶体相（即K2Zn3[Fe(CN)6]2·5H2O和Zn2[Fe(CN)6]·5H2O），无论热处理如何。值得注意的是，四种具有相同晶体相ZF3[Fe(CN)6]2的样品（ZF3-2、ZF3-4、ZF3-6和ZF3-8）的选择性系数（S）均为1，表明这些样品完全去除了100%的Cu2+，而没有检测到其他共存阳离子的去除（图1b和表S3）。值得注意的是，这四种样品都表现出明显的锌释放，表明铜隔离可能是通过晶格位点的Zn–Cu交换实现的（图S5）。相比之下，其他常见的锌化合物也表现出一定的Zn–Cu交换能力；然而，尽管它们的锌含量较高，但它们在混合离子溶液中的Cu2+选择性系数明显低于这四种样品（图1d和表S3）。同样，FDA批准的普鲁士蓝晶体的Cu2+选择性也低于这四种样品（图1d和表S3）。对于七种具有相同晶体相Zn3[Fe(CN)6]2的样品，它们的Cu2+选择性系数随着前体中的锌/铁比例的变化而显著变化，这是唯一的合成变量。对于PBAs，除了晶体相外，间隙位点中的水分和钾含量也对离子交换和传输有显著影响。因此，我们假设锌/铁比例的变化强烈调节了最终晶体中的间隙水和钾含量，从而影响了它们的铜选择性。据此，我们量化了这七种样品的水和钾含量，并研究了它们与锌/铁比例的相关性。结果发现，随着锌/铁比例的增加，水分和钾含量显著下降（图1e）。相关性分析进一步确认了锌/铁比例与钾或水分含量之间存在显著的负相关，而水分和钾含量之间呈正相关（图1f）。这些结果表明，增加锌/铁前体比例会降低前体中的钾含量，从而导致最终晶体中的钾含量减少，进而导致框架中的水分含量也降低。

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**图1.** a) Zn PBAs的合成示意图及其在生理相关离子干扰下的铜选择性比较筛选。合成条件包括锌/铁摩尔比（前体）和热处理，以及b) ZF3系列和c) ZF2系列的铜晶体相和选择性系数。d) 四种ZF3样品、购买的常见锌化合物以及普鲁士蓝（Fe4[Fe(CN)6]3的Cu选择性系数和锌含量（重量百分比）。e) 在120°C干燥的ZF3系列中，H2O/K含量（重量百分比）与锌/铁摩尔比（前体）的图表和拟合。f) Zn/铁摩尔比（前体）、H2O含量（重量百分比）和K含量（重量百分比）的Spearman等级相关矩阵的结果。数值表示相关系数，颜色强度表示相关性强弱（范围从-1.0到1.0）。每对数值都提供了P值。当P < 0.05时，相关性被认为是统计学上显著的。

**ZF3中水分和钾含量的影响**
基于其元素组成和水分含量，我们得到了具有相同晶体相Zn3[Fe(CN)6]2的ZF3系列的经验公式（表S4）。水分/K含量（重量百分比）与七个样品的选择性系数之间的关系进一步绘制在图2a中。值得注意的是，四种样品（ZF3-2、ZF3-4、ZF3-6和ZF3-8）的选择性系数为1，并且不含可检测到的大部分水分，而它们的钾含量有所不同。由于水分和钾含量呈正相关，我们使用交互图进一步可视化了它们的潜在相互作用（图S6）。使用三分位数方法将样品分为三类不同的钾含量（图S6）。对于这些不同的钾水平，S与H2O含量的线性趋势线相交，表明H2O和钾含量之间存在明显的相互作用（图S6）。然后，我们进行了多元线性回归分析，以研究H2O、钾含量及其相互作用对S的贡献（图2b）。交互项（β3）和水分系数（β1）都具有统计学意义，而仅钾的主效应（β2）则不显著。此外，截距（β0）非常显著，并且当水分和钾含量接近零时接近S的实际值。这些结果从统计学上表明，水分含量及其与钾的相互作用主导了ZF3的铜隔离选择性，而单独的钾含量仅具有最小的直接影响。

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**图2.** a) ZF3衍生样品的多维气泡图，显示水分含量（x轴）与钾含量（y轴）。气泡颜色（红色到蓝色）编码铜吸附选择性系数，气泡大小反映了锌/铁前体比例（0.1–10）。b) 多元线性回归分析。c) ZF3-2、ZF3-6和ZF3-14的高分辨率O 1s和b) Fe 2p XPS光谱。e) 不同样品（ZF3-2、ZF3-4、ZF3-6和ZF3-8）在两种不同铜浓度（1.5 mM和5 mM）下5分钟内的铜吸附率和锌及钾的释放率。f) 不同样品（ZF3-2、ZF3-4、ZF3-6和ZF3-8）在两种不同铜浓度下的铜吸附率与钾含量（重量百分比）的关系图。

然后，我们使用X射线光电子能谱（XPS）研究了具有明显水分和钾含量差异的Zn3[Fe(CN)6]2样品。选择了ZF3-2、ZF3-6和ZF3-14进行比较。O 1s光谱的去卷积分析显示，与ZF3-14相比，ZF3-2和ZF3-6中的结晶水比例有所减少，这与上述的水分含量结果一致（图2c）。Fe 2p光谱的去卷积分析表明，较高的Zn/Fe前体比例导致Fe2+/Fe3+比例逐渐下降，这在ZF3-2、ZF3-6和ZF3-14中都有体现（图2d）。相比之下，ZF3-2、ZF3-6和ZF3-14之间的Zn 2p光谱没有明显的位移（图S7）。因此，观察到的Fe价态变化本质上与Zn3[Fe(CN)6]2中的间隙K含量有关，这种K含量调节了Fe–CN框架的电荷分布，以维持晶体的中性（图S8）。此外，我们比较了样品（ZF3-2、ZF3-4、ZF3-6和ZF3-8）的Cu螯合性能，重点关注了容量、稳定性和离子交换速率。当暴露于5 mM Cu溶液中时，每种样品的吸附饱和度达到10 mg，Cu的去除率低于20%（图S9a）。ZF3-4、ZF3-6和ZF3-8的Cu吸附容量非常接近，约为0.9 mmol/g（图2e和图S9b）。值得注意的是，所有样品均未检测到Cu的释放，表明晶体框架在整个离子交换过程中保持稳定。相比之下，所有样品都显示出显著的Zn释放，进一步表明Cu螯合是由于晶格位点上的Zn–Cu交换引起的。此外，还检测到了K的释放。特别是，K的释放程度与样品本身的K含量呈正相关（图S10）。在四个样品中，只有ZF3-6显示其释放的正电荷（K+、Zn2+）与其吸附的Cu2+在数量上达到了平衡（图2e）。对于其他样品，我们推测间隙中的质子（H+）可能参与了离子交换过程，以维持电荷中性。这可能是由于在高Zn/Fe前体比例合成过程中产生的酸性环境，导致Zn2+的水解促进了H+进入最终晶体的间隙位点。然后，我们使用前5分钟的吸附曲线进一步评估了上述四个样品的初始Cu吸附速率，在两种Cu浓度（1.5 mM和5 mM）下进行测量。值得注意的是，含有最高K含量的ZF3-6表现出最快的Cu吸附速率，表明适当的间隙K+含量有利于Cu交换（图2f和图S11）。对于Zn3[Fe(CN)6]2晶体，我们发现间隙水和K+对晶格位点上的Zn-Cu交换具有关键调控作用。具体来说，较低的间隙水含量有利于提高Cu的选择性，而适量的K+则进一步促进了交换过程的速度。因此，ZF3是用于体内Cu螯合的理想候选物。

在ZF3中，我们通过熵驱动的Cu-Zn交换发现了ZF3-6（以下简称ZF3）作为口服Cu螯合的最有希望的候选物，并进行了全面的体外评估。首先，我们研究了水溶液中ZF3的浓度和质量对Cu去除的影响。在ZF3质量固定为10 mg的情况下，Cu浓度低于5 mM（远高于生理水平时），ZF3的最大Cu吸附容量约为0.8 mmol/g（图3a）。在这个范围内，ZF3能够完全（100%）清除Cu，无论Cu浓度如何，这强调了其适用于体内Cu螯合的能力（图3a）。在Cu浓度固定为5 mM时，增加ZF3的剂量显著提高了清除效率，表明Cu结合效率依赖于剂量（图3b）。通过监测Cu和Zn的浓度变化，进一步研究了ZF3的Cu-Zn交换动力学。在最初的200分钟内，Cu的螯合迅速发生，同时Zn的释放也随之增加，表明Zn–Cu交换在晶体表面快速启动（图3c）。过了这个阶段，交换过程变得更加缓慢（图3c）。

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图3. a) 不同Cu浓度下ZF3的Cu去除性能。b) ZF3对Cu去除的质量效应。c) ZF3的Cu-Zn交换动力学曲线。d) ZF3和ZF3-Cu的高分辨率Fe 2p XPS光谱和e) 粉末XRD图案。f) 单个ZF3颗粒的代表性SEM图像及其对应的EDS元素映射结果。g) Zn3[Fe(CN)6]2和Cu3[Fe(CN)6]2的预测形成能量（数据来自Materials Project）。h) ZF3中Zn–Cu离子交换的ln K与1/T的Van’t Hoff图，显示了焓（ΔH°）和熵（ΔS°）的变化。

然后，我们使用X射线光电子 spectroscopy（XPS）研究了Cu螯合前后ZF3的表面化学状态。选择了Zn-Cu交换后的ZF3（约10%的Zn被Cu替代）进行比较，此后将其称为ZF3-Cu。ZF3-Cu的XPS调查光谱显示出与原始ZF3不同的Cu 2p峰，表明Cu通过离子交换被缩合进来（图S12）。此外，Cu–Zn离子交换还导致Fe 2p、Zn 2p和O 1s峰向更高的结合能方向移动（图3d和图S13）。去卷积分析显示，Cu掺入后Fe2+/Fe3+的比例降低，这可能是由于Cu进入晶格引起的局部电子重分布（图3d）。O 1s光谱的去卷积分析表明结晶水增加，表明水中的Cu-Zn交换也改变了ZF3框架的水合状态（图S13a）。PXRD图案进一步证实了ZF3-Cu中存在两种不同的Cu3[Fe(CN)6]2峰值，证实了Zn和Cu的晶格交换（图3e）。有趣的是，拉曼和FTIR光谱显示ZF3和ZF3-Cu之间的CN伸缩区域没有明显变化（图S14）。SEM图像显示，Cu掺入后ZF3的整体立方形形态和微米级颗粒大小基本保持不变（图S15）。EDS元素映射结果显示组成元素分布均匀（图S16），包括ZF3-Cu中的Cu（图3f和图S17），表明Zn–Cu交换在晶体框架内的晶格位点上均匀进行，没有引起形态崩溃或第二相的形成。

此外，我们研究了ZF3中的Zn-Cu交换的热力学方面。参考Materials Project数据库中基于密度泛函理论（DFT）计算出的晶体形成能量数据，我们发现从Zn3[Fe(CN)6]2到Cu3[Fe(CN)6]2的假设转变是一个吸热过程，表明完全的晶格转化需要额外的能量输入（图3g）。然后，我们在不同温度下进行了Zn-Cu交换实验，并使用Van’t Hoff方程拟合数据以确定熵和焓的变化。如图3h所示，ZF3的晶体转变特征是正的焓变（ΔH° > 0）和正的熵变（ΔS° > 0），表明离子交换过程是由熵驱动的。计算得到的Gibbs自由能（ΔG° = ΔH° – TΔS°）表明，在359.6 K以上，假设的完全转化为Cu3[Fe(CN)6]2在热力学上是可行的（图S18）。重要的是，这个阈值并不意味着Zn–Cu交换不能在更低温度下发生。实际上，在生理温度范围内，ZF3的Zn–Cu交换以低于1的平衡常数（K）进行，而不会导致Zn3[Fe(CN)6]2的完全晶体转化。从经典热力学的角度来看，这种离子交换反应主要是由熵驱动的，系统无序的增加源于Cu进入晶格后的构型熵增益以及Zn2+离子释放到溶液中的混合熵。此外，动力学因素以及非理想性如离子强度、水合效应和晶格缺陷也可能促进了可观察到的离子交换。我们将含有Cu的ZF3浸入5 mM Zn溶液中，未检测到Cu的释放，这表明嵌入晶格中的Cu非常稳定，不会发生逆向交换，从而支持其适用于体内Cu螯合（图S19）。

然后，我们在体外模拟的胃肠道液体中评估了ZF3的稳定性和Cu螯合性能，以进一步预测其在体内的行为。PXRD结果显示，在模拟的肠液中（FeSSIF）以及连续浸泡在模拟胃液中（SGF）后再暴露于FeSSIF后，ZF3的晶体结构保持不变（图S20a）。在SGF中，随着pH值的增加，ZF3的Cu去除效率有所下降（图S20b）。在FeSSIF中，ZF3仍能有效螯合Cu（图S20b）。这些结果进一步证明了ZF3在体内生理胃肠条件下螯合Cu的潜力。

为了进一步研究ZF3作为肠道限制性Cu结合剂的生物安全性、生物分布和消除特性，我们首先使用正常SD大鼠评估了口服ZF3的生物安全性和生物分布情况（图4a）。在七天的观察期间，大鼠体重没有显著变化（图S21）。第7天，全血细胞计数（CBC）分析显示ZF3对大鼠的白细胞计数（WBC）、红细胞计数（RBC）和其他血液指标没有显著影响（图S22）。此外，作为ZF3的主要成分，Zn和Fe在口服七天后大鼠血清中的含量也没有显著增加（图4b）。同样，血清中其他主要金属元素（包括Cu）的水平也保持不变（图4b）。

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图4. 口服ZF3的生物安全性、生物分布和体内追踪。a) 体内评估ZF3生物安全性和生物分布的实验设计和时间线。b) 第7天大鼠血清中的元素水平。c) 第7天大鼠主要器官中的Zn和Fe含量（μg/g）。d) 第7天大鼠胃肠道内容物的粉末X射线衍射图案。e) 第7天大鼠胃、小肠和大肠的H&E染色组织学图像。比例尺 = 200 μM。f) 使用微XRF成像进行口服ZF3体内追踪的实验设计和时间线。g) 口服ZF3后不同时间点大鼠大肠的微X射线荧光（μ-XRF）元素（Zn、Fe、Cu）图谱。h) 口服ZF3后24小时内大鼠主要器官（心脏、肝脏、脾脏、肺和肾脏）及排泄粪便的微X射线荧光（μ-XRF）元素图谱。热图颜色表示相对元素强度，红色代表高元素富集区，深色代表低信号区。空间分辨率：100 μm / 像素。i) 口服ZF3和含ZF3或不含ZF3的大鼠粪便的波长 dispersive X射线荧光（WDXRF）光谱。WDXRF光谱使用LiF（200）分析晶体测量。x轴表示衍射角（2θ，以度为单位），y轴表示相对强度（Kcps）。标注了感兴趣的元素（Fe、Zn、Cu）的特征峰。所有测量在相同条件下进行，允许跨组织对元素轮廓进行定性和半定量比较。

然后，我们进一步量化了大鼠主要器官（包括心脏、肝脏、脾脏、肺和胃肠道（GI）中上述金属元素的含量（μg/g）。正如预期的那样，口服ZF3七天并未导致任何检测器官中Zn或Fe的显著积累（图4c）。此外，Zn和其他宏量元素（Na、K、Ca和Mg）在ZF3处理后的大鼠器官中的含量也没有显著变化（图S23）。对每组中的一只大鼠进行PXRD分析进一步确认ZF3没有在肝脏、脾脏、肾脏和胃肠道组织中沉积晶体（图S24）。

宏观检查显示，ZF3处理组与空白组在胃肠道方面没有明显差异（图S25）。然后，我们使用X射线荧光光谱和PXRD分析了胃肠道内容物的成分。然而，在ZF3处理大鼠的胃肠道内容物中没有发现明显的ZF3晶体图案（图4d）。值得注意的是，在胃肠道内容物中检测到了Zn和Fe的升高信号（Kα和Kβ）（图S26）。相比之下，ZF3在胃肠道内容物中的信号增强明显高于肝脏和胃肠道组织中的信号增强（图S26）。在胃肠道内容物中还检测到Cu信号的轻微增加（Kα），这也高于肝脏和胃肠道组织中的信号增强（图S27）。上述结果表明，由于其不溶性的晶体性质，ZF3在口服给药后主要停留在胃肠道腔内。ZF3能够在胃肠道内容物中与Cu结合，这些内容物的组成受到微生物、饮食和宿主因素的影响而多样化。正如预期的那样，ZF3不会影响正常大鼠的系统性金属平衡，因为它们的金属离子调节途径没有受到损害。此外，组织学检查显示，在ZF3给药后大鼠的主要器官没有出现病理变化（图S28）。作为ZF3的直接接触部位，胃肠道（胃、小肠和大肠）保持了腺体完整性、绒毛形态和隐窝结构，没有坏死、溃疡或炎症细胞浸润的迹象（图4e），这表明ZF3被胃肠道组织良好耐受，具有良好的口服安全性。然后，我们进一步使用微X射线荧光（μ-XRF）成像技术追踪口服给药的ZF3，以揭示ZF3的消除动态。五只正常大鼠口服相同剂量的ZF3（90 mg/kg），并在不同时间点进行μ-XRF成像（图4f）。在给药后1小时、2小时和4小时，Zn和Fe的信号主要位于小肠（图S29），而在给药后8小时，这些信号则在大肠中更为明显（图4g）。值得注意的是，其他元素（Cu、Ca、Mg、K和Na）在肠道内的分布随时间没有显著变化（图S29-30）。这些结果进一步表明ZF3不会被胃肠道吸收，而是通过胃肠道腔排出。在给药后24小时，Zn和Fe的信号主要存在于粪便中，其浓度显著高于胃肠道和主要器官中的信号（图4h），表明ZF3可以通过粪便排出。由于粪便排泄是大鼠Ca的主要排泄途径，Ca信号也表现出相同的分布特征（图S31）。相比之下，K信号主要均匀分布在胃肠道和主要器官中，其浓度显著高于粪便中的浓度，证实KF3不会影响K的主要尿液排泄（图4h）。正如预期的那样，Cu信号也主要存在于粪便中，确认其是Cu的主要排泄途径。不同器官中Cu信号的变化与前述ICP结果一致，表明ZF3不会改变正常大鼠的Cu平衡（图4h）。随后，进一步使用X射线荧光光谱法检测大鼠粪便和ZF3中的元素信号，以定量分析ZF3通过粪便的排泄情况。在禁食12小时后收集的粪便中，ZF3处理组的Zn、Fe和Cu信号明显高于空白组，进一步证实了ZF3在肠道中的积累和通过粪便的排泄（图4i）。对于口服给药的ZF3样本，粪便中的Zn信号强度约为给药后收集的粪便中的两倍，而Fe信号接近粪便中的水平。这表明ZF3在胃肠道中发生了Zn–Cu离子交换，并且在24小时内大部分被排出，这与μ-XRF成像显示的胃肠道信号显著低于粪便的结果一致。通过ICP-OES测量了粪便中的元素含量（μg/g）。在ZF3口服给药后24小时内，大鼠粪便中的Zn和Fe水平显著高于对照组，进一步表明ZF3是通过粪便排出的（图S32）。

**ZF3与FDA批准药物的体内比较：**我们进一步对ZF3与FDA批准的药物进行了体内评估，包括Cu螯合剂（三乙烯四胺）和醋酸锌。首先，我们通过腹腔注射CuSO4（8 mg/kg）建立了正常SD大鼠的Cu过载模型（图5a）。在这个模型中，我们重点比较了三乙烯四胺（TETA）和ZF3在体内消除过量Cu的表现，尤其是在血液和肝脏中的效果，并进一步验证了ZF3通过肠道的Cu排泄途径。在四天的观察期间，腹腔注射CuSO4引起了大鼠的严重急性毒性，导致第二天有兩只大鼠死亡（图5b）。相比之下，TETA和ZF3处理的大鼠在整个实验过程中都存活（图5b）。与其它组相比，对照组大鼠的体重也显著下降（图S33）。

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**图5. ZF3与FDA批准药物的体内比较：**
a) 使用急性Cu过载大鼠模型进行ZF3与FDA批准Cu螯合剂（TETA）体内比较的示意时间线和实验设计（n = 7）。
b) 在四天的观察期间，不同组大鼠的存活率（%）。
c) 第1天腹腔注射CuSO4后1小时，不同组大鼠血清中的Cu和Zn含量（μg/mL）。
d) 第4天，不同组大鼠肝脏中的Cu和Zn含量。
e) 第4天，不同组大鼠肾脏中的Cu和Zn含量。
f) 第4天，不同组大鼠血液中的尿素氮（BUN）、肌酐（CREA）、碱性磷酸酶（ALP）和丙氨酸氨基转移酶（ALT）水平。
h) 第4天，不同组大鼠肝脏组织的苏木精-伊红（H&E）染色。
i) 使用微XRF成像进行胃肠道中Cu体内追踪的示意时间线和实验设计。
j) 口服ZF3后1小时，大鼠小肠段（图S37中的白色框）的微X射线荧光（μ-XRF）元素（Zn、Fe、Cu）图谱。热图颜色表示相对元素强度，红色代表高元素富集区域，深色代表低信号区域。空间分辨率：100 μm/像素。
k) 使用ATP7B-/-小鼠模型进行ZF3与FDA批准醋酸锌（ZA）体内比较的示意时间线和实验设计（n = 4）。
l) 第3天，不同组小鼠的血清Cu水平。
m) 第1天腹腔注射CuSO4后1小时，不同组小鼠之间的血清Cu水平比较。
相比之下，TETA和ZF3有效抑制了血清Cu的水平上升（图5c）。然而，只有TETA导致了大鼠血清Zn的下降（图5c）。令人惊讶的是，腹腔注射CuSO4还导致血清Fe的严重下降（图S34），这种现象并未被TETA和ZF3缓解。第2天，TETA和ZF3都没有维持稳定的Cu降低效果（图55）。值得注意的是，除了血清Fe下降外，腹腔注射CuSO4还导致第2天和第4天血清Zn水平显著下降（图S35-36）。然而，TETA并未缓解Cu引起的血清Zn下降。相比之下，ZF3有效稳定了血清Zn水平（图S35–36）。有趣的是，ZF3和TETA在第4天恢复了Cu引起的血清Fe水平下降（图S36）。另一方面，血清K水平在不同组之间没有显著差异（图S34-36）。

然后，在第4天收获大鼠的肝脏和肾脏。由于肝脏是协调Cu运输、储存和排泄的关键器官，CuSO4注射后肝脏出现了显著的Cu过载，伴随着肝脏重量的显著减轻（图5d和图S37a）。此外，肝脏Cu过载还导致肝脏中Zn水平的上升。ZF3和TETA均减轻了肝脏Cu过载以及相关的Zn增加（图5d）。值得注意的是，TETA将肝脏Cu水平恢复到接近空白组的水平（图5d），而ZF3显著防止了肝脏重量的下降（图S37a）。与血清Fe不同，肝脏Fe水平在各组之间基本保持不变（图S37b）。血清和肝脏Cu水平的相关变化证实了腹腔注射的Cu迅速被吸收到血液循环中并迅速在肝脏中积累。迅速升高的肝脏Cu超出了肝脏的胆汁排泄能力，从而建立了肝脏Cu过载模型。据报道，金属硫蛋白（MT）在肝脏中上调以解毒过量的Cu，但也导致MT对Zn的螯合，从而导致Zn从血液循环重新分布到肝脏[32]。观察到的血清Fe下降可能归因于Cu过载引起的铜蓝蛋白活性改变，这损害了铁的动员和利用[33]。ZF3在某种程度上缓解了这些Cu过载引起的离子平衡紊乱，效果与TETA相当。值得注意的是，尽管两种药物在恢复肝脏Zn水平方面效果相似，但ZF3在维持血清Zn平衡方面表现出明显的优势。这可能归因于TETA的螯合选择性较差，它也促进了Zn的排泄，从而导致血清Zn水平持续低于正常值。此外，ZF3在肠道中的离子交换没有导致血清K水平的明显波动。

**相比之下，Cu注射没有引起肾脏Cu或Zn水平的显著变化，但导致了肾脏重量的显著下降，这种情况被ZF3和TETA所缓解（图5e和图S37c）。然而，只有TETA导致了肾脏Cu水平的严重下降，同时肾脏Zn水平上升（图5e），这可能是由于其强烈的螯合能力及其全身分布和尿液排泄作用。总体而言，ZF3在肠道中的选择性Cu结合避免了全身和远端离子平衡的紊乱，显示出相对于TETA的明显优势。**

除了离子平衡外，我们还在第4天进行了血清生化测试和肝脏组织学检查。Cu过载导致血液尿素氮（BUN）和肌酐（CREA）水平不同程度的升高，这两种情况都被TETA和ZF3有效缓解，使其恢复到接近正常水平（图5f）。对于肝功能指标，天门冬氨酸氨基转移酶（AST）和白蛋白（ALB）水平在组间没有显著差异（图S38）。Cu过载仅导致碱性磷酸酶（ALP）水平显著下降，表明肝细胞损伤严重，可能影响胆汁分泌（图5g）。正如预期的那样，TETA和ZF3均恢复了ALP水平。令人惊讶的是，TETA导致丙氨酸氨基转移酶（ALT）水平显著上升，显示出TETA可能具有肝毒性（图5g）。此外，对照组大鼠肝脏组织的苏木精-伊红（H&E）染色显示明显的组织病理学变化，包括肝细胞肿胀、肝小叶结构紊乱和窦状血管扩张，表明Cu过载引起的急性肝损伤（图5g）。相比之下，TETA处理组肝脏组织没有明显的组织学改善。值得注意的是，ZF3表现出优于TETA的肝脏保护作用，将其恢复到接近正常水平，仅有偶尔的轻微空泡，没有显著的坏死或炎症。这些结果进一步表明，尽管TETA能够缓解全身Cu过载，但它可能会加剧肝脏损伤。鉴于此，ZF3在保护肝脏功能和肝脏组织方面优于TETA。

然后，我们使用μ-XRF成像技术进一步揭示了上述Cu过载模型中ZF3的肠道限制性效应（图5i）。在CuSO4注射和ZF3口服给药后1小时，ZF3处理大鼠的小肠上部主要分布有Fe和Zn信号，其浓度显著高于对照组，表明ZF3存在于肠道中（图S39）。此外，ZF3组的小肠Cu信号在整个小肠中都高于对照组。具体来说，在ZF3组中，表现出最高锌（Zn）和铁（Fe）信号的肠段与其他组相应的肠段相比，也显示出最强的铜（Cu）信号，并且这三种信号之间存在明显的空间重叠（图5j）。我们还在ZF3给药后24小时收集了大鼠的大肠样本，用于μ-XRF成像。我们观察到ZF3处理组中的Cu信号比对照组更强，尤其是在盲肠区域。同时，ZF3处理组中的Zn和Fe信号也显著高于对照组（图S40a）。总体而言，这些结果进一步证明了口服ZF3通过直接隔离肠道中的Cu来减少全身Cu负担，并促进了循环Cu向肠腔的转移[34]。此外，通过ICP-OES测量了ZF3给药后24小时大鼠胃肠道和粪便中的元素水平（μg/g），发现ZF3处理组和对照组之间的Cu水平没有显著差异（图S40b）。相比之下，ZF3处理组粪便中的Zn、Fe和Cu水平均显著高于对照组（图S40c–e）。这些结果证实ZF3以肠道受限的方式隔离Cu，并促进其通过粪便排出，从而实现了对Cu过载大鼠的Cu降低效果。

最后，我们使用了缺乏ATP7B的小鼠（这些小鼠完全不能通过胆汁排泄Cu），并通过灌胃给予CuCl2以模拟饮食中的Cu积累。然后使用该模型比较ZF3和醋酸锌在抑制胃肠道Cu吸收方面的效果（图5k）。在整个实验过程中，所有组的体重均没有显著变化（图S41）。连续三天口服CuCl2导致对照组在第3天的血清Cu和Zn水平显著升高（图5l和图S42a）。正如预期的那样，醋酸锌进一步升高了血清Zn水平（图S42a）。虽然ZF3和醋酸锌都减缓了血清Cu水平的上升，但ZF3的效果更为显著（图5l）。与醋酸锌不同，ZF3没有导致血清Zn水平进一步升高（图S42a）。此外，各组之间的血清Fe水平没有差异（图S42b）。值得注意的是，ZF3处理组在第3天的血清Cu水平也显著低于第0天（图5m）。理论上，醋酸锌主要通过Zn和Cu竞争肠细胞中的共享转运蛋白来抑制肠道Cu的吸收，这通常需要长期给药才能达到临床效果。相比之下，我们的ATP7B缺乏小鼠模型表明ZF3通过直接和选择性地结合胃肠道中的Cu来更有效地抑制Cu吸收，而不会干扰其他离子的稳态。

总体而言，与FDA批准的药物相比，ZF3独特的肠道限制性、选择性Cu隔离机制不仅直接抑制了饮食中的Cu吸收，还促进了体内多余Cu的肠道排泄，且没有明显的副作用，这突显了其转化应用的潜力。

**结论**

本研究重新探讨了普鲁士蓝类似物（PBAs），揭示了基于锌的PBAs中由熵驱动的、受水合作用调节的晶格位点替换现象，以实现口服铜的隔离。通过与普鲁士蓝（PB）的筛选和比较，我们发现了一种三角形的、基本上无水的Zn3[Fe(CN)6]2相（ZF3），该相能够选择性地替代Cu，而不受其他生理相关离子的干扰，这与用于能量储存或解毒应用的常规间隙位点占用方式不同。从机制上看，水分含量是Cu选择性的主要决定因素，而间隙中的K离子通过调节交换动力学起次要作用。Cu插入晶格的过程是由熵驱动的，这使得Cu隔离非常稳定，从而限制了其生物活性。

在正常大鼠中，我们确认口服ZF3不会被肠道吸收，并通过粪便排出，同时促进了Cu的粪便排泄。在Cu过载大鼠和缺乏ATP7B的小鼠中的体内评估表明，口服ZF3有效减少了全身和肝脏中的Cu积累，并且在维持Zn稳态、保护肝脏和抑制肠道Cu吸收方面优于FDA批准的药物，如三乙撑四胺和醋酸锌。

这项工作的亮点在于建立了一种肠道受限的、不可吸收的Cu隔离剂，它利用了PBAs的可调晶格结构，为管理Cu相关疾病（如威尔逊病、阿尔茨海默病、动脉粥样硬化和癌症）提供了可行的替代方案。这种方法不仅改善了现有螯合剂的局限性（例如选择性差、全身副作用和神经风险），还将PBAs的用途扩展到了电池和解毒剂之外的体内离子管理领域。尽管取得了这些进展，但仍存在一些局限性，包括依赖于可能无法完全模拟人体胃肠道动态或长期慢性Cu过载情况的临床前模型。

总之，这项工作展示了通过结构工程实现PBAs体内隔离的潜在能力，并为PBAs作为相关疾病中失调离子的体内管理平台铺平了道路。

**CRediT作者贡献声明**

张诗怡：撰写 – 审阅与编辑、监督、资源管理、项目行政、资金获取。
程远：方法学研究。
赵欣：实验研究。
向亮：实验研究。
吴宇国庆：方法学研究。
刘天志：撰写 – 审阅与编辑、原始草稿撰写、可视化、验证、方法学研究、实验研究、资金获取、形式分析、数据管理、概念化。
肖姚：原始草稿撰写、可视化、验证、方法学研究、实验研究、形式分析、数据管理、概念化。
崔晓琳：方法学研究、实验研究。
唐 Futao：方法学研究、实验研究。

**利益冲突声明**

作者声明没有利益冲突。

**数据可用性声明**

本研究生成的所有数据均可根据请求提供，没有任何限制。所有数据均包含在主文本或补充材料中。