从仙人掌（Opuntia ficus-indica）叶片提取物中制备的烧伤愈合外用膏：体内、体外及计算机模拟研究

《Materials Today Communications》：Opuntia ficus-indica Leaves Extract-Derived Topical Cream for Burn Healing: In Vivo, In Vitro, and In Silico Studies

　　伊布蒂萨姆·莱布 | 吉哈内·莱格德姆斯 | 拉尼娅·杜迪 | 迪瓦·图尔基亚·布特拉 | 尤瑟夫·贝纳伊萨 | 卡乌拉·塞格尼 | 埃尔哈夫纳维·拉内兹 | 基莱夫·亚希亚 | 艾利·阿尔萨尔梅 | 米凯尔·贝切兰尼 | 艾哈迈德·巴尔胡姆
阿尔奥韦德大学生物学系，细胞与分子生物学专业，阿尔奥韦德，39000，阿尔及利亚

**摘要**
烧伤仍然是一个重大的全球健康挑战，通常伴随着组织再生缓慢、微生物感染和炎症反应失调等问题，因此需要开发安全且多功能的治疗策略。在本研究中，基于仙人掌（Opuntia ficus-indica，简称OFI）叶提取物的外用制剂被开发出来，并通过综合的植物化学特性分析、生物评估和计算模拟对其烧伤伤口愈合效果进行了全面评估。液相色谱-质谱（LC–MS）分析结果显示，阿魏酸、儿茶素、没食子素-3′-鼠李糖苷和槲皮素-3-阿拉伯糖苷是主要的生物活性成分。该提取物表现出显著的抗氧化活性（DPPH半数有效浓度IC?? = 432.42 μg/mL）、强烈的抗炎潜力（IC?? = 629.71 μg/mL）、轻微的抗菌效果以及可测量的光保护能力（SPF = 8.34）。含有5%、10%和20% OFI提取物的外用膏霜在体外实验中显示出了良好的物理化学稳定性、生物相容性和无皮肤刺激性。在大鼠模型中的体内烧伤实验表明，10.0% OFI制剂在第21天时实现了约90%的伤口收缩率，超过了凡士林（Vaseline?）和MEBO?的效果（分别为65%和85%）。血液学指标表明恢复了生理平衡，而组织病理学分析证实了上皮再生的加速、胶原沉积的优化以及炎症细胞浸润的减少。分子对接分析进一步证明了OFI植物成分与参与炎症和组织重塑的关键分子靶点（包括COX-1、COX-2、MMP-9和TNF-α）之间的有利结合亲和力，为观察到的治疗效果提供了机制支持。这些发现表明OFI叶提取物是一个有前景的多功能生物活性平台，具有很高的转化潜力，可用于烧伤伤口的管理和治疗创新发展。

**1. 引言**
烧伤是最严重的创伤形式之一，由于其高发病率、死亡率和长期并发症而成为全球主要的健康问题[1]。根据世界卫生组织的数据，每年约有18万人因烧伤而死亡。这些损伤会破坏皮肤屏障，导致体液丢失、感染、伤口愈合延迟和生活质量下降[1]。伤口愈合过程分为四个相互重叠的阶段：止血、炎症、增生和重塑[2]。最初，血小板聚集和血栓形成会释放生化介质启动组织修复，随后是炎症细胞的招募、血管生成、成纤维细胞激活、胶原沉积和上皮再上皮化。基质金属蛋白酶（MMPs）在细胞外基质（ECM）的更新中起着关键作用；然而，它们的过度表达会损害胶原成熟，延长炎症过程，并最终延迟伤口闭合[3]。因此，有效的烧伤管理需要同时促进组织再生并减轻氧化应激、炎症和ECM失调的治疗方法[4]。
药用植物长期以来在传统医学中用于伤口治疗，许多物种已被科学验证具有抗氧化、抗炎、抗菌和组织再生特性[5]。姜黄（Curcuma longa）、积雪草（Centella asiatica）、芦荟（Aloe barbadensis）、印楝（Azadirachta indica）和菊苣（Chamomilla recutita）的提取物显示出显著的伤口愈合效果，其中一些已被纳入商业制剂中，如MEBO?。然而，寻找安全、多功能、源自植物的治疗药物以应对烧伤的复杂病理生理学问题仍在进行中。仙人掌（Opuntia ficus-indica，简称OFI）是一种原产于墨西哥并广泛分布于地中海地区、北非、中东和其他干旱环境的仙人掌物种，具有重要的农业、生态和药用价值[11]。除了其营养价值外，OFI还含有丰富的生物活性成分，包括嫩枝、果肉和果皮、花朵和种子，其中含有多酚、黄酮类、甜菜碱、维生素、固醇和多糖，这些成分赋予了多样的药理活性[12]。
最近的研究强调了OFI的广泛治疗潜力。来自不同植物部位的提取物表现出抗氧化、抗炎、伤口愈合、肝保护、抗癌、降胆固醇和抗肥胖等多种活性[13]。此外，还具有胃保护、抗溃疡作用，以及神经保护、镇静、镇痛、抗焦虑、抗菌和抗病毒特性[14]。关于OFI花朵的积极效果还包括对骨骼健康、心血管功能、肾脏保护和认知功能的改善。对OFI花朵的研究发现其具有强大的抗氧化、抗菌和抗癌活性，这些发现得到了体外研究和网络药理学分析的支持，最近的综述也强调了其在医学、营养和化妆品中的应用[15]。传统上，OFI花朵被用于治疗痔疮、消化系统疾病、慢性结肠炎、腹痛、肾脏疾病和腹泻，同时还具有利尿作用和对抗胃溃疡的保护效果。值得注意的是，仙人掌黏液是一种亲水性多糖复合物，具有很高的保水能力，可能进一步增强伤口愈合潜力。伊梅恩·阿马尔等人（2015年）报告了OFI花朵提取物的抗氧化、抗菌和体内皮肤伤口愈合活性，突显了这一物种的治疗潜力[11]。
尽管OFI具有广泛的药理潜力，但其在外用烧伤伤口管理中的应用仍不够充分。大多数先前的研究仅关注其单一的抗氧化或抗菌效果，缺乏全面的体内验证和机制研究。目前现有的烧伤疗法往往价格昂贵，伴随着感染风险，并可能导致愈合延迟或疤痕形成，这凸显了需要更安全、更有效的植物基替代品的需求。因此，本研究对含有OFI叶提取物的外用膏霜进行了全面评估，确定了主要生物活性成分，并评估了其抗氧化、抗炎、抗菌、溶血和紫外线保护作用。随后在大鼠烧伤模型中评估了含有5%、10%和20%提取物的膏霜效果。关键的治疗结果包括伤口收缩、血液学恢复以及组织病理学参数，如上皮再上皮化、胶原沉积、炎症调节和组织重塑。此外，还进行了计算机分子对接和网络药理学分析，以阐明主要植物成分与相关分子靶点（包括COX-1、COX-2、MMP-9和TNF-α）之间的相互作用。总体而言，综合的植物化学、生物学、体内和计算结果表明，基于OFI叶提取物的膏霜是一种安全、多功能且具有前景的天然治疗策略，有助于改善烧伤伤口愈合和皮肤再生，填补了当前烧伤护理方法中的关键空白。

**2. 实验**
2.1. 化学品和试剂
稀氨水（NH?OH，25%）、氯化铝（AlCl?，≥ 98%）、槲皮素（C??H??O?，≥ 95%）、十二烷基硫酸钠（SDS，C??H??NaO?S，≥ 99%）、二甲基亚砜（DMSO，C?H?OS，99.9%）、2,2-二苯基-1-吡克罗联（DPPH，C??H??N?O?，≥ 95%）、抗坏血酸（维生素C，C?H?O?，≥ 99%）、没食子酸（C?H?O?，≥ 98%）、氯仿（CHCl?，≥ 99%）、迈尔试剂、瓦格纳试剂、氯化铁（FeCl?，≥ 98%）、硫酸（H?SO?，98%）、福林-西奥卡尔特试剂（H?PW??O?? + H?PMo??O??）、盐酸（HCl，≥ 37%）、三氯乙酸（TCA，CCl?COOH，≥ 99%）、氰化铁钾（K?[Fe(CN)?，≥ 99%）、碳酸钠（Na?CO?，≥ 99%）、甲醇（CH?OH，≥ 99.9%）、磷酸钠（Na?PO?，≥ 98%）、磷酸盐缓冲液（NaH?PO?/Na?HPO?，pH 7.4）、磷酸钼（H?PW??O??）、氯化铝（AlCl?，98-99%）、七钼酸铵四水合物（(NH?)?Mo?O??·4H?O，≥ 99%）和乙二胺四乙酸（EDTA，C??H??N?O?，99.0%）。所有用于本研究的化学品和试剂均为分析级，购自Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）。
2.2. 细菌菌株
本研究使用了来自阿尔及尔巴斯德研究所的细菌菌株：铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa，ATCC 27853）、金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，ATCC 25923）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis，ATCC 25973）、肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae，ATCC 13885）和（ATCC 25922）。菌株在37 ± 1 °C的营养琼脂上恢复后，在37 °C的Mueller–Hinton培养基中培养18–20小时，并进行摇摆培养（150 rpm）。悬浮液被稀释至0.5 McFarland浓度（10? CFU/mL）用于抗菌实验。庆大霉素（10 μg/盘）作为阳性对照，5% DMSO作为阴性对照。
2.3. OFI叶片的采集
2024年8月，在阿尔及利亚东北部斯科克达的科洛（Collo，坐标36°52′22″N, 6°56′05″E）采集了新鲜的OFI叶片。清洗后，去除了刺和表皮层。一份凭证标本（编号PS/Op.fi 2014）被存入阿尔奥韦德大学生物学系的标本馆，并由合格的植物学家进行了鉴定。
2.4. 动物
从阿尔及尔巴斯德研究所获得了30只健康的成年雄性白化大鼠（体重185.64 ± 3.78克），并将它们安置在阿尔奥韦德大学生物与细胞生物学系的认可动物设施中。动物在标准实验室条件下饲养（22 ± 2 °C，55–60%湿度，12小时光照/黑暗周期），并可自由进食和饮水。实验前，大鼠接受了两周的适应期以减少压力。所有实验方案均符合机构和国际公认的实验室动物护理和使用指南，包括ARRIVE指南，并获得了阿尔奥韦德大学伦理委员会的批准（批准编号03/2025；伦理参考编号03/S.C/F.L.N.S/E.U/2025）。
2.5. 水提物制备
通过将10克新鲜叶片加入100毫升蒸馏水中匀浆，然后在50 °C下加热2小时，再在室温下浸渍24小时来制备O. ficus-indica叶片的水提物。所得混合物通过Whatman No. 1滤纸过滤，并使用旋转蒸发器在减压条件下浓缩。得到的半固体提取物称重以确定提取率，并在4 °C下储存，直到进一步进行植物化学和生物学分析[16]。提取率计算公式如下：
(1) 提取率(%) = (W1 / W2)
其中W1表示提取物的重量，W2表示干燥后的植物材料重量。
2.6. 植物化学筛选
使用标准定性检测方法对O. ficus-indica（OFI）水提物进行了初步植物化学筛选，以鉴定主要生物活性成分。具体包括：迈尔试剂和德拉根多夫试剂用于生物碱检测，辛诺达试剂用于黄酮类检测，氯化铁用于单宁检测，福林-西奥卡尔特试剂用于皂苷检测，萨尔科夫斯基试剂用于萜类检测，福林-西奥卡尔特方法用于酚类化合物检测，凯勒-基利亚尼试剂用于苷类检测。这些比色反应能够快速可靠地检测植物化学成分的存在（+）或不存在（?），从而提供提取物植物化学成分的初步概况[17]。
2.7. 定量植物化学分析
使用福林-西奥卡尔特方法检测O. ficus-indica叶片提取物的总酚含量（TPC），方法是将0.5毫升提取物（1毫克/毫升）与10%福林-西奥卡尔特试剂和7.5%碳酸钠混合，孵育30分钟，然后在765纳米处测量吸光度。结果以mg GAE/g表示，使用没食子酸校准曲线（0–200 μg/mL）进行换算。总黄酮含量（TFC）通过AlCl?方法测定，方法是将1毫升提取物与2% AlCl?混合，孵育30分钟，然后在430纳米处测量吸光度，使用槲皮素曲线（0–200 μg/mL）进行换算[18]。
2.8. LC–MS分析
使用超高效液相色谱-电喷雾电离串联质谱（UPLC–ESI–MS/MS）系统（Shimadzu LCMS-8040，日本京都）对O. ficus-indica（OFI）叶片提取物进行了表征，该系统配备了超灵敏度UFMS技术和Nexera XR LC-20AD二元泵。色谱分离在Restek Ultra C18柱（150 × 4.6毫米，颗粒大小3微米）上进行，温度维持在40 °C。流动相由溶剂A（含0.1%甲酸的水）和溶剂B（甲醇）组成，按照以下线性梯度程序进行：0–0.2分钟，98% A；0.2–2.5分钟，25% A；2.5–4.0分钟，0% A；4.0–7.0分钟，0% A；7.0–7.1分钟，98% A；7.1–12.0分钟，98% A，以实现柱子平衡。流速维持在0.2毫升/分钟，进样量为5微升。质谱检测采用电喷雾电离（ESI）方式，参数如下：碰撞诱导解离（CID）气体压力230 kPa；转换阳极电压?6.0 kV；脱溶剂线温度250 °C；加热块温度400 °C；雾化气体流量3.0升/分钟；干燥气体流量10升/分钟。
2.9. 抗氧化活性
使用2,2-二苯基-1-吡克罗联（DPPH）自由基清除实验评估了O. ficus-indica（OFI）叶片提取物的抗氧化活性，并进行了适当修改[19]。简要来说，将1毫升0.1毫摩尔的DPPH溶液与1毫升浓度介于25至500 μg/mL之间的提取物混合。抗坏血酸作为阳性对照，甲醇为空白对照。反应混合物在暗处摇匀并在25 °C下孵育30分钟，然后使用紫外-可见光分光光度计（Shimadzu UV-1800）在517纳米处记录吸光度。DPPH自由基清除率的百分比通过以下公式计算：
(2) 抑制百分比(%) = (Abscontrol / Abssample) × 100
其中Abscontrol是对照组的吸光度（所有试剂不含样品），Abssample是含有提取物的反应混合物的吸光度[20]。
使用奥亚伊祖方法（Oyaizu’s method）[21]及其修改版本评估了OFI叶片提取物的还原能力。将1毫升提取物（浓度25–500 μg/mL）与0.2 M磷酸盐缓冲液（pH 6.6）和1%氰化铁钾混合，在50 °C下孵育20分钟。在加入10%的三氯乙酸并以3000转/分钟的速度离心10分钟后，取2.5毫升上清液与水和0.1%的FeCl?混合，并在700纳米处测量吸光度。抗坏血酸作为阳性对照，较高的吸光度表示更强的还原能力。使用磷钼酸盐法测定OFI叶提取物的总抗氧化能力（TAC）。将0.2毫升提取液（1毫克/毫升）与2.0毫升试剂（0.6摩尔/升的硫酸、28毫摩尔/升的磷酸钠、4毫摩尔/升的钼酸铵）混合，在95摄氏度下孵育90分钟，然后冷却。在695纳米处读取吸光度，并以空白值为基准。TAC以毫克AAE/克的单位表示，通过抗坏血酸标准曲线（0-200微克/毫升）进行计算[19]。

2.10. 抗炎活性
通过卵白质变性实验评估了OFI叶提取物的抗炎潜力[19]。将含有0.2毫升卵白质（1%体积/体积）、1.4毫升磷酸盐缓冲液（pH 6.4）和0.5毫升提取物（100-800微克/毫升）的反应混合物在37摄氏度下孵育15分钟，然后在70摄氏度下加热5分钟以诱导变性。冷却后，使用岛津UV-1800分光光度计（日本京都）在660纳米处记录吸光度。阿斯匹林作为参考药物，蒸馏水作为空白对照。蛋白质变性的抑制百分比通过以下公式计算：
(3) 抑制蛋白质变性(%) = (A对照 - A样本) / A对照 × 100
其中A对照指的是对照（蒸馏水）的吸光度，A样本指的是在OFI存在下的吸光度。

2.11. 溶血活性
评估了OFI叶成分的溶血效应[22]。新鲜人血收集在EDTA管中，并以1500转/分钟的速度离心10分钟以分离红细胞。红细胞用PBS（pH 7.4）洗涤三次并重新悬浮为10%（体积/体积）的红细胞悬浮液。将不同浓度的测试样品（200微升）与100微升的红细胞悬浮液在微量离心管中混合。PBS作为阴性对照，0% SDS（重量/体积）作为阳性对照。混合物在37摄氏度下孵育60分钟并轻轻摇晃。孵育后，以1500转/分钟的速度离心5分钟，并使用岛津UV-1800分光光度计（日本）在540纳米处测量上清液的吸光度，以量化释放的血红蛋白。溶血百分比通过以下公式计算：
(4) 溶血(%) = (100 - A样本) / A对照 × 100
其中A对照指的是对照（PBS）的吸光度，A样本指的是在OFI存在下的吸光度。所有实验均重复三次以确保准确性和可重复性。

2.12. 防晒系数（SPF）
通过分光光度法测定OFI叶提取物的光保护活性，以确定其防晒系数（SPF）[23]。将提取物在甲醇中制备成1毫克/毫升的浓度以确保溶解性和一致性。使用UV-Vis分光光度计（岛津UV-1800，日本）在290-320纳米范围内以5纳米的间隔测量吸光度。Avene?防晒霜作为阳性对照，乙醇作为空白对照。SPF通过以下公式计算：
(5) SPF = CF × ∑(290-320) × EE(λ) × I(λ) × Abs(λ)
其中：CF为校正因子（10）；EE为波长（λ）纳米的辐射红斑效应；I为波长（λ）的光强度谱；DO(λ)为波长处的分光光度值。EE(λ) × I(λ)的值为常数。

2.13. 抗细菌活性
使用琼脂孔扩散法测试了OFI提取物对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌和小肠杆菌的抗菌活性。将标准化悬浮液（10? CFU/毫升）涂布在Mueller-Hinton琼脂上，每个孔中加入10微升提取物（25-200微克/毫升）。在37摄氏度下孵育24小时后，用数字卡尺测量抑制圈直径（毫米）。庆大霉素（10微克/毫升）作为阳性对照，5% DMSO作为阴性对照。实验重复三次，结果以平均值±标准差表示[24]。

2.14. 烧伤愈合霜的配方
制备了含有5%、10%和20%（重量/重量）OFI叶提取物的凡士林?基烧伤愈合霜。选择5%、10%和20% OFI提取物浓度是基于先前的研究结果，这些浓度与之前关于植物性外用制剂在烧伤和切除伤口模型中的研究结果一致[25]。将提取物在45°C的水浴中缓慢加入熔化的基质中，并不断搅拌直至获得均匀混合物。然后将霜冷却至室温，转移到无菌、密封的容器中，并在4°C下储存以供后续评估。使用MEBO?霜作为伤口愈合效果的参考标准[26]。

2.15. 物理化学和皮肤安全性评估
通过将1克霜分散在10毫升蒸馏水中，用Whatman No. 4滤纸过滤，并在20°C下使用校准的pH计（HANNA-HI 8424）测量三次pH值来确定霜的实施剂的pH值。通过在室温下以3000转/分钟的速度离心30分钟来评估稳定性，观察是否出现相分离、油分离或质地变化。稳定性评分从100%（完全稳定）到0%（不稳定），表示霜在评估期间保持质地、pH值和活性。使用Brookfield粘度计在25°C下测量粘度，以确保适合外用；通过将1克霜放在玻璃片之间并在100克下测量30秒内的扩散直径来测试延展性。根据OECD指南402评估急性皮肤安全性，将50毫克霜涂在剃光的雄性Wistar大鼠（150-180克）的4平方厘米背侧皮肤上。大鼠在标准条件下观察7天，检查是否有红斑、水肿或毒性。急性皮肤安全性评估还符合El Oued大学的IAEC批准程序。

2.16. 烧伤愈合霜的伤口愈合评估
成年Wistar白化大鼠在标准实验室条件下适应两周后进行实验。使用计算机生成的随机数序列（SPSS软件，版本26.0）将动物随机分配到六组（每组5只）。
• 治疗给药：负责烧伤诱导和局部应用的研究人员在分配过程中对组别分配不知情。
• 组织学分析：组织切片进行编码，由独立的技术人员在对治疗分配不知情的情况下对再上皮化、胶原沉积和炎症浸润进行评分。
• 血液学分析：血液样本在分析前匿名处理，所有测量均使用自动化分析仪进行，以消除操作者影响。
• 伤口面积测量：采用标准化的数字成像和软件辅助量化方法。

所有处理每天局部应用一次，从烧伤诱导后的第二天开始，持续21天，如表1所示。

2.16.1. 血液学参数
使用自动血液学分析仪（Medonic，Boule Diagnostics AB，瑞典）评估血液学参数，包括红细胞计数、Hb浓度、HCT、血小板计数和白细胞计数。

2.16.2. 组织病理学评估
皮肤组织固定在10%中性缓冲福尔马林中，通过分级乙醇系列脱水，用二甲苯澄清，包埋在石蜡中，切成5微米厚的切片，并用苏木精和伊红（H&E）染色。显微镜评估重点关注再上皮化、胶原沉积、炎症细胞浸润和组织结构。

2.17. 主要植物成分的分子对接
通过分子对接研究了OFI叶主要植物成分与参与伤口愈合、炎症和组织重塑的靶蛋白之间的相互作用。研究的植物成分包括阿魏酸、没食子素-3'-鼠李糖苷、儿茶素、核黄素、橄榄酸、香兰素和槲皮素-3-阿拉伯糖苷（PubChem CID：445858、65843093、9064、493570、10494、1183和10252339）。选定的蛋白靶标包括COX-1（PDB：3KK6）、COX-2（PDB：4PH9）、MMP-9（PDB：1GKC）和TNF-α（PDB：9OJS），这些信息来源于蛋白质数据库（https://www.rcsb.org/）。使用AutoDock Tools（v1.5.6）去除水分，添加氢原子并分配Kollman电荷，然后使用MMFF94力场最小化配体能量，并转换为PDBQT格式。使用AutoDock Vina（v1.1.2）进行对接，基于已知活性位点定义结合位点，并报告亲和力（单位为千卡/摩尔）。通过重新对接天然配体（RMSD < 2.0 ?）验证最稳定的构象，并分析相互作用（氢键、疏水接触、π–π堆叠、静电作用）[30]。

2.18. 统计分析
所有定量数据以平均值±标准偏差的形式呈现。在分析前确认数据的正态性和方差同性。使用单因素ANOVA评估总体组间差异。Tukey’s HSD事后检验用于所有治疗组之间的多重比较，而Dunnett’s t检验用于将每个治疗组分别与未经治疗的烧伤对照组（组I，NCT）进行比较。统计显著性阈值设定为p < 0.05。还进行了主成分分析（PCA）和层次聚类分析（HCA），以可视化变量之间的相关性并分类生物活性和治疗反应。

3. 结果与讨论
3.1. OFI提取物的产量和植物化学分析
OFI叶的水提取物产生了1.30%（重量/重量）的粗提物，富含多糖、黄酮类和甜菜碱等极性生物活性化合物，符合可持续绿色化学的原则[31]。植物化学筛选确认了生物碱、黄酮类、皂苷和强心苷的存在，而萜类、单宁、花青素和类固醇不存在（表2）。黄酮类和皂苷具有抗氧化、抗炎和伤口愈合作用，生物碱具有抗菌和镇痛效果，强心苷支持细胞保护和抗炎皮肤再生[32][33]。定量分析显示总酚含量为111.89 ± 1.39毫克GAE/克，黄酮含量为9.44 ± 1.02毫克QE/克干提取物，表明酚类是主要的抗氧化成分，其含量超过了水果中的水平（24-72毫克GAE/克），这归因于组织特异性代谢物的积累和新鲜叶片中热不稳定化合物的保存[34]。这些发现表明OFI叶是多功能植物化学物质的强大来源，非常适合用于增强皮肤保护、组织修复和抗氧化作用的外用制剂。

表2. OFI水提取物的植物化学筛选和分析。
| 植物化学化合物 | 存在 | 否存在 |
|-------------|---------|---------|
| 生物碱 | + | - |
| 黄酮类 | + | - |
| 茶素 | + | - |
| 茶皂苷 | + | - |
| 单宁 | - | - |
| 强心苷 | + | - |
| 花青素 | + | - |

3.2. 使用LC–MS对OFI叶提取物的植物化学分析
LC–MS/MS分析鉴定出22种不同的OFI（Opuntia ficus-indica）叶水提取物中的植物化学成分（表3），总检测峰面积为3,794,604任意单位，归一化为100%相对浓度。阿魏酸（21.4%）和没食子素-3-鼠李糖（17.3%）主要发挥抗氧化、抗炎和细胞保护作用，阿魏酸稳定胶原，没食子素-3-鼠李糖促进成纤维细胞生长和再上皮化[35]。核黄素（15.6%）、儿茶素（11.9%）和橄榄酸（11.7%）增强线粒体活性和组织氧合作用及再生，而香兰素（7.17%）和β-胡萝卜素（7.55%）具有抗菌和光保护作用[36]。槲皮素-3-阿拉伯糖（4.38%）和hispidulin（2.63%）提供自由基清除和抗炎支持，水杨酸（0.42%）减少刺激并调节角蛋白[37]。提取物的酚含量（60%相对面积）突显了其在受损皮肤中的抗氧化、稳定胶原和抗氧化应激的作用[38]。黄酮类、酚酸和萜类共同增强了OFI叶在烧伤伤口愈合制剂中的治疗潜力。

表3. 通过LC–MS鉴定的OFI叶水提取物的植物成分。
| ID | 公式 | ESI电荷 | 恢复时间 | 面积 | 相对浓度 (%) |
|--------------|----------------。|-----------------|-----------------|------------------|
| 儿茶素 | C15H14O6 | + | 137.97 | 342 | 22,219 |
| 菊酮-6-C-葡萄糖苷 | C21H20O9 | + | 257.8 | 168 | 3,593 |
| 没食子素-3-阿拉伯糖苷 | C20H18O12 | + | 138.0 | 15,96 |
| 没食子素 | C15H10O8 | + | 207.0 | 135 |
| 没食子素 | C27H30O17 | + | 446.9 | 261 |
| 奥雪林 | C16H12O5 | + | 227.3 | 151 |
| 核黄素 | C15H10O6 | + | 159.7 | 422 |
| 天竺葵素 | C15H10O4 | + | 337.1 | 122 |
| 木犀草素 | C16H12O6 | + | 106.8 | 93,46 |
| 香兰素 | C8H8O3 | - | 156.8 | 255 |
| 苯甲酸 | C8H8O3 | - | 171.2 | 244 |
| 苦杏仁酸 | C10H6O3 | - | 189.7 | 804 |
| β-胡萝卜素 | C40H56 | + | 197.2 | 626 |
| 水杨酸 | C7H6O3 | - | 171.2 | 268 |
| 咖啡酸 | C9H8O3 | - | 189.7 | 809 |
| 香草酸 | C9H8O3 | - | 171.2 | 255 |
| 香草醛 | C10H8O4 | - | 156.8 | 255 |
| 对香豆酸 | C8H8O4 | - | 189.7 | 809 |
| 水杨酸 | C7H6O3 | - | 177.0 | 680 |
| 二甲氧基苯酚 | C7H6O3 | - | 177.0 | 609 |

图1. OFI叶提取物中检测到的分子的化学结构。
图2. OFI叶提取物的LC-MS色谱图。抗氧化活性
使用DPPH自由基清除试验、还原能力和总抗氧化能力（TAC）测定法评估了OFI叶提取物的抗氧化潜力（图3，表S1），这些结果与其LC–MS植物化学成分谱（表3）有很强的相关性。该提取物含有高水平的黄酮类物质（如myricetin-3-rhamnose、catechin、quercetin-3-arabinose）、酚酸（如ferulic acid、vanillin、salicylic acid）、核黄素和β-胡萝卜素，这些成分有助于自由基清除、电子捐赠和脂质氧化防御。DPPH试验的IC??值为432.42 ± 2.51 μg/mL，表明其具有中等的自由基中和能力；而还原能力试验的EC??值为4620.13 ± 4.72 μg/mL，反映出其中等的电子捐赠能力[39]。通过磷酸钼法测得的TAC为71.55 ± 3.46 mg AAE/g提取物（表S1），显示出显著的总体抗氧化活性[40]。这些效果源于黄酮类、酚酸、类胡萝卜素和维生素的协同作用，它们通过氢/电子捐赠、金属螯合和自由基稳定等机制发挥作用。与仙人掌果皮相比（DPPH IC?? = 2600.82 μg/mL；还原能力 EC?? = 4744 ± 4.72 μg/mL），OFI叶片表现出更强的抗氧化性能，这与其LC–MS分析中更高的生物活性成分含量相符[41]。这些发现强调了该提取物在化妆品、皮肤病学和伤口愈合应用中的潜力，特别是在减轻氧化应激方面[42]。

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图3. OFI叶提取物的抗氧化活性。(a) DPPH自由基清除活性：提取物的IC??值与抗坏血酸的比较。(b) 还原能力：提取物的EC??值与抗坏血酸的比较。

3.4. 抗炎和溶血活性
使用蛋白质变构抑制试验评估了OFI叶提取物的抗炎潜力，其IC??值为629.71 ± 2.80 μg/mL，与阿司匹林（IC?? = 646.11 ± 3.21 μg/mL）相当（图4，表S1）。这种活性归因于LC–MS鉴定出的生物活性化合物，包括黄酮类（如quercetin、isorhamnetin衍生物、rutin）、酚酸（如caffeic、ferulic、gallic acids）和甜菜碱，这些成分共同稳定蛋白质并抑制炎症级联反应中的蛋白质变构[43]。黄酮类可能通过抑制环氧化酶（COX）和减少促炎细胞因子来调节炎症途径，而酚酸和甜菜碱则提供抗氧化作用，进一步抑制炎症[44]。先前的研究也证实了这些效果，突出了仙人掌属植物及其花提取物的抗炎活性[32] [45]。

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图4. OFI叶提取物的抗炎和溶血活性。(a) 抗炎活性：通过蛋白质变构抑制试验测得的提取物的IC??值与阿司匹林的比较。(b) 溶血活性：不同浓度提取物对红细胞溶血百分比与1% SDS（阳性对照）的比较。数据以平均值±标准偏差（n = 3）表示。

溶血试验证实了该提取物与红细胞的生物相容性，显示出的溶血作用轻微且依赖于浓度：在75 μg/mL时为2.47% ± 0.05，在125 μg/mL时为4.08% ± 0.09，在175 μg/mL时为8.11% ± 0.12（图4，表S1）。相比之下，SDS（阳性对照）诱导了40–49%的溶血，证实了该提取物出色的血液相容性[46]。低溶血活性是由黄酮类、酚酸和黏多糖通过相互作用实现的，它们与红细胞膜相互作用，降低氧化应激并稳定脂质双层，从而防止细胞裂解。OFI叶提取物的抗炎效能和血液相容性强调了其在外用制剂、化妆品或营养保健品中的安全性和治疗潜力[47]。

3.5. 光保护活性
对OFI叶提取物的光保护效果进行的评估显示，其防晒系数（SPF）为8.34 ± 1.2，与商业防晒霜Avene?（SPF 40.0 ± 1.4）相当，表明其具有可靠的天然紫外线屏蔽能力（图5，表S1）。这些结果与先前关于OFI籽渣的研究结果一致，后者也显示出相似的SPF值（8.36），证实了这种植物部位和提取方法之间的紫外线防护特性的可重复性[48]。LC–MS分析（表2）显示，该提取物富含黄酮类（如myricetin-3-rhamnose、catechin、quercetin-3-arabinose）、酚酸（如ferulic acid、vanillin、salicylic acid）、类胡萝卜素（β-carotene）和甜菜碱，这些成分共同吸收紫外线并中和紫外线暴露后产生的活性氧。这些化合物可防止皮肤脂质、蛋白质和DNA的氧化损伤，从而提供光保护[49]。此外，提取物的抗氧化和抗炎特性（通过DPPH、还原能力、总抗氧化能力和蛋白质变构试验验证）通过减轻紫外线引起的脂质过氧化和炎症反应，协同增强了其防晒效果。与仅依赖浓缩紫外线过滤剂的合成防晒霜不同，像OFI这样的植物提取物提供了多方面的保护，结合了直接的紫外线吸收和细胞防御机制，突显了其在化妆品和皮肤病学应用中的潜力[50]。

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图5. OFI叶提取物的防晒系数（SPF）与商业防晒霜Avene?的比较。

3.6. 抗菌活性
表4总结了OFI提取物制成的乳霜对测试细菌菌株的抗菌活性。所有试验均重复三次（n = 3），结果以平均值±标准偏差表示。

表4. OFI叶提取物水溶液对选定细菌菌株的浓度依赖性抗菌活性，以抑制圈直径（mm）表示。数据为三次独立重复的平均值±标准误差（n = 3）。

样本 Con (μg/mL) Zone inhibition (mm)
SaPaBsKpEc
OFI叶提取物 1000 μg/mL 15.3 ± 0.25 10.6 ± 0.10 9.3 ± 0.23 9.0 ± 0.07 11.3 ± 0.25 11.3 ± 0.11 10.6 ± 0.27 7.6 ± 0.07 12.0 ± 0.00 9.0 ± 0.10 8.3 ± 0.22 6.0 ± 0.08 10.6 ± 0.22 10.0 ± 0.7 9.6 ± 0.1 11.6 ± 0.22 10.0 ± 0.1 9.3 ± 0.1 9.0 ± 0.07
DMSO -- Null Null Null Null Null
阿莫西林 10 μg/mL 22 ± 0.02 22 ± 0.02 25 ± 0.03 27 ± 0.05
庆大霉素 30 μg/mL 25 ± 0.02 32 ± 0.02 22 ± 0.05 25 ± 0.03 27 ± 0.05

Sa：金黄色葡萄球菌ATCC 25923；Pa：铜绿假单胞菌ATCC 27853；Bs：枯草芽孢杆菌ATCC 25973；Kp：肺炎克雷伯菌ATCC 13885；Ec：大肠杆菌ATCC 25922。DMSO：二甲基亚砜

OFI叶提取物水溶液显示出浓度依赖性的抗菌活性。在1000 μg/mL浓度下，对金黄色葡萄球菌（15.3 ± 0.25 mm）和枯草芽孢杆菌（12.0 ± 0.00 mm）的抑制效果最强，其次是铜绿假单胞菌（11.3 ± 0.25 mm）、肺炎克雷伯菌（10.6 ± 0.22 mm）和大肠杆菌（11.6 ± 0.22 mm）。在750 μg/mL、500 μg/mL和250 μg/mL浓度下，抗菌活性均有所下降，显示出明显的剂量-反应关系（表04）。与庆大霉素（30 μg/mL，25–32 mm）和阿莫西林（10 μg/mL，19–27 mm）相比，OFI叶提取物的抗菌效力较低，而DMSO则无抗菌作用。这种行为与其LC–MS成分谱相符，其中含有大量糖基化黄酮类、酚酸和黏多糖，这些成分更倾向于调节伤口微环境，而非作为强效杀菌剂。

其背后的机制可能是部分膜破坏、金属离子螯合、干扰群体感应以及诱导氧化应激，同时具有抗氧化和抗炎作用，有助于伤口愈合[51]。相比之下，含有更多亲脂性化合物（如植物甾醇和萜类）的根提取物在较低浓度下表现出更好的抑制效果（>10 mm），而富含苷元黄酮和油脂的花提取物对铜绿假单胞菌（18.8 ± 0.8 mm）、大肠杆菌（19.8 ± 0.5 mm）和金黄色葡萄球菌（15.7 ± 0.4 mm）的抑制效果更强[52]。因此，OFI叶提取物具有广谱、中等的抗菌活性，适用于外用烧伤治疗，可在不牺牲组织再生或促进微生物耐受性的同时防止感染[53]。其适中的效力，结合抗氧化、抗炎和调节伤口的特性，支持其在促进愈合的同时保持安全、平衡的伤口微环境方面的治疗潜力。体外试验表明，OFI叶提取物具有中等的抗氧化、抗炎和抗菌活性，反映了其复杂的黄酮类、酚类和甜菜碱混合物。尽管体外效力适中，但在体内的烧伤愈合结果显示其效果显著，表现为伤口收缩加速、组织病理结构改善、胶原蛋白沉积增加和炎症浸润减少。这些发现表明，Opuntia ficus-indica叶提取物在乳膏配方中的治疗效果得到了显著提升，这可能是由于多种植物化学物质之间的协同作用以及在伤口部位的持续释放[53]。

3.7. OFI叶提取物的多变量分析
还进行了多变量分析、主成分分析（PCA）和层次聚类分析（HCA），以确定其抗氧化、抗菌、抗炎和光保护特性的相关性。图6a中的PCA生物图显示，PC1和PC2共同解释了数据集中的100%方差（PC1 = 67.3% + PC2 = 32.7%），表明这些成分完全解释了数据集的变异性。个别抗氧化剂（DPPH、TAC、TPC、TFC）对金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌和肺炎克雷伯菌的抗菌作用呈正相关，但对铜绿假单胞菌则呈弱相关或负相关，表明后者具有抗性。PC2与抗炎特性（IF、Hym、SPF）呈正相关，与还原能力（RP）呈负相关，表明这些参数对提取物整体活性的贡献不同。

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图6. OFI叶提取物的多变量分析。(a) 主成分分析（PCA）显示酚类含量（TPC、TFC）、抗氧化活性（DPPH、TAC、RP）、抗炎标志物（IF、Hym）、光保护效果（SPF）和抗菌活性（Sa、Bs、Ec、Kp、Pa）之间的相关性。(b) 层次聚类分析（HCA）展示了生物活性簇及其关系。TPC表示总酚类含量；TFC表示总黄酮含量；Bs表示枯草芽孢杆菌；Ec表示大肠杆菌；Kp表示肺炎克雷伯菌；Sa表示金黄色葡萄球菌；Pa表示铜绿假单胞菌；TAC表示总抗氧化能力；IF表示抗炎活性；DPPH表示2,2-二苯基-1-吡啶肼 assay；RP表示还原能力；Hym表示溶血百分比；SPF表示防晒系数。HCA（图6b）将这些相关性分为四组：TPC、TFC和抗菌化合物（Bs、Ec、Kp、Sa）；TAC、IF和DPPH；仅RP；以及Hym和SPF。这些数据表明，植物提取物的多功能生物活性是通过黄酮类和酚类化合物及其衍生物的协同作用体现的。这也验证了该植物在伤口护理、胶原蛋白重构和皮肤保护中的药用价值。

3.8. 配制乳膏的物理化学性质和安全性
配制的OFI叶提取物乳膏表现出良好的物理化学性质，符合高质量外用制剂的特征，并与MEBO?（体内对照）相当（表5）。其绿色、无味和湿润的质地提高了消费者的接受度，优于MEBO?的黄褐色和轻微的草本气味。pH值（6.23–7.0）略高于皮肤pH值（5.5），与MEBO?（5.5–6.5）相符，并且根据基于植物的制剂研究，不会引起刺激。该乳膏在标准测试下100%稳定（无相分离、沉淀或感官变化），与MEBO?的98%稳定性相当，确保了储存的稳健性和体内疗效的优越性[54]。

表5. 配制OFI叶提取物乳膏的物理化学性质。

表5. OFI叶提取物乳膏的物理化学性质
| 配方 | 颜色 | 气味 | 质地 | pH | 稳定性 |
|-----------------|--------------|--------------|--------------|--------------|
| OFI提取物乳膏 | 绿色 | 无味 | 湿润 | 6.23–7.0 | 100% |
| MEBO?（对照） | 黄褐色 | 轻微草本气味 | 油脂/半固体 | 5.5–6.5 | 98% |

OFI叶提取物乳膏的物理化学性质总结在表5中。其无味、pH值6.2–7.0，与商业对照MEBO?（pH 5.5–6.5）相当，适合外用应用。急性皮肤刺激测试（表6）显示，OFI乳膏和MEBO?在7天内均未引起红斑、水肿或瘙痒，证实了其极佳的皮肤相容性。观察到的无刺激特性可能归因于OFI叶提取物中的黄酮类、酚类和多糖，它们协同作用减轻氧化应激、炎症和微生物定植，从而增强体内烧伤愈合效果[55]。这些性质使该乳膏成为MEBO?的有力替代品。

表6. OFI提取物乳膏的急性皮肤刺激测试（7天评估）。

表6. OFI提取物乳膏（7天评估）的急性皮肤刺激测试结果
| 配方 | 评估参数 | 观察结果（第1-7天） |
|-----------------|---------------|--------------------|
| OFI提取物乳膏 | 无红斑、无水肿、无瘙痒 | |
| MEBO? | 无红斑、无水肿、无瘙痒 | |

3.9. 配制烧伤乳膏的伤口愈合效力
在鼠模型中评估了OFI提取物乳膏的烧伤伤口愈合潜力，结果显示其具有显著的剂量依赖性伤口闭合效果。10%浓度的乳膏效果最好，第21天时伤口收缩超过90%，上皮化接近完全（图7，图8，表7），优于未经处理的伤口和愈合缓慢的凡士林?对照组（85%闭合）。20%浓度的乳膏效果略低，可能是由于粘度增加或过多的多酚限制了吸收；5%浓度的乳膏效果中等但具有统计学显著性（表7）。

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图7. 治疗过程中不同时间点烧伤皮肤的宏观外观。

图8. OFI提取物乳膏（5%、10%、20%）与MEBO?、凡士林?和未经处理的对照组相比，在大鼠身上的烧伤收缩百分比效果。

表7. OFI提取物乳膏和MEBO?的烧伤愈合效果对比。基于印度榕树（O. ficus-indica）提取物的乳膏（浓度为5%、10%和20%）局部治疗对烧伤收缩百分比的影响与MEBO、凡士林?以及未经处理的对照组进行了对比。实验性研究（例如酶抑制测定）和临床验证对于确立明确的机制证据至关重要[73]。4. 结论本研究首次全面评估了仙人掌果（Opuntia ficus-indica, OFI）叶提取物乳霜在烧伤伤口管理中的应用，结合了其植物化学特性、体外生物活性、体内效果以及计算机模拟的机制分析。该水提取物富含黄酮类化合物（9.44 mg QE/g）、酚类化合物（111.89 mg GAE/g）和多糖，表现出强大的抗氧化活性（DPPH IC?? = 432.42 μg/mL）、显著的抗炎潜力（IC?? = 629.71 μg/mL），以及对革兰氏阳性和革兰氏阴性菌的适度抗菌效果。该乳霜具有优良的理化性质，包括pH值为6.2–7.0、完全稳定性、与红细胞的生物相容性以及中等的防晒效果（SPF = 8.34），证实了其作为局部用药的适用性。体内实验结果表明，10%的OFI乳霜效果最佳，在第21天时伤口收缩率达到90%，超过凡士林?（65%）和MEBO?（85%）。组织学观察显示伤口快速再上皮化、胶原蛋白有序排列且炎症减轻。血液学数据证实了机体恢复情况，V组患者的白细胞（WBC）和淋巴细胞（Lymphocytes）水平恢复正常（WBC：18.81×103/μL，Lymphocytes：14.03 ± 1.8 ×103/μL），同时红细胞（RBC）、血红蛋白（Hemoglobin）、红细胞比容（Hematocrit）和血小板（Platelets）也均恢复正常。分子对接分析表明，关键植物成分（儿茶素、槲皮素-3-阿拉伯糖苷、MYricetin-3′-Rhamnoside、核黄素）与COX-1、COX-2、TNF-α和MMP-9具有有利的相互作用，支持其在抗炎和再生方面的潜在作用。这表明OFI提取物乳霜是一种安全、多功能且有前景的治疗手段，能够提升烧伤护理和皮肤科应用的疗效。值得注意的是，尽管这些研究结果证明了OFI叶提取物乳霜的有效性，但其临床应用的实用性仍需通过大规模的人体试验、安全性评估以及与其他商业产品的成本效益分析来验证。这些因素对于确定其在临床中的可行性至关重要。

伦理审批所有涉及动物的实验程序均遵循了机构及国际公认的实验动物护理和使用指南，包括ARRIVE指南。该研究方案已获得El Oued大学伦理委员会的审查和批准（批准编号：03/2025；伦理参考编号：03/S.C/F.L.N.S/E.U/2025；科学委员会会议编号：02/2025，会议日期：2025年4月22日）。

作者贡献声明：
Ahmed Barhoum：研究设计、资金获取、数据分析、概念性构思。
LAIB IBTISSAM：撰写与编辑、初稿撰写、数据整理、验证、项目监督、资源协调、方法论设计、研究设计、资金获取、数据分析、概念性构思。
Ali Alsalme：概念性构思。
Mikhael Bechelany：资金获取、数据整理。
Douaa Tourkia Boutraa：概念性构思。
Djihane Leghdemsi：撰写与编辑、数据整理、概念性构思。
Rania Doudi：数据分析。
Elhafnaoui Lanez：数据整理、概念性构思。
Khelef Yahia：概念性构思。
Yousef Benaissa：概念性构思。
Khaoula Segueni：概念性构思。