通过靶向人类法尼基转移酶，具有抗肿瘤活性的吩噻嗪-三唑杂化化合物

《Results in Chemistry》：Phenothiazine-triazole hybrids with antitumor activity by targeting human farnesyltransferase

　　吉娜-米拉贝拉·杜米特里乌|达利拉·贝莱|安卡-埃莱娜·达斯卡卢|泽维尔·图鲁|哈西巴·布阿菲亚|艾米丽·弗洛凯|阿丽娜·吉内特|埃莱娜·比库

雅西大学化学学院，卡奥尔一世大街11号，700506，雅西，罗马尼亚

摘要
合成了新的吩噻嗪-三唑杂化物1a-j和2a-h，并对其抑制人体法尼基转移酶和体外癌细胞生长的潜力进行了筛选。通过四个化学修饰点，建立了该系列化合物的构效关系。本研究中对人类法尼基转移酶最有效的化合物1e与已知的强效法尼基转移酶抑制剂山奈酚酸A和洛那法尼布进行了比较，发现1e在阻止K562细胞周期方面与洛那法尼布效果相当，而山奈酚酸A则效果较弱。这项研究揭示了一类针对人类法尼基转移酶的新吩噻嗪-三唑衍生物，这些化合物在肿瘤学领域具有进一步开发的前景。

1. 引言
自夏普莱斯引入点击化学反应（即在铜(I)催化下偶联叠氮化物和炔烃的1,3-偶极环加成反应）以来，1,2,3-三唑在药物化学领域受到了广泛关注[1]。近年来，已经开发了许多无金属点击反应[2][3][4][5]。由此产生的三唑衍生物在结构上表现出与酰胺键的相似性，这种相似性与其原子间距和平面性有关[6]。因此，这种三唑核被引入了许多生物活性化合物的结构中。近年来，三唑在药物应用领域的研究取得了指数级的发展[7][8][9][10]。目前有许多1,2,3-三唑衍生物正在临床试验中或已经被批准用于治疗各种疾病。例如，Tradipitant（化合物A，图1）正在进行III期试验，以评估其治疗严重或危重COVID-19感染相关炎症性肺损伤的有效性和安全性[11]；羧基氨基三唑（化合物B，图1）与放疗联合使用，用于治疗幕上胶质母细胞瘤患者（II期临床试验）；另一种三唑化合物也在随机化的II期试验中研究其对转移性肾癌的治疗效果[11]；还有另一种三唑化合物正在进行随机化的III期试验，以评估其治疗III期或IV期非小细胞肺癌的效果[11]。此外，还有针对特发性肺纤维化患者的随机化、双盲、安慰剂对照的IIb期试验，旨在评估三唑TD-139（化合物C，图1）的有效性和安全性[11]。其他1,2,3-三唑衍生物已被批准并用于治疗多种疾病：鲁芬酰胺（化合物D，图1）是一种抗惊厥药；他唑巴坦（化合物E，图1）是一种青霉素类似物；苏沃雷克桑特（化合物F，图1）用于治疗失眠等[11]。许多文献报道了新1,2,3-三唑衍物的合成及其抗真菌活性[12]。尽管大多数文章描述的是来自制药行业的现有药物的类似物，但Darandale及其同事[12]合成了一些结合噻吩吡啶核的新1,2,3-三唑，这些化合物表现出良好的抗真菌活性。例如，化合物G（图1）对新型隐球菌的抑制效果与市售米康唑相当[12]。数十年来，人们一直在深入研究有效的抗病毒候选药物[13]。吴等人[13]报道了几种含有1,2,3-三唑核的胞苷衍生物，其中化合物H（图1）在纳摩尔浓度下显示出优异的抗HIV活性，优于参考药物阿扎那韦[13]。1,2,3-三唑在设计具有抗癌活性的新化合物方面具有吸引力。近期文献中，许多研究表明1,2,3-三唑杂化物对肿瘤细胞具有活性，并能抑制许多参与癌细胞增殖的生物靶点[14][15][16][17][18][19][20][21][23][24][25][26][27][28][30][31][32][33][34][35][36][37][38]。这些参考文献涵盖了关于1,2,3-三唑杂化物的广泛研究，包括综述、构效关系（SAR）分析以及其作用机制的详细研究，如抑制EGFR、VEGFR-2、碳酸酐酶和管蛋白聚合[14][15][16][17][18][19][20][21][23][24][25][26][27][28][30][31][32][33][34][35][36][37][38]。

2. 实验部分
所用原料均为市售产品，无需进一步纯化（供应商：Carlo Erba Reagents S.A.S.、Tokyo Chemical Industry Co. Ltd. 和 Acros Organics）。熔点采用MPA 100 OptiMelt?仪器测量，未经校正。核磁共振（NMR）数据在Varian 400-MR谱仪上以400 MHz采集1H NMR，在Bruker Avance III 500 MHz谱仪上以500 MHz采集1H NMR和13C NMR，内部标准物为四甲基硅烷（TMS），测试温度为25°C。化学位移（δ）以ppm表示，相对于TMS。分裂模式如下：s表示单峰；d表示双峰；dd表示双峰中的双峰；t表示三峰；m表示多重峰；qint表示五重峰；br s表示拓宽的单峰；br t表示拓宽的三峰。偶联常数（J）以Hz表示。薄层色谱（TLC）在Macherey Nagel硅胶板上进行，使用紫外灯在254 nm和365 nm波段下观察。红外光谱（IR）在Varian 640-IR FT-IR或Bruker Tensor 27光谱仪上记录。高分辨率质谱（HRMS）在LTQ Orbitrap XL（Thermo Scientific）仪器上采集，采用电喷雾离子化方式。样品首先溶解在DMSO中，然后稀释至大约10^-5 M的最终浓度。新化合物的元素分析（C、H、N）在法国第戎Mirande大学科学系的“Pole Chimie Moleculaire-Welience”设备上进行。

2.1. 含有丙硫醚基团的吩噻嗪衍生物（4a和4b）的合成通用方法
将无水碳酸钾（1当量）加入到N-(2-巯基乙烯)-3-(10H-吩噻嗪-10-基)丙酰胺3a或N-(2-巯基乙烯)-3-(2-氯-10H-吩噻嗪-10-基)丙酰胺3b（1当量）与丙炔基溴（1当量）的乙酮溶液中。混合物在室温下搅拌24小时。反应完成后（通过TLC监测），过滤不溶性盐，滤液在真空条件下浓缩。然后向其中加入蒸馏水，生成的沉淀物过滤后用无水乙醇重结晶，干燥得到含有丙硫醚基团的纯净吩噻嗪衍生物4a或4b。

3-(10H-吩噻嗪-10-基)-N-[2-(丙-2-in-1-基-硫)乙烯]丙酰胺（4a）：
使用N-(2-巯基乙烯)-3-(10H-吩噻嗪-10-基)丙酰胺3a（0.4 g，1.21 mmol）、丙炔基溴（0.133 mmol）和K2CO3（0.167 mmol）在10 mL乙酮中，得到3-(10H-吩噻嗪-10-基)-N-[2-(丙-2-in-1-基-硫)乙烯]丙酰胺4a，收率为94%（0.415 g）；熔点（EtOH）82–84°C。1H NMR（DMSO-d6，400 MHz）δ（ppm）：2.57（t，J = 7.2 Hz，2H，CH2），2.68（t，J = 7.2 Hz，2H，CH2），3.17（t，J = 2.4 Hz，1H，CH），3.29（q，J = 7.2 Hz，2H，CH2），3.38（d，J = 2.4 Hz，2H，CH2），4.11（t，J = 7.2 Hz，2H，CH2），6.95（t，J = 7.6 Hz，2H，ArH），7.05（d，J = 8.0 Hz，2H，ArH），7.15（dd，J = 7.6，1.2 Hz，2H，ArH），7.22（td，J = 8.0，1.2 Hz，2H，ArH），8.11（t，J = 5.6 Hz，1H，NH）。13C NMR（DMSO-d6，100 MHz）δ（ppm）：18.1（CH2），30.4（CH2），33.2（CH2），38.0（CH2），43.0（CH2），73.6（CH），80.5（C），115.4（2CH），122.5（2CH），123.1（2C），127.0（2CH），127.6（2CH），144.3（2C），170.0（C）。红外光谱（IR）ν cm^-1：3314，3280，3245，1699，1626，1593，1547，1457，1428，1386，1342，1315，1230，1183，1126，1107，1037，927，887，849，752。元素分析计算值：C20H21ClN2OS2：C 59.32；H 5.23；N 6.92；实际测得：C 59.52；H 5.45；N 7.08%。

3-(2-氯-10H-吩噻嗪-10-基)-N-[2-(丙-2-in-1-基-硫)乙烯]丙酰胺（4b）：
使用N-(2-巯基乙烯)-3-(2-氯-10H-吩噻嗪-10-基)丙酰胺3b（0.5 g，1.37 mmol）、丙炔基溴（0.161 mmol）和K2CO3（0.189 mmol）在10 mL乙酮中，得到3-(2-氯-10H-吩噻嗪-10-基)-N-[2-(丙-2-in-1-基-硫)乙烯]丙酰胺4b，收率为80%（0.44 g）；熔点（EtOH）102–105°C。1H NMR（DMSO-d6，400 MHz）δ（ppm）：2.55（t，J = 7.2 Hz，2H，CH2），2.67（t，J = 7.2 Hz，2H，CH2），3.16（t，J = 2.4 Hz，1H，CH），3.26（q，J = 7.2 Hz，2H，CH2），3.37（d，J = 2.4 Hz，2H，CH2），4.11（t，J = 7.2 Hz，2H，CH2），6.95–7.01（m，2H，ArH），7.06–7.11（m，2H，ArH），7.13–7.16（m，2H，ArH），7.20–7.24（m，1H，ArH），8.11（t，J = 5.6 Hz，1H，NH）。13C NMR（DMSO-d6，100 MHz）δ（ppm）：18.6（CH2），30.8（CH2），33.6（CH2），38.5（CH2），43.5（CH2），74.1（CH），80.9（C），115.9（CH），116.3（CH），122.6（CH），122.6（C），123.3（C），123.5（CH），127.6（CH），128.3（CH），128.5（CH），132.9（C），144.2（C），146.3（C）。红外光谱（IR）ν cm^-1：3341，3232，2155，1632，1543，1455，1404，1346，1285，1224，1183，1096，931，855，802，747。元素分析计算值：C20H19ClN2OS2：C 59.61；H 4.75；N 6.95；实际测得：C 59.90；H 4.89；N 7.24%。

2.2. 1-苯酰基和1-芳基-1,2,3-三唑（1a-j和2a-h）的合成通用方法
将吩噻嗪衍生物4a或4b（1当量）和叠氮化物6a-e或9a-d（1当量）在磁力搅拌下溶解在乙酮中。然后加入Cu2SO4 5H2O（0.1当量）和抗坏血酸钠（0.2当量）的水溶液，混合物在室温下搅拌24小时。反应完成后（通过TLC监测），将挥发性物质在真空条件下去除。粗产物用水洗涤后用二氯甲烷萃取。有机相用Na2SO4干燥并在真空条件下浓缩。随后向其中加入乙醇和乙酸乙酯（1:1，v:v）的混合物。形成的沉淀物过滤后用乙醇重结晶，得到纯净的1a-j和2a-h三唑。

N-{2-[({1-[2-(4-氯苯基)-2-氧代乙烯]-1H-1,2,3-三唑-4-基}甲基)硫]乙烯}-3-(10H-吩噻嗪-10-基)丙酰胺（1a）：
使用3-(10H-吩噻嗪-10-基)-N-[2-(丙-2-in-1-基-硫)乙烯]丙酰胺4a（0.2 g，0.54 mmol）、2-叠氮-1-(4-氯苯基)乙烷-1-酮6a（0.107 mmol）、CuSO4·5H2O（0.013 g，0.05 mmol）和NaAsc（0.021 g，0.1 mmol）在10 mL乙酮和3 mL水中，得到三唑1a，收率为85%（0.26 g）；熔点（EtOH）146–148°C。1H NMR（DMSO-d6，400 MHz）δ（ppm）：2.55–2.59（m，4H，2CH2），3.28（q，J = 7.2 Hz，2H，CH2），3.85（s，2H，CH2），4.10（t，J = 7.2 Hz，2H，CH2），6.15（s，2H，CH2），6.94（t，J = 7.2 Hz，2H，ArH），7.04（d，J = 8.0 Hz，2H，ArH），7.13（dd，J = 8.0，1.2 Hz，2H，ArH），7.19（td，J = 7.2，1.2 Hz，2H，ArH），7.68（d，J = 8.4 Hz，2H，ArH），7.96（s，1H，ArH），8.07（d，J = 8.4 Hz，2H，ArH），8.12（t，J = 5.6 Hz，1H，NH）。13C NMR（DMSO-d6，100 MHz）δ（ppm）：25.4（CH2），31.0（CH2），33.7（CH2），38.7（CH2），43.5（CH2），56.3（CH2），115.9（2CH），123.0（2CH），123.5（2C），125.1（CH），127.5（2CH），128.1（2CH），129.5（2CH），129.6（2CH），130.5（2CH），133.3（C），139.6（C），144.8（2C），170.5（C）。红外光谱（IR）波数（ν cm?1）：1702, 1648, 1590, 1537, 1459, 1346, 1285, 1222, 1183, 1092, 995, 819, 779。质谱（MS，EI）分子量（m/z）百分比：563（24）[M+]，411（5），330（27），296（23），212（99），198（100）。

N-{2-[({1-[2-(4-溴苯基)-2-氧乙炔]-1H-1,2,3-三唑-4-基]甲基)硫]乙炔}-3-(10H-苯并噻嗪-10-基)丙酰胺（1b）：使用通用方法，以3-(10H-苯并噻嗪-10-基)-N-[2-(丙-2-炔基-1-硫)乙炔]丙酰胺4a（0.15 g，0.41 mmol）、2-氨基-1-(4-溴苯基)乙烷-1-酮6b（0.1 g，0.41 mmol）、CuSO4·5H2O（0.01 g，0.04 mmol）、NaAsc（0.016 g，0.08 mmol）在10 mL丙酮和3 mL水中反应，得到三唑1b，为米色固体，产率为96%（0.24 g）；熔点（mp，EtOH）160–162°C。1H NMR（DMSO-d6，400 MHz）δ（ppm）：2.56–2.61（m，4H，2CH2），3.29（q，J = 7.2 Hz，2H，CH2），3.86（s，2H，CH2），4.11（t，J = 7.2 Hz，2H，CH2），6.15（s，2H，CH2），6.95（t，J = 7.6 Hz，2H，ArH），7.05（d，J = 8.4 Hz，2H，ArH），7.14（dd，J = 7.6 Hz，1.2 Hz，2H，ArH），7.20（td，J = 8.4 Hz，2H，ArH），7.83（d，J = 8.4 Hz，2H，ArH），7.97（s，1H，ArH），7.99（d，J = 8.4 Hz，2H，ArH），8.13（t，J = 5.6 Hz，1H，NH）。

N-{2-[({1-[2-(4-氯苯基)-2-氧乙炔]-1H-1,2,3-三唑-4-基}甲基)硫]乙炔}-3-(10H-苯并噻嗪-10-基)丙酰胺（1c）：使用通用方法，以3-(10H-苯并噻嗪-10-基)-N-[2-(丙-2-炔基-1-硫)乙炔]丙酰胺4a（0.3 g，0.82 mmol）、2-氨基-1-(4-氯苯基)乙烷-1-酮6c（0.15 g，0.82 mmol）、CuSO4·5H2O（0.02 g，0.08 mmol）、NaAsc（0.032 g，0.16 mmol）在10 mL丙酮和3 mL水中反应，得到三唑1c，为奶油色固体，产率为91%（0.41 g）；熔点（mp，EtOH）164–166°C。1H NMR（CDCl3，400 MHz）δ（ppm）：2.62（t，J = 6.4 Hz，2H，CH2），2.66（t，J = 6.8 Hz，2H，CH2），3.37（q，J = 6.4 Hz，2H，CH2），3.79（s，2H，CH2），4.21（t，J = 6.8 Hz，2H，CH2），5.80（s，2H，CH2），6.51（t，J = 5.6 Hz，1H，NH），6.91–6.95（m，4H，ArH），7.14–7.18（m，4H，ArH），7.64（s，1H，ArH），7.82（d，J = 8.0 Hz，2H，ArH），8.05（d，J = 8.0 Hz，2H，ArH）。13C NMR（CDCl3，100 MHz）δ（ppm）：25.6（CH2），31.3（CH2），33.5（CH2），38.9（CH2），43.1（CH2），56.2（CH2），115.9（2CH），123.1（2CH），123.4（2C），125.2（CH），127.7（2CH），128.3（2CH），129.4（2CH），129.9（2CH），130.5（2CH），133.5（C），139.7（C），144.8（2C），170.1（C），191.5（C）。

N-{2-[({1-[2-(4-氰基苯基)-2-氧乙炔]-1H-1,2,3-三唑-4-基}甲基)硫]乙炔}-3-(10H-苯并噻嗪-10-基)丙酰胺（1d）：使用通用方法，以3-(10H-苯并噻嗪-10-基)-N-[2-(丙-2-炔基-1-硫)乙炔]丙酰胺4a（0.2 g，0.55 mmol）、2-氨基-1-(4-甲氧基苯基)乙烷-1-酮6d（0.11 g，0.55 mmol）、CuSO4·5H2O（0.014 g，0.05 mmol）、NaAsc（0.021 g，0.11 mmol）在10 mL丙酮和3 mL水中反应，得到三唑1d，为白色固体，产率为91%（0.28 g）；熔点（mp，EtOH）120–123°C。1H NMR（DMSO-d6，400 MHz）δ（ppm）：2.55–2.59（m，4H，2CH2），3.28（q，J = 6.8 Hz，2H，CH2），3.85（s，2H，CH2），3.88（s，3H，CH3），4.11（t，J = 6.8 Hz，2H，CH2），6.08（s，2H，CH2），6.94（td，J = 7.6 Hz，2H，ArH），7.04（d，J = 8.4 Hz，2H，ArH），7.10–7.15（m，4H，ArH），7.20（t，J = 8.4 Hz，1H，ArH），7.96（s，1H，ArH），8.04（m，2H，ArH），8.13（t，J = 5.6 Hz，1H，NH）。13C NMR（DMSO-d6，100 MHz）δ（ppm）：24.9（CH2），30.4（CH2），33.1（CH2），38.1（CH2），38.5（CH2），55.3（CH2），55.6（CH3），114.1（2CH），115.4（2CH），122.4（2CH），123.0（2C），123.5（CH），127.6（2CH），128.3（2CH），129.5（C），130.0（2CH），130.8（2CH），132.9（C），139.9（C），144.6（2C），170.4（C），191.1（C）。红外光谱（IR）波数（ν cm?1）：3298，2154，1689，1676，1564，1460，1372，1214，1072，973，951，880，751。

元素分析计算值（对于C28H26BrN5O2S2）：C，55.26；H，4.31；N，11.51。实测值：C，55.46；H，4.59；N，11.73%。

N-{2-[({1-[2-(4-氰基苯基)-2-氧乙炔]-1H-1,2,3-三唑-4-基}甲基)硫]乙炔}-3-(10H-苯并噻嗪-10-基)丙酰胺（1e）：使用通用方法，以3-(10H-苯并噻嗪-10-基)-N-[2-(丙-2-炔基-1-硫)乙炔]丙酰胺4a（0.1 g，0.27 mmol）、2-氨基-1-联苯-2-氧乙炔）6e（0.064 g，0.27 mmol）、CuSO4·5H2O（0.0068 g，0.027 mmol）、NaAsc（0.0107 g，0.054 mmol）在10 mL丙酮和3 mL水中反应，得到三唑1e，为奶油色固体，产率为90%（0.15 g）；熔点（mp，EtOH）167–169°C。1H NMR（DMSO-d6，400 MHz）δ（ppm）：2.55–2.61（m，4H，2CH2），3.27–3.31（m，2H，CH2），3.87（s，2H，CH2），4.11（t，J = 7.2 Hz，2H，CH2），6.19（s，2H，CH2），6.94（t，J = 7.2 Hz，2H，ArH），7.04（d，J = 8.4 Hz，2H，ArH），7.13（dd，J = 7.6 Hz，1.2 Hz，2H，ArH），7.20（t，J = 7.2 Hz，2H，ArH），7.79（d，J = 7.6 Hz，2H，ArH），7.96（s，1H，ArH），8.04（m，2H，ArH）。13C NMR（DMSO-d6，100 MHz）δ（ppm）：25.4（CH2），31.0（CH2），33.7（CH2），38.7（CH2），38.5（CH2），43.5（CH2），55.3（CH2），55.6（CH3），115.9（2CH），115.4（2CH），122.4（2CH），123.0（2C），123.5（CH），127.5（4CH），128.1（2CH），129.1（2CH），129.4（3CH），129.6（3CH），133.4（C），139.1（C），144.8（C），170.5（C），192.2（C）。红外光谱（IR）波数（ν cm?1）：3321，1685，1635，1603，1575，1549，1456，1421，1347，1315，1286，1264，1238，1222，1181，1029，987，839，747。元素分析计算值（对于C29H26N6O2S2）：C，62.79；H，4.72；N，15.15。实测值：C，63.01；H，4.89；N，15.41%。

N-{2-[({1-[2-(4-甲氧基苯基)-2-氧乙炔]-1H-1,2,3-三唑-4-基}甲基)硫]乙炔}-3-(10H-苯并噻嗪-10-基)丙酰胺（1d）：使用通用方法，以3-(10H-苯并噻嗪-10-基)-N-[2-(丙-2-炔基-1-硫)乙炔]丙酰胺4a（0.2 g，0.55 mmol）、2-氨基-1-(4-甲氧基苯基)乙烷-1-酮6d（0.11 g，0.55 mmol）、CuSO4·5H2O（0.014 g，0.05 mmol）、NaAsc（0.021 g，0.11 mmol）在10 mL丙酮和3 mL水中反应，得到三唑1d，为白色固体，产率为91%（0.28 g）；熔点（mp，EtOH）120–123°C。1H NMR（DMSO-d6，400 MHz）δ（ppm）：2.55–2.59（m，4H，2CH2），3.28（q，J = 6.8 Hz，2H，CH2），3.85（s，2H，CH2），3.88（s，3H，CH3），4.11（t，J = 6.8 Hz，2H，CH2），6.08（s，2H，CH2），6.94（td，J = 7.6 Hz，2H，ArH），7.04（d，J = 8.4 Hz，2H，ArH），7.10–7.15（m，4H，ArH），7.20（t，J = 8.4 Hz，1H，ArH），7.96（s，1H，ArH）。13C NMR（DMSO-d6，100 MHz）δ（ppm）：24.9（CH2），30.4（CH2），33.1（CH2），33.1（CH2），38.1（CH2），42.9（CH2），55.3（CH2），55.6（CH3），114.1（2CH），115.4（2CH），122.4（2CH），123.0（2C），124.6（CH），126.9（2CH），127.0（2CH），127.6（2CH），130.5（2CH），130.8（2CH），132.9（C），139.9（C），144.6（2C），170.4（C），191.1（C）。红外光谱（IR）波数（ν cm?1）：3321，1689，1635，1603，1575，1549，1456，1421，1347，1315，1286，1264，1238，1222，1181，1029，987，839，747。元素分析计算值（对于C29H29N5O3S2）：C，62.23；H，5.22；N，12.51。实测值：C，62.39；H，5.39；N，12.72%。

N-{2-[({1-[2-联苯-2-氧乙炔]-1H-1,2,3-三唑-4-基}甲基)硫]乙炔}-3-(10H-苯并噻嗪-10-基)丙酰胺（1e）：使用通用方法，以3-(10H-苯并噻嗪-10-基)-N-[2-(丙-2-炔基-1-硫)乙炔]丙酰胺4a（0.1 g，0.27 mmol）、2-氨基-1-联苯-2-发现：C含量为61.36；H含量为5.05；N含量为13.43%。4-{4-[({2-[3-(10H-phenothiazin-10-yl)propanamido]ethylen}thio)methylen]-1H-1,2,3-triazol-1-yl}benzoic acid (2b)：采用通用方法，使用3-(10H-phenothiazin-10-yl)-N-[2-(prop-2-in-1-yl-thio)ethylen]propanamide 4a（0.25克，0.68毫摩尔），4-azido-benzoic acid 9b（0.111克，0.68毫摩尔），CuSO4·5H2O（0.017克，0.07毫摩尔），NaAsc（0.026克，0.14毫摩尔）在10毫升丙酮和3毫升水中反应，得到三唑2b，为灰色固体，产率为68%（0.24克）；熔点（EtOH）为112–114°C。1H NMR（CDCl3，400 MHz）δ（ppm）：2.58（t，J = 6.4 Hz，2H，CH2），2.73（t，J = 6.4 Hz，2H，CH2），3.43（q，J = 6.4 Hz，2H，CH2），3.84（s，2H，CH2），4.25（t，J = 6.4 Hz，2H，CH2），6.66（s，1H，NH），6.92–6.97（m，4H，ArH），7.16–7.20（m，4H，ArH），7.87（d，J = 8.0 Hz，2H，ArH），8.11（s，1H，ArH），8.20（d，J = 8.0 Hz，2H，ArH）。13C NMR（CDCl3，100 MHz）δ（ppm）：25.5（CH2），30.9（CH2），34.1（CH2），38.8（CH2），43.4（CH2），115.9（CH2），120.0（CH），120.3（CH），123.2（CH），124.8（C），125.9（2CH），127.6（2CH），127.9（2CH），131.7（C），140.1（2C），144.7（2C），146.8（C），169.5（C），171.9（C）。红外光谱（IR）ν cm?1：3315，3132，1691，1632，1608，1546，1457，1442，1405，1314，1286，1235，1222，1182，1107，1043，987，857，804，747。元素分析计算值：C 61.00；H 4.74；N 13.17。发现：C含量为61.22；H含量为4.99；N含量为13.21%。Methyl 3-{4-[({2-[3-(10H-phenothiazin-10-yl)propanamido]ethylen}thio)methylen]-1H-1,2,3-triazol-1-yl}benzoate (2c)：采用通用方法，使用3-(10H-phenothiazin-10-yl)-N-[2-(prop-2-in-1-yl-thio)ethylen]propanamide 4a（0.25克，0.68毫摩尔），methyl 3-azido-benzoate 9c（0.12克，0.68毫摩尔），CuSO4·5H2O（0.017克，0.07毫摩尔），NaAsc（0.027克，0.14毫摩尔）在10毫升丙酮和3毫升水中反应，得到三唑2c，为白色固体，产率为74%（0.27克）；熔点（EtOH）为125–127°C。1H NMR（CDCl3，500 MHz）δ（ppm）：2.62（t，J = 6.5 Hz，2H，CH2），2.69（t，J = 6.5 Hz，2H，CH2），3.44（q，J = 6.5 Hz，2H，CH2），3.83（s，2H，CH2），3.97（s，3H，CH3），4.24（t，J = 6.5 Hz，2H，CH2），6.58（s，1H，NH），6.91–6.96（m，4H，ArH），7.14–7.18（m，4H，ArH），7.61（t，J = 8.0 Hz，2H，ArH），8.01–8.05（m，1H，ArH），8.11（d，J = 7.5 Hz，1H，ArH），8.36（s，1H，ArH）。13C NMR（CDCl3，125 MHz）δ（ppm）：25.5（CH2），31.3（CH2），34.2（CH2），38.5（CH2），43.4（CH2），52.6（CH3），115.7（2CH），120.1（CH），121.0（CH），121.0（CH），123.2（2CH），124.8（C），125.9（2CH），127.6（2CH），127.7（2CH），129.6（CH），131.7（C），140.1（2C），144.7（2C），146.8（C），169.5（C），171.9（C）。红外光谱（IR）ν cm?1：1701，1654，1594，1539，1457，1328，1267，1229，1117，1054，1033，897，882，831，750，701。元素分析计算值：C 61.63；H 4.99；N 12.83。发现：C含量为61.89；H含量为5.24；N含量为13.16%。Methyl 4-{4-[({2-[3-(10H-phenothiazin-10-yl)propanamido]ethylen}thio)methylen]-1H-1,2,3-triazol-1-yl}benzoate (2d)：采用通用方法，使用3-(10H-phenothiazin-10-yl)-N-[2-(prop-2-in-1-yl-thio)ethylen]propanamide 4a（0.25克，0.68毫摩尔），methyl 4-azido-benzoate 9d（0.12克，0.68毫摩尔），CuSO4·5H2O（0.017克，0.07毫摩尔），NaAsc（0.027克，0.14毫摩尔）在10毫升丙酮和3毫升水中反应，得到三唑2d，为白色固体，产率为60%（0.225克）；熔点（EtOH）为137–138°C。1H NMR（CDCl3，400 MHz）δ（ppm）：2.60（t，J = 6.8 Hz，2H，CH2），2.67（t，J = 6.4 Hz，2H，CH2），3.43（q，J = 6.4 Hz，2H，CH2），3.82（s，2H，CH2），3.96（s，3H，CH3），4.23（t，J = 6.4 Hz，2H，CH2），6.56（s，1H，NH），6.90–6.95（m，4H，ArH），7.14–7.18（m，4H，ArH），7.84（d，J = 8.4 Hz，2H，ArH），8.07（s，1H，ArH），8.19（d，J = 8.4 Hz，2H，ArH）。13C NMR（CDCl3，100 MHz）δ（ppm）：25.5（CH2），31.2（CH2），34.2（CH2），38.6（CH2），43.4（CH2），52.5（CH3），115.7（2CH），119.8（2CH），120.1（CH），121.0（CH），123.1（2CH），124.6（CH），125.7（2C），127.5（2CH），127.7（2CH），129.6（CH），130.1（CH），131.9（C），137.1（C），144.7（2C），146.4（C），165.8（C），171.1（C）。红外光谱（IR）ν cm?1：3229，3067，1715，1635，1654，1594，1539，1457，1328，1267，1229，1117，1054，1033，897，882，831，750，701。元素分析计算值：C 61.63；H 4.99；N 12.83。3-{4-[({2-[3-(2-Chloro-10H-phenothiazin-10-yl)propanamido]ethylen}thio)methylen]-1H-1,2,3-triazol-1-yl}benzoic acid (2e)：采用通用方法，使用3-(2-chloro-10H-phenothiazin-10-yl)-N-[2-(prop-2-in-1-yl-thio)ethylen]propanamide 4b（0.25克，0.62毫摩尔），3-azido-benzoic acid 9a（0.1克，0.62毫摩尔），CuSO4·5H2O（0.015克，0.06毫摩尔），NaAsc（0.024克，0.12毫摩尔）在10毫升丙酮和3毫升水中反应，得到三唑2e，为白色固体，产率为61%（0.22克）；熔点（EtOH）为175–177°C。1H NMR（DMSO-d6，500 MHz）δ（ppm）：2.53–2.59（m，4H，2CH2），3.28（q，J = 6.5 Hz，2H，CH2），3.86（s，2H，CH2），4.11（t，J = 6.5 Hz，2H，CH2），6.92–6.97（m，2H，ArH），7.04–7.11（m，4H，ArH），7.18（t，J = 7.5 Hz，1H，ArH），7.52（t，J = 7.5 Hz，1H，NH），7.88（d，J = 7.5 Hz，1H，ArH），8.04（d，J = 7.5 Hz，1H，ArH），8.20（s，1H，ArH），8.44（s，1H，ArH），8.71（s，1H，ArH）。13C NMR（DMSO-d6，125 MHz）δ（ppm）：24.8（CH2），30.4（CH2），33.1（CH2），38.2（CH2），38.2（CH2），43.1（CH2），115.4（CH），115.9（CH），120.7（CH），121.2（CH），122.1（2CH），122.2（C），122.8（C），123.0（CH），127.1（CH），127.8（CH），128.0（CH），129.0（CH），129.2（CH），132.5（2C），136.2（C），143.7（C），145.5（C），145.9（C），170.0（C），170.3（C）。红外光谱（IR）ν cm?1：1716，1655，1607，1592，1566，1518，1457，1456，1407，1277，1234，1193，1107，1043，930，858，836，805，741。元素分析计算值：C 57.29；H 4.27；N 12.37。发现：C含量为57.40；H含量为4.33；N含量为12.51%。4-{4-[({2-[3-(2-Chloro-10H-phenothiazin-10-yl)propanamido]ethylen}thio)methylen]-1H-1,2,3-triazol-1-yl}benzoic acid (2f)：采用通用方法，使用3-(2-chloro-10H-phenothiazin-10-yl)-N-[2-(prop-2-in-1-yl-thio)ethylen]propanamide 4b（0.25克，0.62毫摩尔），4-azido-benzoic acid 9b（0.1克，0.62毫摩尔），CuSO4·5H2O（0.015克，0.06毫摩尔），NaAsc（0.024克，0.12毫摩尔）在10毫升丙酮和3毫升水中反应，得到三唑2f，为白色固体，产率为55%（0.19克）；熔点（EtOH）为169–170°C。1H NMR（DMSO-d6，500 MHz）δ（ppm）：2.53–2.59（m，4H，2CH2），3.28（q，J = 6.5 Hz，2H，CH2），3.86（s，2H，CH2），4.11（t，J = 6.5 Hz，2H，CH2），6.92–6.97（m，2H，ArH），7.04–7.11（m，4H，ArH），7.18（t，J = 7.5 Hz，1H，ArH），7.52（t，J = 7.5 Hz，1H，NH），7.88（d，J = 7.5 Hz，1H，ArH），8.04（d，J = 7.5 Hz，1H，ArH），8.20（s，1H，ArH），8.44（s，1H，ArH），8.71（s，1H，ArH）。13C NMR（DMSO-d6，100 MHz）δ（ppm）：24.8（CH2），30.4（CH2），33.1（CH2），38.2（CH2），38.4（CH2），52.5（CH3），115.5（CH），115.9（CH），120.1（CH），121.9（CH），123.1（2CH），124.1（C），125.3（C），127.7（2CH），128.1（CH），129.8（2C），130.1（CH），130.9（CH），131.2（CH），132.8（C），143.9（C），145.1（C），145.5（来自叠氮化物9a和9b的羧基团通过采用一种已报道的 procedure，在三甲氯硅烷（TMSCl）存在下使用甲醇进行酯化，获得了带有甲基酯基的叠氮化物9c和9d（方案2）。最后的合成步骤是通过点击化学反应[51]完成1,2,3-三唑环的闭合。因此，第一系列中的目标吩噻嗪-三唑衍生物1a-j是通过叠氮化物6a-e与S-烯丙基衍生物4a,b在丙酮/水混合物中作为溶剂，并在反应介质中生成铜(I)以及使用抗坏血酸钠作为还原剂和催化剂的情况下，通过偶极[3+2]环加成反应获得的。新的1-苯基-1,2,3-三唑1a-j以优异的产率（80–96%）被分离出来（方案3）。

将同样的点击化学方法应用于芳基叠氮化物9a-d和烯丙基衍生物4a及4b，得到了新的1-芳基-1,2,3-三唑2a-h，产率良好（55–74%），从而多样化了三唑环第1位上的基团类型（方案4）。

首先在体外评估了合成的三唑1a-j和2a-h的生物活性（表1）。DMSO用作阴性对照，分子K（用于设计新分子的hit结构，图1）和已知的FTase抑制剂山柑酸A用作阳性参考。获得的生物结果允许基于四个化学修饰点建立额外的结构-活性关系。首先考虑了三环取代的重要性。用2-氯吩噻嗪环替换吩噻嗪环保持了化合物对FTase的亲和力（例如：比较化合物1b和1g（表1））。接下来，通过增加连接体的长度并在类似衍生物1b中添加硫原子，对母体化合物K进行了修饰。化合物1b的抑制活性略低于模型分子K（1b：IC50（h-FTase）= 12.6 μM 对比 K：IC50（h-FTase）= 8.32 μM，表1）。从实验结果中得出的第三个结构-活性关系是，1-苯基-1,2,3-三唑1通常比1-芳基-1,2,3-三唑2更具活性。1中的苯基团提供的更灵活构象似乎比2中的刚性芳基三唑基团更有利于对FTase的活性（表1）。最后，苯基单元上的对位取代基的性质似乎对于维持抑制活性很重要。在吩噻嗪衍生物系列1a-e中，较大的对位苯基被优选，显示出最佳的抗FTase潜力，而对位甲氧基取代则对生物效应不利。取代基对抑制活性的有利影响可以按以下顺序排列：OMe < Br < Cl < CN < C6H5。有趣的是，在1-芳基-1,2,3-三唑2系列中，含有游离羧酸的化合物系统地比它们的甲基酯类似物更具活性，这证实了羧酸与酶相互作用的重要性（例如：比较化合物2e和2g，表1）。此外，预测了一个药代动力学参数：本研究中鉴定出的最活性FTase抑制剂的半衰期（t1/2），其值范围为2.67至11.24小时（表1）。

表1. 吖嗪-三唑衍生物1a-j和2a-h在体外对人类FTase的抑制活性
化合物 | idx | RR1% 抑制（人类FTase） | IC50 (μM ± SD | t1/2 消除（小时） | 接配得分
---------|-----------------|--------------|---------------|-----------------|-------------------
1a | HCH2-COp-Cl | 71 | 17.0 ± 3.9 | 0.89 | 4.4 | -8.1 |
1b | HCH2-COp-Br | 58 | 12.6 ± 3.5 | 0.84 | 5.2 | -7.9 |
1c | HCH2-COp-CN | 83 | 8.4 ± 1.3 | 0.93 | 4.0 | -8.0 |
1d | HCH2-COp-OMe | n.d. | n.d. | n.d. | n.d. |
1e | HCH2-COp-Ph | 89 | 4.2 ± 0.8 | 0.81 | 4.98 | -9.4 |
1f | ClCH2-COp-Cl | 71 | 13.1 ± 1.1 | 0.81 | 11.24 | -7.7 |
1g | ClCH2-COp-Br | 69 | 11.5 ± 1.1 | 0.82 | 15.77 | -8.0 |
1h | ClCH2-COp-CN | 92 | 16.4 ± 2.8 | 0.99 | 4.44 | -8.3 |
1i | ClCH2-COp-OMe | n.d. | n.d. | n.d. | n.d. |
1j | ClCH2-COp-Ph | 69 | 12.2 ± 1.0 | 0.89 | 15.47 | -8.9 |
aH–m-COOH | 91 | 28.6 ± 5.9 | 0.92 | n.d. | n.d. |
2b | H–p-COOH | 87 | 38.6 ± 6.1 | 0.94 | n.d. | n.d. |
2c | H–m-COOH | 49 | n.d. | n.d. | n.d. |
2d | H–p-COOMe | 45 | n.d. | n.d. | n.d. |
2e | Cl–m-COOH | 96 | 14.3 ± 1.2 | 0.98 | 2.67 | -8.4 |
1f | Cl–p-COOH | 93 | 16.5 ± 1.8 | 0.97 | 2.76 | -8.3 |
1j | Cl–p-COOMe | n.d. | n.d. | n.d. |
K | 8.32 | 0.90 | 6.96 | -9.0 |

山柑酸A | 0.18 | 30.9 | 92.5 | -5.7 |

a. 单次高剂量（100 μM）下测试的实验药物对人类FTase的抑制作用。
b. SD：标准偏差。
c. R2：回归因子。
d. n.d.：未确定。
e. 最活性化合物的半衰期使用VEGA QSAR平台（版本1.3.19）和QSARINS模型预测。
f. 接配得分使用AutoDock Vina计算。

对接研究是在本工作中鉴定出的最活性化合物（三唑1a、1b、1c、1e、1f、1g、1h、1j、2e和2f）以及参考三唑K和山柑酸A上进行的，目的是研究它们在法尼基转移酶（FTase）活性位点的结合模式。相应的对接得分总结在表1中，所有对接姿势提供在电子补充信息（图S19-S30）中。总体而言，合成化合物的对接得分范围为-7.7至-9.4，而山柑酸A的对接得分为-5.7。值得注意的是，最活性的1,2,3-三唑化合物1e表现出最佳的对接得分（-9.4），与其更高的抑制活性（IC50 = 4.2 μM）相符。

对接模式的分析显示，参考配体山柑酸A朝向Zn2+中心排列，其羧基位于直接相互作用的位置。相比之下，合成化合物占据了结合口袋的相似区域，但采用了不同的相互作用模式（图S19–S30）。它们的羰基主要通过氢键与周围的氨基酸残基相互作用，而不是与Zn2+离子配位，导致没有最佳的配位几何结构。因此，配体结合主要是通过氢键、疏水相互作用和活性位点内的π–π堆叠来稳定的。化合物1e显示出比山柑酸A更多的稳定相互作用，这与它更高的对接得分和预测的结合亲和力一致（图2）。

1-苯基-1,2,3-三唑1b被选为在完整的NCI 60细胞面板中进行生物评估，并在接近h-FTase IC50值（12.6 μM，表1）的单次剂量（10 μM）下进行测试。该筛选使用了代表白血病、黑色素瘤以及肺癌、结肠癌、脑癌、卵巢癌、乳腺癌和肾癌的60种不同的人类肿瘤细胞系。结果表明，化合物1b能够抑制几种癌细胞的生长（图3）。在17种不同的癌细胞系上记录到超过30%的抑制作用，如图2所示。报告的单一剂量测定值是相对于无药物对照和时间零点的细胞数量的增长。这允许检测生长抑制（值介于0到100之间）和致死性（值小于0）。对实验药物最敏感的细胞系是前列腺PC-3、CNS SNB-19、肾RXF393和乳腺癌MDA-MB-231细胞（图3）。除了对h-FTase的直接抑制作用外，这些结果还证实了实验分子1b在癌细胞功能模型中的细胞停滞作用。细胞生长抑制与对h-FTase的直接作用在同一范围内，化合物1b在几种细胞系上的GI50值处于微摩尔范围内（图3）。

接下来，通过对K562细胞进行流式细胞术，分析了当前研究中在体外对人类FTase最活跃的化合物1e以及参考物山柑酸A和已知强FTase抑制剂lonafarnib的细胞周期（图4）。山柑酸A在K562细胞上完全无活性，这证实了文献中的数据，即山柑酸A是单独酶测定中法尼基转移酶的强抑制剂（IC50 = 55 nM），但在整个细胞中无活性。lonafarnib和化合物1e分别在48小时和24小时时阻断了K562细胞的G2/M期细胞周期。Lonafarnib是一个阳性对照，根据细胞系的性质，它可以阻断G2/M期或G0/G1期的细胞周期。它在1 μM浓度下在48小时后阻断了K562细胞的G2/M期（图4）。吩噻嗪1e在10 μM浓度下显示出细胞毒性效应，阻止了对其对K562细胞细胞周期的影响的计算，但在5 μM浓度下经过24小时处理后显示出了与lonafarnib在48小时后的相同效果，即阻断了K562细胞的G2/M期（图4）。

接下来，对目前研究中在体外对人类FTase最活跃的化合物1e以及参考物山柑酸A和lonafarnib（已知的强FTase抑制剂）进行了细胞周期分析，使用K562细胞（图4）。山柑酸A在K562细胞上完全无活性，这证实了文献中的数据，即山柑酸A是分离酶测定中法尼基转移酶的强抑制剂（IC50 = 55 nM），但在整个细胞中无活性。lonafarnib和化合物1e分别在48小时和24小时时阻断了K562细胞的G2/M期细胞周期。Lonafarnib是一个阳性对照，根据细胞系的性质，它可以阻断G2/M期或G0/G1期的细胞周期。它以1 μM浓度在48小时后阻断了K562细胞的G2/M期（图4）。吩噻嗪1e在10 μM浓度下显示出细胞毒性效应，阻止了对其对K562细胞细胞周期的影响的计算，但在5 μM浓度下经过24小时处理后显示出了与lonafarnib在48小时后的相同效果，即阻断了K562细胞的G2/M期（图4）。

因此，在这项工作中合成了二十一种新化合物，其中包括三种中间体（2b、3a和3b）、十种1-(苯基)-1,2,3-三唑-4-取代衍生物（1a-j）和八种1-芳基-1,2,3-三唑-4-取代衍生物（2a-h）。这些装饰有1,2,3-三唑单元的吩噻嗪是从先前报道的母体分子K（图1）中得到的，并筛选了它们在体外抑制人类法尼基转移酶和癌细胞生长的潜力。对模型分子K的四个化学修饰点的研究建立了这一系列中的新的结构-活性关系。首先，用2-氯吩噻嗪替换吩噻嗪基团是可容忍的。其次，增加酰胺基团与1,2,3-三唑单元之间的连接体大小并没有显著影响新分子的抑制效果与模型分子K相比。值得注意的是，更灵活的1-苯基-1,2,3-三唑1通常比1-芳基-1,2,3-三唑2更具活性。在1-苯基-1,2,3-三唑1系列中，苯环的对位进行了不同的取代（Cl、Br、OMe、CN、pH]。目前研究中最佳的改变是在化合物1e中对位引入了联苯单元。后者的抑制效果优于模型化合物K（1e：IC50（h-FTase）= 4.2 μM 对比 K：IC50（h-FTase）= 8.3 μM）。其他先前报道的对h-FTase有利的取代基如氯、溴或氰，其活性大致与分子K相当，而甲氧基取代则对生物活性不利。总体而言，吸电子取代基比给电子取代基更有利于抑制活性。

在1-芳基-1,2,3-三唑2系列中，含有羧基团的衍生物在抑制人类FTase方面有效，而它们的甲基酯类似物则无活性。这突显了羧酸与酶相互作用的重要性。然而，甲基酯仍然很有趣，因为它们通常比游离羧酸具有更高的膜通透性，并且可以用作前药，在体内被内源性酯酶切割成活性游离羧酸。在NCI-60面板上对化合物1b的评估证实了这种新合成实验药物在几种癌细胞系上的抗肿瘤潜力。这种效应在PC-3、SNB-19、RXF393和MDA-MB-231癌细胞上尤为明显。

这项研究中最活跃的抑制剂化合物1e在阻断K562细胞G2/M期细胞周期方面与众所周知的人类法尼基转移酶抑制剂lonafarnib显示出相同的效果。该研究产生了一组针对人类法尼基转移酶的新吩噻嗪和三唑衍生物，这些衍生物在肿瘤学方面的进一步开发具有很大的潜力。

CRediT作者贡献声明
Gina-Mirabela Dumitriu：方法学、研究、数据整理。
Dalila Belei：可视化、监督。
Anca-Elena Dascalu：方法学、软件、可视化。
Xavier Thuru：撰写——原始草稿、验证、监督、资源、概念化。
Hassiba Bouafia：方法学、研究、数据整理。
Emilie Floquet：方法学、研究。
Alina Ghinet：撰写——审阅与编辑、撰写——原始草稿、验证、监督、资源、项目管理、数据整理、概念化。
Elena B?cu：撰写——审阅与编辑、监督、资源、数据整理、概念化。