基于二氰异佛尔酮的荧光探针，用于检测H2S并监测硝普钠的代谢

《Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy》：Dicyanoisophorone-based fluorescent probe for detecting H2S and monitoring nitroprusside metabolism

　　

张林萍|崔晓瑞|饶志华|徐友|李京翰|张文泰|涂秦|王金毅|袁茂森

西北农林科技大学化学与药学院，中国陕西省杨陵市712100

摘要

硫化氢（H₂S）是一种重要的多功能气体信号分子，在调节多种生理过程中起着关键作用。最近的研究表明，常用于治疗高血压和血管扩张的药物硝普钠（SNP）在其代谢过程中会产生H₂S。因此，实时监测H₂S可以追踪SNP在体内的代谢过程。在这项研究中，我们设计并合成了一种新型近红外（NIR）荧光探针RM，该探针基于激发态分子内质子转移（ESIPT）机制。该探针以二氰异佛尔酮作为荧光团，以2,4-二硝基苯结构作为H₂S的识别基团。与H₂S反应后，RM在688?nm处的荧光强度增强了11.6倍，检测限为0.83?μM，显示出对H₂S的良好选择性。细胞成像研究表明，RM能够可视化内源性和外源性H₂S，为监测生物系统中的SNP代谢提供了一种有前景的方法。

引言

硫化氢（H₂S）与一氧化氮（NO）和一氧化碳（CO）一样，是一种著名的多功能气体信号分子。作为一种内源性信号分子，H₂S在生物系统中调节多种生理过程并发挥多种作用[1]，[2]，[3]，[4]。内源性H₂S是由含硫氨基酸在相关酶的作用下生成的，包括半胱硫氨酸β-合成酶（CBS）、3-巯基丙酮酸硫转移酶（3-MST）和半胱硫氨酸γ-裂解酶（CSE）[5]。不同组织和器官中的H₂S浓度反映了生物体的整体健康状况[6]。研究表明，H₂S参与抗肿瘤活性、离子通道调节以及心血管功能，包括促进血管舒张、心脏保护和血管生成。此外，H₂S具有抗氧化和抗炎特性，可以抑制细胞外基质重塑和血管平滑肌细胞增殖[7]，[8]，[9]，[10]，[11]。市场上已有几种释放H₂S的药物，越来越多的证据表明H₂S的生成对其治疗效果有显著贡献。尽管这些药物最初并不是为了释放H₂S而设计的，但在某些情况下，它们的临床效果可以归因于这种分子的释放[12]，[13]，[14]，[15]。因此，开发释放H₂S的药物受到了广泛关注，目前有几种药物正在进行临床研究[16]，[17]。随着这些药物向临床应用的推进，建立实时监测体内动态H₂S变化的方法变得越来越重要[18]。

硝普钠（SNP）被认为是一种强效的血管扩张剂，也是主要的一氧化氮（NO）释放剂之一，广泛用于治疗高血压和急性心力衰竭[19]，[20]，[21]，[22]。SNP的临床剂量范围为0.3至10?μg/kg/min，它可以在体内产生微摩尔级别的代谢物。药理学初步研究表明，SNP与体内的含巯基生物分子相互作用，导致NO的释放[23]。释放的NO作为信号分子，调节细胞中生成H₂S的酶的活性或表达[24]。具体来说，NO水平的升高可以上调CSE的基因表达，从而诱导硫化氢的生成。这一NO介导的CSE上调作用得到了先前研究的支持[25]，并为我们实验中观察到的H₂S水平升高提供了合理的机制联系。因此，选择适当的分析工具进行H₂S的实时监测是追踪SNP体内代谢过程的有效策略。

内源性H₂S具有重要的生物医学意义[26]，[27]。传统的H₂S检测方法，包括比色法[28]、电位法[29]、高效液相色谱法[30]和免疫测定法[31]，[32]，通常受到复杂程序、大量样品需求、长时间检测和高成本的限制。相比之下，荧光成像技术具有操作简单、实时可视化和高空间分辨率等优点，使其成为H₂S检测的强大工具[33]，[34]，[35]，[36]。近年来，人们投入了大量精力开发用于检测巯基的荧光探针，从而创造了多种巯基响应探针[37]，[38]，[39]。然而，大多数这些探针在紫外-可见光区域发光，容易受到生物系统中内源性物质的干扰，这大大限制了它们在体内的应用[40]，[41]，[42]，[43]。相比之下，近红外（NIR）荧光探针因其强大的组织穿透力、低背景自荧光、良好的药代动力学、实时监测能力和对生物样本的最小光损伤而受到越来越多的关注[44]，[45]，[46]，[47]，[48]，[49]。

在这项研究中，我们开发了一种荧光探针RM，可以特异性检测H₂S（图1）。该探针以二氰异佛尔酮作为荧光团，并通过将苯环与苯并噻唑基团连接来增强斯托克斯位移。此外，通过在酚羟基位置引入2,4-二硝基氟苯，引入了特定的H₂S识别位点[50]。与H₂S反应后，2,4-二硝基苯硫醇被裂解，释放出酚羟基，随后触发酚羟基与相邻苯并噻唑之间的激发态分子内质子转移（ESIPT）过程，导致显著的荧光增强和明显的荧光颜色变化。RM的近红外发射特性使其具有深度组织穿透能力，非常适合生物成像。实验结果表明，RM能够在细胞水平上可视化内源性和外源性H₂S，并成功地在斑马鱼模型中可视化SNP代谢过程中H₂S的释放，显示出其在生物应用中的巨大潜力。

章节片段

材料和仪器

实验中使用的所有化学物质和溶剂均从商业供应商处购买，未经进一步纯化。阴离子储备溶液使用它们的钠盐制备，而阳离子储备溶液通过溶解相应的硝酸盐制备。各种自由基物种是根据支持信息中描述的标准方法生成的。标准溶液使用Milli-Q系统纯化的去离子水制备。

核

基于二氰异佛尔酮的荧光团在荧光探针设计中得到了广泛研究，因为它们具有优异的光稳定性、高荧光强度、大的斯托克斯位移和低的检测限[51]。我们通过在异佛尔酮的环己烯环上引入两个甲基来增加空间位阻，从而使用二氰异佛尔酮作为荧光团核心，设计了荧光探针RM，以提高发光效率。

结论

总之，基于H₂S对特定芳基醚键的断裂能力和ESIPT效应，我们成功开发了一种新型的基于二氰异佛尔酮的近红外荧光探针。该探针在检测H₂S方面表现出优异的性能，包括高荧光选择性、高灵敏度（检测限为0.83?μM）、良好的生物相容性和近红外发射（λ_em?=?688?nm）。它能够在HT-29活细胞中有效检测外源性和内源性H₂S。

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