开发一种针对直流电（DC）的沙门氏菌扩增RNA载体平台，该平台能够同时递送双重抗原和佐剂，以增强对H9N2禽流感的防护效果

《Veterinary Microbiology》：Development of a DC-targeting Salmonella- amplifying RNA vector platform co-delivering dual antigens and adjuvants for enhanced protection against H9N2 avian influenza

　　王明月|高宇鹏|张宇曦|杨天瑞|张宇航|孙燕|郭启宇|张格瑞|龚金硕|王珍楠|王春峰|姜彦龙 吉林农业大学动物医学院，吉林省动物益生菌工程研究中心，吉林省动物微生态与健康养殖重点实验室，教育部重大动物疾病微生态疫苗（药物）工程研究中心，长春130118，中国 **摘要** 禽流感病毒主要侵袭呼吸道黏膜，因此需要建立强大的黏膜分泌型IgA（sIgA）屏障。然而，禽类黏膜疫苗的有效性常常受到抗原摄取效率低下和免疫耐受性的阻碍。因此，现代疫苗策略侧重于主动靶向递送、免疫微环境重塑以及多方面免疫反应的激活。本研究评估了一种新型沙门氏菌递送的自扩增RNA（saRNA）载体的免疫原性和分子机制。该平台将针对树突状细胞（DC）的纳米抗体（Nb-phage54通过LppOmpA）整合到细菌表面，并与针对H9N2流感的分子佐剂共表达。使用共聚焦显微镜和Western blot分析确认了重组质粒（pYL673、pyL679和pyL681）中的HA1和NA抗原的表达。体外实验表明，Nb介导的靶向菌株（S673）显著提高了对骨髓来源树突状细胞的侵袭效率，并上调了CCL5、CCR7、CD83和CD86的表达，有效促进了DC的成熟。转录组分析（RNA-seq）显示不同疫苗候选物之间存在差异：非靶向组（S615）主要激活了抗病毒的先天途径（如JAK-STAT），而靶向组（S673）显著改善了抗原处理、呈递和自然杀伤细胞介导的细胞毒性。此外，整合了佐剂的组别S679（CpG）和S681（FliC）通过增加细胞黏附、吞噬作用和跨膜信号转导，特异性激活了Toll样受体-21（TLR21）和TLR5信号通路。动物实验显示，靶向佐剂载体（S679和S681）显著提高了鸡体内的血清IgG和肠道黏膜sIgA水平。S679组在刺激淋巴细胞增殖和分泌干扰素-γ和白细胞介素-4方面表现优异，表明其具有强大的Th1/Th2平衡反应。用H9N2病毒进行的挑战实验证实，S679和S681有效减轻了体重下降，缩短了病毒排毒窗口期，减少了肺部和气管中的病毒载量，并显著缓解了呼吸道病理损伤和炎症。本研究开发的针对DC的saRNA-沙门氏菌载体，尤其是在与CpG或FliC佐剂协同使用时，通过激活特定的细胞内信号通路，诱导了强烈的系统性、黏膜和细胞免疫。这些发现表明，该平台是一种高效且有前景的预防和控制H9N2禽流感的策略。 **引言** 自20世纪90年代中期以来，H9N2亚型禽流感病毒（AIV）在多个亚洲国家的家禽中传播，对全球家禽产业构成了持续威胁（Kim等人，2006；Zhou等人，2024）。H9N2于1994年首次在中国广东省的病鸡中被分离出来（Sun等人，2010）。该病毒会引起轻微的呼吸道症状，并显著降低产蛋量。该病毒具有广泛的宿主范围，可感染鸡、鸭、鹅、鹌鹑和鸽子（Jin等人，2020）。值得注意的是，鹌鹑被认为是病毒适应哺乳动物受体的关键中间宿主，从而促进了跨物种传播（Perez等人，2003）。 病毒的进化主要依赖于抗原漂变和基因重组，形成了包括BJ/94样、G1样和Y280样在内的主要谱系（Adel等人，2017）。值得注意的是，G57基因型已成为中国的主要流行株。这种基因型在其血凝素（HA）蛋白中积累了突变，这些突变增强了与哺乳动物受体的结合能力，并成为高度致病性病毒（如H7N9）出现的内在基因来源（Daidoji等人，2024）。这对公共卫生和畜牧业构成了双重风险。 H9N2病毒的包膜包含两种关键糖蛋白：HA和神经氨酸酶（NA）。HA是最丰富的表面蛋白，以三聚体形式存在，其中HA0前体通过二硫键切割成HA1和HA2亚单位（Wilson等人，1981）。HA1形成负责受体结合的球状头部，是中和抗体的主要靶标，其N-糖基化可以掩盖抗原表位，这是免疫逃逸的关键机制（Skehel和Wiley，2000；Wei等人，2010）。NA在病毒释放中起重要作用。NA茎部63-65位置的氨基酸缺失提高了病毒对陆地家禽的适应性和在禽胚及哺乳动物细胞中的复制效率（Zhang等人，2018）。此外，NA相对保守的催化中心仍然是开发抗流感药物的关键靶标。 由于AIV主要进入呼吸道黏膜，因此在黏膜部位建立有效的分泌型IgA（sIgA）免疫屏障至关重要。然而，禽类黏膜免疫系统面临抗原摄取效率低下和免疫耐受性高的瓶颈（Lycke，2012）。现有的黏膜策略难以克服这些障碍。纳米颗粒递送系统依赖于低效的被动扩散，通常无法打破口服耐受性（Marasini等人，2014）。同时，传统的活载体疫苗缺乏对抗原呈递细胞的主动靶向，并且外源性抗原表达水平较低（Clark-Curtiss和Curtiss，2018；Galen和Curtiss，2014）。因此，研究方向转向开发能够实现主动靶向递送、免疫微环境重塑和多方面免疫反应协同激活的新疫苗策略。 减毒沙门氏菌由于其天然定植于肠道相关淋巴组织的能力，是外源性抗原的理想载体（Pasetti等人，2003；Shrestha等人，2021）。树突状细胞（DC）是先天免疫和适应性免疫之间的关键桥梁，是疫苗接种的主要靶标（Ge等人，2025a）。口服疫苗的挑战在于抗原的稀释和DC的有限摄取效率。通过用特定配体（如DEC-205或CD11c）修饰载体表面，可以显著提高抗原呈递效率（Shrestha等人，2021）。 为了进一步提高活载体疫苗的效果，研究人员专注于优化核酸表达系统。自扩增RNA（saRNA）载体作为一种新型平台应运而生。通过利用自编码的复制酶复合体，saRNA在细胞质中启动抗原mRNA的级联扩增，即使在低剂量下也能保证高水平的蛋白质表达（Barton等人，2025；Gong等人，2024）。这有效解决了传统DNA质粒在沙门氏菌介导的核酸递送中存在的低表达效率问题。此外，saRNA复制过程中产生的双链RNA（dsRNA）中间体可作为强大的模式识别受体配体（Pollard等人，2013）。