构建并评估源自禽源大肠杆菌的细菌仿生囊泡，该囊泡能够展示H9亚型禽流感病毒的HA1蛋白及其免疫原性

《Veterinary Microbiology》：Construction and Immunogenicity Evaluation of Avian Escherichia coli-derived Bacterial Biomimetic Vesicles Displaying H9 Subtype Avian Influenza Virus HA1 Protein

　　

岳丽|权宇智|权克基|林梦琪|陈鹏|诸葛向凯|秦涛|陈素娟|尹云聪|彭大新

中国江苏省扬州市扬州大学兽医学院

摘要

H9N2亚型禽流感病毒（AIV）和致病性大肠杆菌（APEC）的共感染在禽类中很常见，但目前尚无能够同时预防这两种感染的疫苗。从禽类大肠杆菌中提取的仿生细菌囊泡（BBVs）是一种用于递送异源亚单位抗原的平台。在这项研究中，采用了一种抗原展示策略，即将H9血凝素亚单位HA1与外膜锚定蛋白细胞溶素A（ClyA）进行基因融合，然后通过高压均质化制备BBV-HA1。用BBV-HA1对无特定病原体的鸡进行鼻内免疫后，可诱导出强烈的黏膜和系统性免疫反应。与PBS对照组相比，BBV-HA1疫苗接种显著提高了针对APEC外膜蛋白和H9N2 AIV HA抗原的血清IgY水平，并增强了鼻和气管灌洗液中的分泌型IgA水平。具体来说，在BBV-HA1组免疫鸡的血清中检测到针对H9N2 AIV的血凝抑制滴度为5.2 ± 0.84 log2，同时体外杀菌活性也有所提高。体外重新刺激外周血淋巴细胞后，BBV-HA1组鸡的增殖指数更高，流式细胞术显示CD4⁺/CD8⁺比率升高。感染后，BBV-HA1降低了APEC O78细菌载量，减轻了气囊和心脏病变，并加速了体重恢复。在H9N2感染后，第7天时，2/8只BBV-HA1免疫鸡的口咽部检测到病毒载量，而PBS接种组为6/8只。这些结果表明，锚定在BBV上的HA1能够诱导协调的黏膜和系统性免疫反应，提供对H9N2禽流感病毒和APEC O78的双重保护。

引言

在现代养禽业中，涉及多种病原体的共感染非常普遍，尤其是在高密度饲养和不良管理条件下（Hassan等人，2016；Yehia等人，2023）。其中，禽流感病毒（AIV）是一个主要问题，因为它在鸟类群体中广泛传播，并具有动物源性传播潜力，对养禽业和公共卫生构成持续威胁（Su等人，2015；Su等人，2017；Ma等人，2018b）。自2016年以来，H9N2 AIV已取代H5N6和H7N9成为中国养禽业中主要的流行亚型（Bi等人，2020）。尽管H9N2感染本身通常致病性较低，很少导致鸡直接死亡，但它仍导致了巨大的经济损失（Pan等人，2012；Sun和Liu，2015；Li等人，2019）。这种矛盾主要源于其诱导免疫抑制的能力，使受感染的鸟类容易受到细菌和其他病原体的二次感染。

在这些细菌病原体中，致病性大肠杆菌（APEC）是最普遍且后果最严重的之一。H9N2 AIV和APEC的共感染常常导致临床症状加剧、死亡率升高、生长性能下降以及动物源性传播风险增加（Bano等人，2003；Gu等人，2017）。此类共感染在养禽业中越来越普遍，导致重大经济损失，并对养禽业的可持续发展构成重大挑战（Mahmoud等人，2022）。

H9N2 AIV和APEC之间的致病协同作用涉及病毒和细菌毒力因子与宿主免疫反应之间的复杂多因素相互作用。H9N2 AIV感染会破坏宿主的防御屏障，通过上调TGF-β1、整合素、E-钙粘蛋白和纤维连接蛋白等宿主因子来促进细菌的附着和扩散（Ma等人，2018a；Wang等人，2023）。此外，它还会破坏肠道微生物群，损害肠上皮完整性并引发炎症，从而增强APEC的定植和迁移（Li等人，2018）。这些机制凸显了有效控制此类共感染的挑战性。

疫苗接种仍然是预防AIV的基石。自1998年以来，中国广泛使用了灭活H9N2疫苗，但其有效性常常受到抗原漂移、保护范围狭窄和接种要求不便的限制（Tandrup Schmidt等人，2016）。多价灭活疫苗（如新城疫-H9或新城疫-传染性支气管炎-H9制剂）有助于扩大保护范围，但仍存在传统灭活疫苗的固有局限性。重要的是，目前还没有商业疫苗能够同时预防H9N2 AIV和APEC。这一空白突显了迫切需要创新、安全且具有广泛保护效果的疫苗，如DNA疫苗、病毒载体疫苗或亚单位疫苗，以实现H9N2-APEC共感染的综合控制。亚单位疫苗具有明显的优势，包括优异的安全性和精确的抗原靶向性；然而，它们往往引发的免疫反应有限，因此需要优化的递送平台来增强抗原呈现和免疫刺激（Tandrup Schmidt等人，2016；Khalaj-Hedayati等人，2020；Alqazlan等人，2022；Abdelaziz等人，2024）。细菌外膜囊泡（OMVs）及其工程改造版本由于其可扩展性、内在的佐剂效应和多价抗原展示能力而成为有前景的纳米载体系统（Gerritzen等人，2017）。细胞溶素A（ClyA）已被广泛用作OMV锚定支架，在囊泡表面呈现异源抗原。然而，自发的OMV生物发生和天然蛋白质输出途径限制了抗原的加载。高压均质化可以通过将细菌膜转化为细菌仿生囊泡（BBVs）来克服这些限制，从而提高膜相关抗原的密度（Yang等人，2021）。

目前，控制H9N2 AIV和APEC主要依靠预防性疫苗接种和抗生素治疗。然而，AIV的快速抗原演变和多重耐药APEC菌株的出现削弱了这些策略的效果。APEC包含多种血清型，其中O78在全球临床分离株中占主导地位。工程改造的大肠杆菌OMVs通常提供的交叉血清型保护有限，因为异源抗原表达无法完全再现天然APEC表位（Ghunaim等人，2014）。因此，利用血清型特异性的APEC菌株开发能够同时预防H9N2 AIV和APEC的双价亚单位疫苗是一个亟待满足的需求。

在这项研究中，将ClyA介导的表面展示与高压均质化结合，生成了展示H9 HA1亚单位的APEC BBVs。此外，还评估了这些BBVs对无特定病原体（SPF）鸡中H9N2 AIV和APEC O78的免疫原性和保护效果。

章节片段

伦理和动物福利

所有动物实验均获得了江苏省实验动物管理委员会的批准（许可证编号：SYXKSU-2016-0020），并按照ARRIVE Essential 10指南和机构护理协议进行。使用来自中国浙江丽华农业公司的无特定病原体白来航鸡，每组随机分配8只混性鸡，饲养在通风负压隔离器中（22–24°C，45–55%湿度，12小时光照/黑暗周期），提供自由采食和饮水。未发生不良事件

用于BBV生产的ΔtolA/ΔaraD J11供体菌株的构建

野生型大肠杆菌可以代谢L-阿拉伯糖，这可能会干扰用于异源蛋白生产的阿拉伯糖诱导表达系统。为了实现更稳定的表达控制，使用λ-Red重组系统从ΔtolA J11菌株中删除了araD基因（图1a）。使用同源臂引物（F2/R2）进行PCR分析后，从亲本ΔtolA J11菌株中获得了797 bp的araD基因扩增子，以及等位基因中的1,122 bp卡那霉素抗性基因扩增子

讨论

在这项研究中，我们使用工程改造的细菌仿生囊泡（BBVs）开发了一种H9N2 HA1候选疫苗，并评估了其免疫原性和保护效果。BBV-HA1疫苗引发了强烈的系统性体液反应，并且在鼻腔和气管中诱导了强烈的HA1特异性黏膜sIgA。黏膜免疫作为抵御呼吸道病毒的第一道防线至关重要，能有效限制AIV的复制和传播。值得注意的是，可溶性HA1并未

结论

在这项研究中，成功构建了双基因突变体ΔtolA/ΔaraD J11，该菌株在L-阿拉伯糖诱导下能够稳定表达异源蛋白，为亚单位疫苗的开发提供了可靠的技术平台。此外，我们开发了一种基于仿生细菌囊泡（BBV）的亚单位疫苗，能够有效呈现H9N2 AIV的HA1蛋白。免疫学评估和挑战实验证实，这种疫苗能够诱导强烈的黏膜和

CRediT作者贡献声明

权宇智：研究。彭大新：撰写 – 审稿与编辑、监督、资金获取、概念设计、资源提供。林梦琪：研究。陈鹏：研究。陈素娟：资源提供、资金获取、概念设计。秦涛：资源提供、方法学设计、概念设计。权克基：概念设计。尹云聪：撰写 – 审稿与编辑、方法学设计、概念设计。诸葛向凯：资源提供。岳丽：撰写 – 初稿撰写、方法学设计、研究、格式化

利益冲突声明

作者声明没有利益冲突。

致谢

本研究得到了江苏省重点研发项目（BE2022329）、扬州大学“杰邦瓜帅”项目（YZUXK202316）、江苏省高校杰出技术创新团队（[2021]编号1）、111项目（D18007）以及江苏省高等教育优先学术计划（PAPD）的资助。