利用表达生物发光报告基因的重组Getah病毒实现感染动态的实时可视化

《Veterinary Microbiology》：Real-Time Visualization of Infection Dynamics Using a Bioluminescent Reporter-Expressing Recombinant Getah Virus

　　

任同伟|王国伟|李佩杰|钟振|刘沐阳|张丽萍|秦一峰|欧阳康|陈颖|黄伟健|魏祖章

广西大学动物科学与技术学院动物传染病与分子免疫学实验室，南宁，530005，中国

摘要

Getah病毒（GETV）是一种由节肢动物传播的阿尔法病毒，已成为导致猪繁殖失败和系统性疾病的重要病原体，给畜牧业造成了巨大的经济损失，并构成了潜在的人畜共通感染威胁。目前尚无批准的疫苗或抗病毒疗法。在本研究中，我们利用反向遗传学技术构建了一种重组GETV（rGECNLuc），该病毒表达了Nanoluciferase（NLuc）报告基因。报告基因通过T2A自切割肽插入病毒衣壳（Cap）蛋白的C末端，以实现共翻译释放。体外实验表明，rGECNLuc在BHK-21和Vero细胞中高效复制，其斑块形态和多步生长动力学与亲本病毒rGETV-GX相当。NLuc插入序列在连续六次传代后仍保持遗传稳定性，未发生删除。在10日龄乳鼠模型中的体内评估显示，尽管rGECNLV在关节、肺和脑组织中能够高效复制，但其毒力显著减弱。通过体内成像（IVIS）技术，我们发现3周龄和5周龄小鼠的生物发光信号强度与病毒载量之间存在强正相关。信号从接种部位系统性扩散，在关节和肺部尤为明显，且年轻动物的信号强度更高。总体而言，rGECNLuc能够实现GETV感染的实时、无创可视化，并为量化病毒传播、组织嗜性及体内抗病毒活性提供了便捷的平台。

引言

Getah病毒（GETV）是一种重新出现的由节肢动物传播的阿尔法病毒，1955年首次在马来西亚的库蚊中被发现（Li等人，1992年）。该病毒已分化为四个系统发育上不同的组别（I-IV），当前流行的毒株主要属于第三组（Shi等人，2022年；Yuan等人，2025年）。近年来，从越来越多的脊椎动物宿主体内分离出了GETV（Li等人，2022年；Liu等人，2019年；Shen等人，2025年）。最初的研究表明，该病毒在马中的感染是自限性的，表现为发热和淋巴结肿大（Lu等人，2019年；Takeishi等人，2022年），但后来发现它与猪的重大疫情有关。这些疫情表现为母猪的繁殖失败和仔猪的系统性疾病，包括发热、腹泻、神经系统损伤和死亡，给畜牧业带来了巨大的经济损失（Guo等人，2025年；Lan等人，2024年；Sun等人，2025年；Wu等人，2024年）。在野生动物中也发现了感染的血清学或分子证据，包括野猪（Huang等人，2025年）、蓝狐（Shi等人，2019年）和穿山甲（Xiao等人，2025年）。尽管尚未建立与人类临床疾病的直接因果关系，但在人类血清中检测到GETV特异性抗体表明其具有潜在的人畜共通感染威胁（Li等人，2022年）。疾病控制的一个关键障碍是目前缺乏许可的预防性疫苗或特定的抗病毒疗法。

GETV的基因组结构符合典型的阿尔法病毒特征。其正链单链RNA基因组两侧有5'和非翻译区（UTRs），具有5'端帽结构和3'端多聚腺苷酸尾（Li等人，2017b）。基因组编码两个开放阅读框（ORFs）。5'端的ORF翻译成非结构蛋白（nsP1-nsP4），这些蛋白组装成病毒复制复合体，负责基因组RNA的复制和亚基因组RNA（sgRNA）的转录。这种sgRNA从负链复制中间体的内部启动子转录而来，编码结构多聚蛋白。随后的共翻译和翻译后加工产生了成熟的病毒颗粒成分：衣壳（Cap）蛋白和包膜糖蛋白E3、E2、E6和E1（Brown等人，2018年）。Cap蛋白的C末端结构域具有胰蛋白酶样丝氨酸蛋白酶活性，可催化其从新合成的结构多聚蛋白中自主释放（Reichert等人，2009年）。

反向遗传学技术使得RNA病毒基因组的精确操作成为可能，促进了重组报告病毒的开发。这些工具对于高通量抗病毒筛选和快速中和实验至关重要。历史上，人们使用了荧光蛋白如GFP（Zhang等人，2020年）、eGFP（Shi等人，2023年）、mCherry（Kobayashi等人，2023年）和iLOV（Jin等人，2023年）进行体外监测。然而，编码这些报告蛋白的病毒通常不适合通过体内成像系统（IVIS）对活体动物进行长期、无创的追踪（Tran等人，2013年）。为了解决这一限制，人们广泛采用了使用Renilla luciferase（Rluc）或Firefly luciferase（Fluc）或分泌型Gaussian luciferase（Gluc）等酶的生物发光报告系统（Marinho等人，2024年；Sun等人，2014年；Teo等人，2013年）。这些系统能够实现感染的空间和时间量化，从而详细绘制病毒传播和组织嗜性的图谱（Cook和Griffin，2003年）。最近，Nanoluciferase（NLuc）作为一种优越的报告蛋白受到关注，因为它具有较小的分子大小、不依赖ATP的活性、出色的热稳定性、强烈的信号输出和高灵敏度，特别适合体内成像应用（Belarbi等人，2019年；Kim等人，2022年；Wang等人，2020年；Xu等人，2024年）。对于包括Semliki Forest病毒（SFV）（Shi等人，2023年）、Sindbis病毒（SINV）（Cook和Griffin，2003年）、Mayaro病毒（MAYV）（Marinho等人，2024年）和Chikungunya病毒（CHIKV）（Deng等人，2016年）在内的阿尔法病毒，主要通过在非结构区和结构区之间插入外源基因，并利用内源性或工程化的蛋白酶切割位点来实现报告基因的释放。

基于我们之前的研究，证明了GETV衣壳蛋白C末端能够容纳外源基因的插入（Ren等人，2023年），我们在本研究中采用了这一策略。我们通过T2A自切割肽将NLuc基因融合到Cap蛋白的C末端，构建了重组GETV rGECNLuc。体外实验确认，rGECNLuc的复制动力学与亲本病毒相当，并产生了形态相似的斑块。在10日龄乳鼠模型中的评估显示，rGECNLuc引起的临床症状与亲本菌株rGETV-GX相似，但毒性显著减弱。NLuc报告基因在细胞培养中连续六次传代后仍保持稳定。值得注意的是，在3周龄和5周龄小鼠中，rGECNLV的感染显示出生物发光信号强度与体外和体内的病毒载量之间存在强正相关。这些发现共同证明了rGECNLuc是一种强大的、多用途的工具，可用于实时可视化GETV感染。该模型对于阐明病毒致病机制以及快速评估针对这种新兴病原体的抗病毒化合物和疫苗候选物具有巨大潜力。

部分摘录

细胞、病毒、质粒和抗体

BHK-21（ATCC CCL-10）和Vero（ATCC CCL-81）细胞在添加了10%胎牛血清（FBS，Hyclone）和抗生素/抗真菌溶液的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM，Gibco）中培养，培养条件为37℃和5% CO₂环境。GETV GX201808株（GenBank编号MT269657）的全长感染性cDNA克隆（pGETV-GX）的构建以及针对GETV E2的多克隆抗体（PcAb）和针对GETV衣壳（Cap）的单克隆抗体（mAb）的制备已经完成

报告病毒可以通过转染重组质粒的BHK-21细胞恢复

NLuc报告基因直接插入衣壳（Cap）蛋白编码序列的下游，NLuc之后插入T2A自切割肽序列，以实现外源蛋白的共翻译分离（图1A）。将重组全长cDNA克隆转染到BHK-21细胞后，再用收集的上清液接种新鲜细胞，18小时后出现明显的CPE现象，表现为细胞肿胀、圆化和脱落（图1B）。为了确认

讨论

像CHIKV和西方马脑炎病毒（WEEV）这样的阿尔法病毒的重新出现凸显了研究其流行病学、致病机制和控制措施的迫切需求（Wang等人，2025年；Zhang等人，2025年）。作为这一属的成员，Getah病毒（GETV）在宿主范围和毒力方面表现出扩展趋势，这表明研究需要超越监测范围，进一步探讨其发病机制

伦理批准

动物实验获得了广西大学动物实验委员会的批准，批准编号为（GXU2022-288）。

资助

本工作得到了广西自然科学基金（项目编号2023GXNSFAA02649，2026GXNSFBA00640123）和广西大学高级人才研究基金（项目编号XGZ130959）的财政支持。

CRediT作者贡献声明

任同伟：撰写——原始草案、软件开发、方法学设计、实验实施、数据分析、数据管理。李佩杰：实验实施、数据分析、数据管理。王国伟：方法学设计、数据分析、概念构思。刘沐阳：方法学设计、数据分析、数据管理。钟振：方法学设计、实验实施、数据分析。秦一峰：验证、监督、软件使用、资源协调。张丽萍：方法学设计、数据分析。陈颖：

作者声明不存在任何利益冲突。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能影响本文研究的财务利益或个人关系。