《Veterinary Microbiology》：BVDV NS5A promotes mitochondria-associated endoplasmic reticulum membrane (MAM) formation to enhance viral replication
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张向银|张玲玲|张静怡|薛家倩|孙宇涵|马雪莲|童德文|赵晓敏
中国陕西省杨陵市西北农林科技大学兽医学院，邮编712100
摘要
牛病毒性腹泻病毒（BVDV）的非结构蛋白5A（NS5A）是一种多功能病毒因子，它协调BVDV RNA的复制和组装。线粒体相关内质网膜（MAM）已成
张向银|张玲玲|张静怡|薛家倩|孙宇涵|马雪莲|童德文|赵晓敏
中国陕西省杨陵市西北农林科技大学兽医学院，邮编712100
摘要
牛病毒性腹泻病毒（BVDV）的非结构蛋白5A（NS5A）是一种多功能病毒因子，它协调BVDV RNA的复制和组装。线粒体相关内质网膜（MAM）已成为脂质代谢、Ca2?信号传导和病毒复制的关键平台。然而，BVDV NS5A是否通过靶向MAM来促进病毒复制仍不清楚。在本研究中，我们证明了BVDV的NS5A通过增加MAM的形成来促进病毒复制。 MAM对高效的病毒复制至关重要，并且受到BVDV NS5A的促进。NS5A直接与宿主的MAM连接蛋白——囊泡相关膜蛋白相关蛋白B（VAPB）相互作用，从而重塑这一细胞器界面。我们进一步将这种相互作用定位到NS5A上的特定结合位点，这些位点围绕关键残基（G246、K249、D259）以及（D398、K400、T402、D405）。重要的是，利用反向遗传学系统，我们发现破坏NS5A-VAPB相互作用的突变会消除MAM的扩张并严重损害病毒复制。相反，通过互补作用重新建立这种相互作用可以恢复MAM的完整性和病毒的传播。总体而言，我们的发现揭示了一种关键的宿主重塑机制，即BVDV NS5A与VAPB相互作用以扩大MAM平台，创造一个有利于病毒复制的环境。我们的工作将NS5A-VAPB界面确定为针对宿主的抗病毒策略的有希望的目标，这些策略可能适用于Pestiviridae家族中的相关成员。
引言
牛病毒性腹泻病毒1（BVDV-1）是一种有包膜的单链正链RNA病毒，属于Pestiviridae家族中的Orthopestivirus属，对全球养牛业构成了重大威胁。（Al-Kubati等人，2021年；Chi等人，2022年）。BVDV分布广泛，由于免疫抑制、呼吸系统和肠道疾病、繁殖失败以及产生持续感染的动物而造成巨大的经济损失（Hou等人，2025年；Werid等人，2023年）。BVDV包含两种生物型，它们根据在细胞培养中的效应进行定义。非细胞病变型（NCP）菌株会建立持续感染（PI），形成病毒库，这对病毒的流行病学至关重要（Holthausen等人，2025年），而细胞病变型（CP）菌株在PI动物体内会引起一种称为黏膜病的致命综合征（Yao等人，2025年）。与其他正链RNA病毒一样（Stancheva和Sanyal，2024年），BVDV的复制被认为发生在与重塑的宿主细胞内膜相连的膜相关复制复合体中，尽管其确切的膜起源不如某些其他Flasuviricetes病毒那么明确（Wang等人，2023年；Weiskircher等人，2009年）。然而，调控这一过程的确切分子机制仍不清楚。
线粒体相关内质网膜（MAM）是一个特殊的亚细胞结构，其中线粒体和内质网（ER）物理上相连（Giacomello和Pellegrini，2016年）。这一动态界面调控许多基本的细胞过程，包括细胞内钙（Ca2?）的稳态、脂质合成和运输、线粒体动态以及先天免疫反应的启动（Cohen等人，2018年；Liu等人，2025b年；Mao等人，2022年；Panda等人，2021年）。由于其在协调细胞代谢和防御中的核心作用，MAM已成为多种病毒病原体操纵的主要目标，这些病原体利用这一界面来创造有利于病毒复制的环境（Sun等人，2025年；Williamson和Colberg-Poley，2009年；Zhang等人，2023年）。越来越多的证据表明，病毒已经进化出复杂的策略来调节MAM以促进病毒复制。丙型肝炎病毒（HCV），属于Hepaciviridae家族中的Orthohepacivirus属，通过重塑MAM来形成一个受保护的病毒复制平台，从而增强病毒复制（Anggakusuma等人，2016年；Duponchel等人，2023年）。HCV和BVDV都属于Amarillovirales目，因此BVDV的复制可能通过增加MAM的形成而得到增强。除了Amarillovirales之外，慢病毒如马传染性贫血病毒（EIAV）也调节MAM以促进其包膜蛋白的产生（Duan等人，2022年）。这些例子突显了一种共同的进化策略，即病毒通过靶向MAM来控制细胞内的关键过程，如信号传递和脂质运输，以实现高效复制。HCV的非结构蛋白NS5A通过N端两亲性螺旋与内质网（ER）膜相连，并促进HCV的复制（Chen和Harris，2023年），这表明NS5A可能通过增加MAM的形成来促进HCV的复制。
MAM界面由多种连接ER和线粒体的连接蛋白维持，包括线粒体融合蛋白2（MFN2）和囊泡相关膜蛋白相关蛋白B（VAPB）（Mao等人，2022年；Naon等人，2016年）。VAPB是一种驻留在ER中的蛋白，它通过与线粒体蛋白蛋白酪氨酸磷酸酶相互作用蛋白-51（PTPIP51）相互作用形成关键的连接复合体（Yang等人，2025年）。VAPB-PTPIP51桥对于脂质转移和钙信号传导等细胞过程至关重要（Bezawork-Geleta等人，2025年；Gomez-Suaga等人，2017年；Obara等人，2024年）。NS5A-VAPB相互作用对于将病毒复制机制招募到MAM中至关重要，从而为病毒传播创造一个受保护的环境。
先前的研究表明，HCV NS5A与VAPB相互作用（Hamamoto等人，2005年；Wang和Tai，2019年）。这些发现提出了BVDV NS5A也可能与这种重要的MAM蛋白相互作用的可能性。然而，BVDV感染是否改变MAM的完整性以及其NS5A是否直接靶向VAPB以促进这一过程仍然是一个关键的未解问题。
在这项研究中，我们系统地研究了NS5A通过调节MAM形成对BVDV复制的影响。我们首次证明BVDV感染显著增强了MAM的形成。我们进一步提供了强有力的遗传证据，表明这种增强是由BVDV NS5A与宿主VAPB之间的直接、特异性相互作用驱动的。通过绘制关键结合位点并进行遗传拯救实验，我们证明了NS5A-VAPB相互作用对于建立病毒复制环境和高效病毒复制是不可或缺的。总的来说，我们的发现揭示了一种关键的宿主重塑机制，并将NS5A-VAPB界面确定为开发抗BVDV治疗药物的有希望的目标。
部分摘录
病毒和细胞系
MDBK细胞系（ATCC，CCL-22）在添加了10%胎牛血清（FBS；Gibco，美国）、100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM；Thermo Fisher Scientific，美国）中培养。细胞在37°C、5% CO2的湿润培养箱中维持。BVDV NADL菌株是一种细胞病变型（CP）生物型，从中国兽药监督研究所获得，在MDBK细胞中繁殖，并通过测定TCID??进行滴定。
BVDV-WT感染促进MAM形成
为了确定BVDV感染是否影响MAM的结构，MDBK细胞被BVDV NADL野生型（BVDV-WT）感染。本研究中使用的感染条件（MOI和时间点）是基于初步优化选择的，以捕捉病毒复制活跃但尚未出现广泛细胞病变变化的窗口期。在假感染细胞中可以检测到ER-线粒体接触，这与基础状态一致，
讨论
在这项研究中，我们发现了一种机制，通过这种机制BVDV重塑宿主细胞器界面以支持复制。利用基于邻近性的读数（Tom20-Calnexin PLA和共定位）以及遗传和生化方法，我们显示感染增加了ER-线粒体的接触，并确定NS5A是主要的病毒决定因素。从机制上讲，NS5A与ER连接蛋白VAPB结合，抑制或增强这种相互作用支持NS5A-VAPB复合体的作用
伦理批准和参与同意
所有动物实验均根据西北农林科技大学动物福利和伦理委员会的指南获得批准并执行（许可编号IACUC2024–1222）。
资助
本研究得到了陕西省创新能力支持计划（资助编号：2025JC-GXPT-018）、动物生物制品联合开发（K4050722009）和陕西省动物疫病预防专项基金（XNDY-DF2401）的支持。
CRediT作者贡献声明
赵晓敏：撰写——审稿与编辑、资源获取、项目管理。张玲玲：撰写——审稿与编辑。张静怡：验证。张向银：撰写——初稿、研究。马雪莲：资源获取。孙宇涵：研究。童德文：资源获取。薛家倩：研究。孙宇涵：监督。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。
致谢
我们感谢西北农林科技大学提供实验平台。我们还要感谢军事医学科学院军事兽医医学研究所的He Biao博士提供的E2抗体。
