由具有IRES样活性的猪流行性腹泻病毒5′ UTR介导的、不依赖于帽结构（cap）的翻译过程

《Veterinary Microbiology》：Cap-independent translation mediated by the 5′ UTR of porcine epidemic diarrhea virus with IRES-like activity

　　

Xiaotian Chang|Zheng Chen|Jiafu Zhao|Bingcong Xia|Yize Yan|Yingqian Han|Heshui Zhu|Chao Zhang

中国河南省郑州市河南农业大学兽医学院国家动物免疫学国际联合研究中心，邮编450046

摘要

猪流行性腹泻病毒（PEDV）依赖于其基因组RNA的有效翻译来实现有效感染，但调控病毒蛋白合成的机制仍不完全清楚。在这项研究中，我们探讨了PEDV 5′非翻译区（5′ UTR）是否能够介导帽依赖性翻译。我们使用了一个双基因荧光素酶报告系统，其中Renilla荧光素酶（RLUC）和萤火虫荧光素酶（FLUC）分别作为上游和下游基因。将PEDV 5′ UTR插入这两个报告基因之间后，与阴性对照相比，下游基因的翻译显著增强，尽管其活性低于脑心肌炎病毒（EMCV）内部核糖体进入位点（IRES）的活性。进一步的实验排除了其他可能的解释，包括隐秘RNA剪接和核糖体穿读。虽然在基于质粒的报告系统中检测到了隐秘启动子活性，但使用体外转录的RNA和无细胞翻译实验确认PEDV 5′ UTR仍具有帽依赖性翻译活性。总体而言，这些结果表明PEDV 5′ UTR具有类似IRES的帽依赖性翻译起始功能。据我们所知，这是首次证明PEDV 5′ UTR具有IRES样活性的研究。这些发现为PEDV的翻译调控提供了新的见解，并提示病毒5′ UTR可能是抗病毒干预的潜在靶点。

引言

猪流行性腹泻（PED）是一种由猪流行性腹泻病毒（PEDV）引起的急性、高度传染性的猪肠道疾病，会导致严重的水样呕吐、腹泻和高死亡率（Li等人，2018年；Pensaert和de Bouck，1978年）。新生仔猪特别容易感染，死亡率常常接近100%（Sun等人，2012年）。PEDV属于冠状病毒科（Coronaviridae）中的Alphacoronavirus属。其基因组是一种约28 kb的正链单链RNA分子，包含5′和3′非翻译区（UTRs）、一个5′帽结构（m?GpppN）和一个3′多聚(A)尾。该基因组编码16种非结构蛋白（nsp1–nsp16），这些蛋白参与病毒复制，以及四种结构蛋白：刺突蛋白（S）、包膜蛋白（E）、膜蛋白（M）和核衣壳蛋白（N）（Huang等人，2022a；Huang等人，2022b；Lin等人，2017年）。作为一种必须依赖宿主的病原体，PEDV完全依赖宿主细胞的翻译机制进行蛋白质合成（Liu等人，2026年）。

在真核细胞中，mRNA翻译主要通过帽依赖性机制进行，这需要5′帽结构和多种翻译起始因子（eIFs）。在这个经典途径中，eIF4E识别5′帽，eIF4G将eIF3和40S核糖体亚基连接起来形成预起始复合体，而如eIF4A这样的RNA解旋酶有助于沿mRNA扫描到AUG起始密码子。随后招募60S核糖体亚基完成80S核糖体的形成，从而启动蛋白质合成（Jackson等人，2010年）。在细胞应激条件下——包括营养缺乏、缺氧或病毒感染——某些mRNA可以绕过帽依赖性要求并进行帽独立翻译。一些转录本能够同时进行帽依赖性和帽独立翻译（Holcik和Sonenberg，2005年）。大多数正链RNA病毒，包括SARS-CoV-2、PEDV、传染性胃肠炎病毒（TGEV）和MERS-CoV，主要依赖帽依赖性翻译（Lu等人，2020年；Nakagawa等人，2016年）。

然而，许多RNA病毒已经进化出利用内部核糖体进入位点（IRESs）进行帽独立翻译的策略。IRES元件是高度结构化的RNA序列，它们可以直接将核糖体招募到mRNA的内部位置，从而绕过对5′帽结构的需求。这种机制已在多个病毒科中得到广泛研究，包括小RNA病毒科（Picornaviridae）、杯状病毒科（Caliciviridae）和双节病毒科（Dicistroviridae）（Jaafar和Kieft，2019年），例如口蹄疫病毒（FMDV），以及丙型肝炎病毒（HCV）和人类免疫缺陷病毒（HIV）（Iwasaki等人，2025年；Kühn等人，1990年；Plank等人，2013年；Tsukiyama-Kohara等人，1992年）。此外，有证据表明某些正链RNA病毒也可能表现出IRES样活性。例如，登革热病毒（DEN）的5′非翻译区（5′ UTR）已被报道能够介导帽独立翻译，即使在帽依赖性翻译受到抑制的情况下，病毒RNA仍能保持翻译活性（Edgil等人，2006年；Fernández-García等人，2021年；Song等人，2019年）。

从结构上看，病毒IRES元件通常形成复杂的RNA二级结构，如茎-环基序，这些结构有助于直接或辅助招募核糖体机制和相关起始因子（Banna等人，2026年；Chapagain等人，2025年；Sherlock等人，2026年）。鉴于猪流行性腹泻病毒（PEDV）必须与宿主mRNA竞争使用细胞翻译装置，因此在感染期间采用提高翻译效率的替代机制可能具有优势。值得注意的是，PEDV的5′非翻译区（5′ UTR）包含多个预测的茎-环结构（SL1、SL2、SL4和SL5），这些结构已被证明参与病毒蛋白翻译的调控（Hao等人，2025年；Luo等人，2025年）。这些结构特征表明PEDV 5′ UTR可能参与了非经典的翻译起始机制。

基于这些观察结果，我们假设PEDV也可能采用帽独立翻译策略。为了验证这一假设，我们将PEDV 5′ UTR插入到一个双基因荧光素酶报告系统中，其中Renilla荧光素酶（RLUC）作为上游基因，萤火虫荧光素酶（FLUC）作为下游基因。作为阳性对照，使用了经典的脑心肌炎病毒（EMCV）IRES。为了准确解释双基因报告系统的活性，进行了适当的对照实验，排除了核糖体穿读、隐秘启动子活性和基于质粒系统的选择性RNA剪接等潜在解释。此外，还使用了体外转录的RNA和无细胞翻译实验来进一步验证PEDV 5′ UTR介导的帽独立翻译活性。我们的研究结果表明，PEDV 5′ UTR具有功能性IRES样活性，揭示了病毒蛋白合成的另一种策略，并指出了抗病毒干预的潜在靶点。

章节片段

细胞培养

人类胚胎肾293T（HEK293T）细胞和Vero细胞来自美国典型培养收集中心（ATCC，美国）。IPEC-J2细胞最初来源于新生仔猪。所有细胞均在含有10%胎牛血清（FBS；Gibco，美国）、100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM；Solarbio，中国）中培养。所有细胞在含有5% CO?的湿润环境中于37°C下培养。细胞定期进行检测

PEDV 5′UTR在双基因报告系统中促进下游基因的翻译

为了研究PEDV 5′ UTR是否能够促进帽独立翻译，我们使用psiCHECK-2载体进行了双基因报告实验。将PEDV 5′ UTR插入上游的Renilla荧光素酶（RLUC）和下游的萤火虫荧光素酶（FLUC）基因之间，构建了p-PEDV载体。作为阳性对照，在相同位置插入了经过充分研究的脑心肌炎病毒（EMCV）内部核糖体进入位点（IRES）（p-EMCV）。

讨论

猪流行性腹泻病毒（PEDV）是一种重要的经济性猪肠道病原体，属于冠状病毒科（Coronaviridae）中的Alphacoronavirus属（Zhao等人，2024年）。病毒RNA的有效翻译对于实现有效感染和病毒传播至关重要。尽管冠状病毒基因组具有5′帽结构，并且通常被认为利用宿主的帽依赖性翻译机制，但越来越多的证据表明RNA病毒经常采用替代

CRediT作者贡献声明

Bingcong Xia： 软件、方法学、数据管理。Yize Yan： 软件、方法学、数据管理。Zheng Chen： 软件、方法学、数据管理。Jiafu Zhao： 软件、方法学、数据管理。Yingqian Han： 验证、形式分析、数据管理。Heshui Zhu： 验证、形式分析、数据管理。Chao Zhang： 写作——审稿与编辑、监督、项目管理、资金获取、形式分析、概念构思。Xiaotian Chang： 原始写作

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的财务利益或个人关系。

致谢

本工作得到了国家动物免疫学国际联合研究中心创新基金（2025IJRCNAI18）和河南省自然科学基金（252300420197）的支持。