《Signal Transduction and Targeted Therapy》：Therapeutic targeting of BCL-2 during CART cell production augments potency through non-apoptotic adaptive changes
编辑推荐：
【编辑推荐】为提升CAR-T细胞疗法的疗效，解决传统制备方法可能导致的细胞耗竭和持久性不足等问题，研究人员聚焦于BCL-2蛋白家族在细胞凋亡之外的功能，探究了在CAR-T细胞体外扩增阶段加入BCL-2抑制剂维奈托克(venetoclax)的作用。研究发现，维奈托克处理可对CAR-T细胞进行转录、代谢和功能重编程，使其获得更优的抗凋亡能力和效应功能，从而显著增强对B细胞淋巴瘤/白血病的杀伤效力。该研究揭示了一条通过靶向抗凋亡蛋白来增强过继性T细胞疗法的新途径，具有重要的临床转化前景。
免疫系统中的T细胞是抗击肿瘤的“精锐部队”，而CAR-T细胞疗法，即给患者的T细胞装上能识别肿瘤的“导航仪”（嵌合抗原受体，Chimeric Antigen Receptor, CAR），再将它们回输体内，已经成为对抗某些血液肿瘤的革命性武器。然而，这支“改造部队”在体内可能面临持久力不足、过早耗竭等问题，影响其长期疗效。与此同时，科学家们对另一类靶点——BCL-2蛋白家族的认知也在不断深化。这类蛋白不仅是调控细胞生死（凋亡）的关键“开关”，其非凋亡功能，如参与细胞代谢和信号传导，也逐渐成为研究热点。其中，特异性靶向BCL-2蛋白的药物维奈托克(venetoclax)已在多种血液肿瘤治疗中展现出显著疗效，但其对免疫细胞，特别是T细胞功能的影响尚不明确。一个引人深思的问题随之而来：能否利用维奈托克对T细胞的潜在调控作用，来“改造”和“升级”CAR-T细胞这支“特种部队”，让它们变得更强大、更持久？这正是刊登在《Signal Transduction and Targeted Therapy》上的这项研究试图回答的核心问题。
为了探索这一可能性，研究人员开展了一系列严谨的实验。他们利用了多种关键技术方法：首先，构建了靶向CD19的CAR-T细胞（包括小鼠和人源模型）作为研究系统。在细胞制备的体外扩增阶段，他们加入了不同剂量的维奈托克进行处理，并与常规（Vehicle）处理的CAR-T细胞进行对比。其次，研究运用了多种功能评估手段，包括体外细胞毒性（杀伤）实验、细胞因子分泌检测、细胞耗竭和记忆表型分析（流式细胞术），以及代谢功能测定（如Seahorse分析细胞耗氧率OCR和细胞外酸化率ECAR）。再者，为了深入解析机制，研究进行了转录组学分析，包括批量RNA测序(bulk RNAseq)和单细胞RNA测序(scRNAseq)，并结合基因集富集分析(GSEA)来探寻受影响的信号通路。此外，通过蛋白质印迹(Western blot)和磷酸化流式细胞术检测了关键信号通路（如STAT5, AKT）的激活状态。最后，研究在两种CD19阳性肿瘤（NALM6白血病和OCI-Ly8弥漫大B细胞淋巴瘤）的小鼠异种移植模型中，评估了经维奈托克处理的CAR-T细胞的体内疗效。值得一提的是，研究不仅使用了健康供者的T细胞，还纳入了来自经过化疗预处理的患者的T细胞样本，以检验该策略在更具临床相关性的场景下的效果。
研究结果内容丰富，揭示了维奈托克处理对CAR-T细胞的多方面增强作用：
1. Venetoclax directly enhances the effector function of murine CD19CART cells & BCL-2 blockade is compatible with human CART cell manufacturing
在鼠源和人源CAR-T细胞的制备过程中，加入维奈托克处理是可行的。虽然在高剂量下细胞数量有轻微下降趋势，但未达到统计学显著性，且不影响CAR的表达、CD4+/CD8+比例及初始产品的记忆表型构成。这为后续的功能研究奠定了基础。
2. Venetoclax-treated CART upregulates anti-apoptotic BCL-2 protein levels
与预期一致，维奈托克处理导致了CAR-T细胞中抗凋亡蛋白（BCL-2, BCL-XL, MCL-1）的表达普遍上调，表明细胞在应对BCL-2抑制时产生了适应性补偿。
3. Venetoclax enhances CART cytotoxicity in vitro
功能实验显示，经维奈托克处理的CAR-T细胞在体外对CD19+肿瘤细胞（如OCI-Ly8和NALM6）的杀伤能力显著增强，且这种增强是抗原特异性的。这种增强效应不依赖于CAR中共刺激域（4-1BB或CD28）的类型，也不受扩增所用细胞因子（IL-2或IL-7/IL-15）的影响。
4. Amplified T cell effector functions mediate venetoclax-treated CART enhanced cytotoxicity
机制探索发现，增强的细胞毒性伴随着效应功能的全面“升级”：肿瘤刺激后，维奈托克处理的CAR-T细胞能产生更多的颗粒酶B、穿孔素、TRAIL（肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体）以及效应细胞因子（IFN-γ, TNF-α, IL-2）。同时，这些细胞在面对肿瘤时表现出更强的抗凋亡能力（激活的Caspase-3减少），并且耗竭标志物（如PD-1, TIM3, LAG3, TIGIT）的表达水平显著降低，具有更强的连续杀伤肿瘤能力。
5. Venetoclax-enhanced antitumor activity of CART is BCL-2 dependent
为确认效应是否源于维奈托克对BCL-2的靶向作用，研究人员构建了过表达野生型或不同维奈托克耐药突变体（如G101V）BCL-2的CAR-T细胞。结果显示，维奈托克对CAR-T细胞功能的增强作用与其对BCL-2蛋白的结合能力正相关。在表达高度耐药突变体的CAR-T细胞中，维奈托克的处理效果被显著削弱，同时伴随的BCL-XL和MCL-1上调也减弱，耗竭表型也无法有效改善。这强有力地证明了观察到的效应是BCL-2依赖性的。
6. Venetoclax induces universal transcriptional changes in CART
转录组学分析（包括单细胞测序）揭示，维奈托克处理引起了CAR-T细胞广泛的基因表达重编程。这种重编程在CD4+和CD8+细胞中均存在，并富集于多条与T细胞激活、效应功能和代谢相关的信号通路。
7. The enhanced antitumor effect of venetoclax-treated CART is mediated in part by PI3K/AKT and JAK/STAT signaling
通路分析特别指出，IL-2/STAT5和PI3K/AKT/MTOR信号通路被显著激活。实验证实，维奈托克处理的CAR-T细胞中磷酸化的STAT5(p-STAT5)和AKT(p-AKT)水平升高。使用STAT5或AKT的抑制剂进行处理，可以逆转维奈托克带来的杀伤力增强，表明这两条通路是介导其效应的重要机制。
8. Venetoclax promotes CART metabolic fitness
代谢分析显示，维奈托克处理的CAR-T细胞具有更高的氧化磷酸化(OXPHOS)水平、基础呼吸、最大呼吸能力和备用呼吸容量，同时保持了强大的糖酵解储备。转录数据也支持其对脂肪酸代谢和OXPHOS相关基因的上调，以及对糖酵解相关基因的下调。这种代谢特征与更具记忆表型、更持久的T细胞状态相符。STAT5信号通路被证明是介导这些代谢变化的主要因素。
9. Venetoclax-treated CART prepared from healthy donors has increased therapeutic activity against leukemia and lymphoma in vivo
体内实验证实，无论是在播散性白血病还是实体淋巴瘤小鼠模型中，经维奈托克处理的健康供者来源的CAR-T细胞，均能更有效地控制肿瘤生长，并显著延长荷瘤小鼠的生存期。
10. Venetoclax amplifies the therapeutic potency of CART prepared from patient-derived T cells
最关键的是，这一策略在临床样本中同样有效。研究使用了经过多线化疗的患者的T细胞制备CAR-T。尽管这些起始T细胞普遍表现出更少的初始表型、更高的耗竭标志物表达以及抗凋亡蛋白水平的异质性，但经维奈托克处理后制备的CAR-T细胞，其体外和体内的抗肿瘤效能依然得到显著增强。这表明，维奈托克的重编程能力能够克服患者T细胞起始状态不佳的劣势，具有广阔的临床应用前景。
在结论与讨论部分，本研究系统性地阐明，在CAR-T细胞体外扩增阶段使用维奈托克靶向BCL-2，能够诱导CAR-T细胞发生广泛的适应性重编程。这种重编程超越了单纯的抗凋亡保护，更涉及对JAK/STAT5和PI3K/AKT关键信号通路的激活、向更优记忆/效应表型的倾斜，以及代谢向氧化磷酸化依赖型的转变。最终，这些变化共同塑造了具有更强杀伤力、更低耗竭倾向和更长持久力的“超级”CAR-T细胞。
这项研究的重要意义在于：首先，它突破了将BH3模拟物（如维奈托克）仅视为促凋亡抗癌药物的传统视角，首次揭示了其在CAR-T细胞制备中作为免疫调节剂的潜力，为“老药新用”开辟了新思路。其次，研究从分子、细胞到动物模型多个层面，详细阐明了BCL-2抑制如何通过非凋亡途径重塑T细胞功能，加深了对BCL-2蛋白家族在免疫调节中复杂作用的理解。最后，也是最具有转化价值的一点是，该策略能够有效提升即便是来自经治患者的、功能状态不佳的T细胞所制备的CAR-T产品的疗效。这为解决当前CAR-T疗法中因患者T细胞质量差而导致的疗效不佳或复发难题，提供了一个简单、可操作且极具潜力的解决方案。研究支持进一步探索将维奈托克及其他BH3模拟物作为免疫调节剂，用于优化各类过继性T细胞疗法。
