利用多源卫星观测数据诊断2025年Talidas冰川的冰损失过程 作者：Imran Khan、Jeremy M. Johnston 和 Jennifer M. Jacobs

《Remote Sensing》：Diagnosing the Controls of the 2025 Talidas GLOF Using Multi-Source Satellite Observations Imran Khan, Jeremy M. Johnston and Jennifer M. Jacobs

　　**摘要**
种子老化是一个关键的生物过程，它会导致种子活力的逐渐丧失，从而限制了种质资源的保存和农业生产力的提高。为了阐明这一过程在草类物种中的分子机制，我们进行了转录组分析，以表征青海-西藏高原上主要牧草物种——塞伯利亚羊茅（Elymus sibiricus）种子老化过程中的调控网络。种子经历了人工加速老化处理（45°C，80%相对湿度，1-6天），随后进行了生理评估和RNA测序。随着老化过程的进行，种子活力和发芽率显著下降，并伴随着广泛的转录重编程。综合分析表明，丙酮酸代谢、MAPK信号传导和过氧化物酶体功能是与种子活力丧失相关的关键过程。WGCNA分析进一步揭示，编码热休克蛋白和谷胱甘肽代谢相关酶的基因在同一模块中共定位，这暗示它们可能在种子老化过程中发挥协同作用，保持种子的生命力。此外，WRKY24、ARF9和ARF19被鉴定为候选的枢纽转录因子。WRKY24可能通过调节抗氧化防御相关基因（如TRX1和NRPC1）来促进老化；而ARF9和ARF19则可能通过其下游目标基因（包括FQR1、PER2、MAO1B和MT2B）来调控活性氧（ROS）的平衡。这些发现支持了一个假设性的调控模型，即WRKY和ARF转录因子协调氧化还原平衡和激素信号传导，从而调控塞伯利亚羊茅种子的寿命。本研究为理解多年生草类的种子老化提供了系统层面的框架，并确定了潜在的遗传靶点，以改善种子的储存能力，对种质资源保护和高山草地可持续性具有重要意义。

**1. 引言**
塞伯利亚羊茅（Elymus sibiricus）是一种多年生、自花授粉的同源四倍体草本植物，属于禾本科（Poaceae）和羊茅属（Elymus）。因此，对其的研究为更广泛的羊茅属提供了宝贵的见解。青海-西藏高原拥有丰富的塞伯利亚羊茅野生资源，这些资源对草地恢复、畜牧业生产以及相关作物（包括普通小麦）的遗传改良具有重大价值。全球范围内已经收集了大量的羊茅属种质资源，强调了研究遗传多样性和保护的重要性，以便有效利用和保全生物多样性。塞伯利亚羊茅产生颖果类型的种子，胚和胚乳被持久的 lemma 和 palea 包裹。成熟时，种子表现出非深度的生理休眠状态，可以通过干燥后熟处理、冷层积或GA3处理有效打破休眠。在野外条件下，由于土壤湿度和温度的变化，种子发芽和幼苗出土通常较慢且不均匀。在实验室条件下（25/15°C的交替温度下），花后60天收集的种子发芽率仅为约11%。然而，经过一年自然储存后，发芽率可超过95%，但随着储存时间的延长逐渐下降。这些形态和生理特征为研究种子老化和活力动态提供了有用的框架。

种子老化是储存过程中不可避免的现象，会导致发芽率降低和种子活力逐渐丧失，从而影响农业稳定性和生态系统可持续性。这一过程受到环境和遗传因素的共同影响，不同种质资源在种子活力特性上表现出显著差异，包括对老化的耐受性、发芽能力和休眠水平，这些主要由内在的遗传调控机制控制。然而，自然条件下的种子老化过程缓慢且受环境变化影响，限制了对其机制的深入研究。国际种子检测协会（ISTA）已经标准化了加速老化测试（AAT）和控制劣化测试（CDT）等加速老化方法，这些方法提供了可控且高效的替代系统，能够重现自然老化的主要特征。因此，AAT被广泛应用于模式植物和作物物种的研究，包括拟南芥（Arabidopsis thaliana）、水稻（Oryza sativa）和燕麦（Avena sativa），有助于解析种子劣化的生理和遗传机制。

种子老化过程会触发一系列有害的生理和分子变化，包括DNA损伤、质膜完整性丧失、细胞器紊乱、有毒代谢物积累、激素信号传导失调以及抗氧化防御系统的受损。近年来，越来越多的证据证实了多种调控因子（包括转录因子和酶）在种子老化中的关键作用。与氧化还原平衡、激素信号传导和能量代谢相关的基因被证明是这一调控网络的关键组成部分。例如，超氧化物歧化酶（CuSOD）、抗坏血酸过氧化物酶（APX）、脱氢抗坏血酸还原酶（DHAR）、谷胱甘肽还原酶（GR）、硫氧还蛋白（TRX）和过氧化还原蛋白1A（PER1A）等抗氧化基因，以及bZIP23、wall-associated kinase（WAK16）、small auxin-up RNA基因（SAUR33）、脂氧合酶（LOX1）和呼吸爆发氧化酶同源物（RBOHs）等应激响应基因。除了氧化还原调节外，激素信号传导在控制种子老化和寿命方面也起着不可或缺的作用。植物激素如生长素、赤霉素和脱落酸（ABA）已被确认为种子寿命的关键调节因子。其中，ABA通过脱落酸不敏感3（ABI3）和脱落酸不敏感5（ABI5）的作用介导种子寿命的获得和维持。生长素和ABA信号通路之间的相互作用也影响种子寿命；例如，TIR1/ABF–ARF信号通路的激活可以促进ABI3的表达，进而影响种子老化的调控。此外，激素信号传导还可以通过调控ROS平衡间接影响种子寿命。在水稻中，OsSAUR33在老化种子中的表达明显高于未老化种子，在自然储存和人工老化条件下，OsSAUR33的破坏显著降低了种子活力。尽管取得了这些进展，但对于塞伯利亚羊茅属种子寿命的分子调控机制仍知之甚少。鉴于塞伯利亚羊茅及其相关物种在生态和农业上的重要性，进一步探索其种子老化过程中的转录响应具有重要意义。通过表征与寿命相关基因的表达动态及其在氧化还原、激素和代谢途径中的相互作用，将有助于深入了解该属种子的活力维持机制。

在本研究中，我们使用了高产种子的塞伯利亚羊茅品种‘Maiwa’，该品种在青海-西藏高原上广泛用于草地恢复和人工牧场建设。近期发布的塞伯利亚羊茅高质量参考基因组为多组学研究的准确性和深度提供了重要资源。本研究旨在通过整合转录组分析和发芽表型来描绘与种子老化相关的基因表达谱，以识别种子老化的关键调控基因，并推进对多年生草类种子活力的机制理解。

**2. 结果**
**2.1 人工老化对种子发芽的影响**
在老化处理前，对照种子（A0）表现出较高的活力，发芽率为94%，根系出土率为96%。随着老化时间的延长，这两个参数都呈近似线性下降（图1）。经过1天老化（A1）后，发芽率和根系出土率分别下降到63%和69%；2天（A2）后分别降至40%和49%；4天（A4）后降至10%和35%；6天（A6）后，未观察到正常幼苗（0%），仅有5%的种子出现根系出土（图1E）。图1显示了在45°C和80%相对湿度下，经历不同老化处理（0天（A）、1天（B）、2天（C）、4天（D）和6天（E）后的塞伯利亚羊茅种子发芽表型。发芽性能的下降伴随着与活力相关的多个指标的显著减少，包括茎长、根长、发芽指数和活力指数（图2）。老化还延缓了发芽动力学，平均发芽时间从5.32天（A0）增加到10.33天（A6）（图2G）。这些结果共同证实，人工老化严重损害了塞伯利亚羊茅的种子活力和发芽效率。大多数未发芽的老化种子在吸水过程中变软，而仍然坚硬的种子对破除休眠的处理没有反应，表明老化并未诱导二次休眠。

**2.2 老化过程中转录组景观的动态变化**
转录组分析揭示了人工老化过程中的广泛转录重编程。所有15个样本的主成分分析（PCA）显示生物重复样本明显聚集，并且不同老化阶段之间逐渐分离（图S1）。差异表达基因（DEGs）的数量在老化第4天达到峰值，之后在第6天下降，这可能反映了大量非存活细胞的存在。与A0相比，A1、A2、A4和A6中分别鉴定出806、2108、5512和3976个DEGs。在所有比较中，下调基因占主导地位，其中A4与A0相比最多（4972个），而上调基因在A4（540个）和A6（542个）达到峰值（图3A）。图3显示了老化对种子基因表达谱的影响。
**2.3 DEGs的代谢途径和调控网络分析**
KEGG通路分析显示，DEGs的通路富集模式与整体变化趋势一致，在A4阶段达到最高。最显著富集的通路主要包括碳代谢、氨基酸代谢、脂质代谢、能量代谢、信号转导和环境适应。例如，在老化第4天和第6天，参与能量代谢、脂质代谢、运输和分解代谢、信号转导以及环境适应的DEGs数量分别为117个、55个、92个、48个、41个和57个、35个，表明种子劣化过程中伴随着广泛的代谢重组（图4）。这些发现表明，种子老化与多个代谢和信号通路的协调重编程有关，可能反映了种子劣化过程中生理稳态和应激抗性的逐渐丧失。

**3. 结论**
综上所述，本研究利用高产种塞伯利亚羊茅‘Maiwa’，该品种在青海-西藏高原上广泛用于草地恢复和人工牧场建设。近期发布的塞伯利亚羊茅高质量参考基因组为多组学研究提供了重要资源，提高了研究的准确性和深度。本研究旨在通过整合转录组分析和发芽表型来描绘与种子老化相关的基因表达谱，以识别种子老化的关键调控基因，并推进对多年生草类种子活力的机制理解。在西伯利亚油菜（E. sibiricus）种子老化过程中，常见和特定差异表达基因（DEGs）的转录因子分析。(A) 在所有老化阶段都共同差异表达的七个转录因子。(B) ARF19及其预测目标基因的调控网络。(C) A6组中鉴定出的1136个特定DEGs的KEGG富集分析。(D) WRKY24及其预测目标基因的调控网络。在TF-目标网络（B,D）中，线条颜色表示基序出现概率（红色：较高；深绿色：较低）。较粗的线条表示预测的结合可能性更强。所有相互作用都是预测的，尚未经过实验验证。对于A6组特有的1136个DEGs，富集分析显示“RNA聚合酶”、“脂肪酸降解”、“甘油磷脂代谢”、“过氧化物酶体”和“丙酮酸代谢”等途径有显著过表达。从这些基因构建的独立网络确定WRKY24为一个潜在的中心调控因子，预测其靶向29个基因，特别是TRX1、ABCB26和NRPC1，这些基因分别在抗氧化防御、主动运输和甲基化调控中起作用（图6A,B）。

2.4. 加权基因共表达网络分析（WGCNA）
WGCNA将所有表达基因分为15个不同的模块（图7A）。其中， turquoise和blue模块包含的基因数量最多（图7B）。模块-性状相关性分析显示有七个模块与种子活力相关指标显著相关。图7. 西伯利亚油菜种子老化相关基因的WGCNA。(A) 基于拓扑重叠差异的基因树。(B) 每个共表达模块中的基因数量。(C) 发芽相关性状与模块之间的相关性（* p < 0.05；** p < 0.01；*** p < 0.001）。(D) 不同老化阶段代表性模块的表达动态。turquoise、blue和green模块随老化逐渐下调，与发芽率（GP）、根系伸出率（EP）、根长（RL）、苗长（SDL）、发芽指数（GI）和活力指数（VI）呈强正相关，但与平均发芽时间（MGT）呈负相关（图7C）。turquoise和blue模块的功能富集显示与碳和脂质代谢、RNA剪接、蛋白质加工、氨基酸生物合成、丙酮酸代谢、MAPK信号传导和辅因子合成等关键途径有强关联（图8A）。基于这些关联，我们推测这些途径的集体下调可能导致代谢失衡和种子活力丧失。相反，brown模块显示了相反的趋势——其表达随老化增强，并与活力相关性状呈负相关，但与MGT呈正相关（图7C）。该模块主要由参与核糖体功能和核酸修复的基因富集，提示可能存在应激反应机制（图8B）。图8. 关键共表达模块的功能富集和调控网络分析。(A–C) turquoise（A）、brown（B）和cyan（C）模块的KEGG途径富集。(D,E) 显示cyan模块中参与GSH代谢（D）和热休克蛋白（E）的基因表达谱的热图。(F) cyan模块的调控网络。在网络可视化中，粉色箭头代表转录因子，圆圈表示基因，线条表示基因或蛋白质之间的预测相互作用。节点大小反映连通性（较大的节点表示更高的连通性），而边缘的粗细和颜色代表相互作用强度（较粗和较红的边缘表示更强的关联）。所有相互作用都是预测的，尚未经过实验验证。我们还关注了一些在老化过程中先短暂上调后下调的基因模块，如粉色、cyan和绿黄色模块（图7D）。KEGG富集分析显示这些模块中的基因主要参与内质网中的蛋白质加工，表明它们可能在响应老化引起的应激时早期激活蛋白质质量控制机制。其中，cyan模块显示出更明显的上升-下降模式。该模块在谷胱甘肽代谢途径中显著富集，而这一途径在种子老化过程中对维持氧化还原平衡至关重要。该途径中的关键抗氧化酶基因包括APX3、GSTF1、GSTU6和GSTU1（图8D）。此外，cyan模块包含多个HSP家族成员，特别是HSP16.6、HSP17.9、HSP21、HSP21.9和HSP70。其中，HSP17.9、HSP21和HSP70被预测受转录因子HSFB2B调控，并与参与蛋白质折叠和应激反应的基因共表达并可能存在功能性相互作用（图8E,F）。通过将WGCNA模块与DEGs整合，我们鉴定出384个与种子活力密切相关的高置信度候选基因。这些基因的转录网络分析显示ARF9是一个潜在的中心调控因子，预测其靶向30个下游基因，包括光系统I亚基H（PSAH）、黄素类似醌还原酶1（FQR1）、β-淀粉酶3（BAM3）、几丁质酶8（CHT8）、UDP-葡萄糖：糖蛋白葡萄糖基转移酶（UGGT）、叶绿体alterados 1（CLA1）、单胺氧化酶B（MAO1B）和PER2（图9A,B）。这些目标基因参与ROS代谢、光合作用电子转移和细胞蛋白质质量控制，表明ARF9可能协调多个对种子存活至关重要的生理过程。图9. 与种子活力显著相关的DEGs的转录调控网络分析。(A) ARF9与与种子活力显著相关的差异表达基因的相互作用网络。连接线的颜色表示基序出现概率，红色表示概率较高，深绿色表示概率较低。线条的粗细反映了转录因子与目标基因序列之间的结合可能性（较粗的线条表示结合潜力更强）。所有相互作用都是预测的，尚未经过实验验证。(B) 种子老化过程中ARF9的表达趋势。

2.5. 通过RT-qPCR验证RNA-seq数据
为了验证RNA-seq数据的可靠性，我们在用于RNA-seq的相同老化时间点对七个候选基因（ARF9、ARF19、GSTF1、HSP70、APX3、HSFA2D和WRKY24）进行了RT-qPCR。如图S2A–G所示，这七个基因的表达模式与RNA-seq数据一致。这些结果支持了我们基于RNA-seq的发现的稳健性。

3. 讨论
3.1. 种子活力下降的关键代谢途径
种子老化是一个多因素过程，其特征是累积的生理退化和全局转录重编程。种子活力的丧失与碳代谢、氨基酸代谢和脂质代谢等关键生化过程中的广泛代谢改变密切相关[9,17]。在西伯利亚油菜中，转录组分析显示与这些基本代谢途径相关的基因以及参与能量生产和氧化应激反应的基因普遍下调。线粒体作为植物细胞的主要能量工厂，在决定种子是否能够成功发芽中起着关键作用。老化通常会导致线粒体结构异常、生物合成受损或呼吸效率降低，这可能导致能量供应不足和发芽失败[12,18]。此外，线粒体是种子中ROS生成的主要场所。老化过程中ROS的过度积累可能会进一步破坏线粒体功能，形成恶性循环，加速细胞损伤和活力丧失[18]。在老化后期，丙酮酸代谢、MAPK信号传导和过氧化物酶体功能等途径受到特别影响。这表明这些过程的破坏可能导致种子活力的最终下降。丙酮酸代谢作为连接糖酵解和三羧酸（TCA）循环的中心代谢枢纽。这一途径的破坏可能会减少ATP的合成并导致有毒中间产物（如乙醛）的积累。晚期老化过程中的线粒体功能障碍可能会进一步阻碍丙酮酸进入TCA循环，从而加剧能量短缺并可能加速活力丧失[19]。在燕麦和小麦（Triticum aestivum）等密切相关的物种中，丙酮酸代谢已被确认为影响种子老化的一个关键途径[20,21]。所涉及的关键酶中，乙酰-CoA合酶（ACS）催化丙酮酸转化为乙酰-CoA，后者是进入TCA循环的必要“代谢转换”。因此，ACS被认为是调节种子老化的一个关键基因[21]。此外，丙酮酸激酶（PK）催化糖酵解的最终步骤，是该途径中的另一个关键酶。PK的功能障碍会阻断糖酵解流，导致葡萄糖积累和细胞能量水平下降。这种代谢失衡可能会进一步扰乱GA/ABA平衡，最终影响种子活力[22]。MAPK信号传导级联作为环境和激素信号的关键转换器，介导细胞对应激的反应[23]。在种子老化过程中，MAPK信号传导的失调可能会损害ROS的解毒和DNA或蛋白质修复过程，从而加速活力下降[24]。在不利环境条件或氧化应激下，MAPK级联通常会被激活，导致下游转录因子和酶的磷酸化，触发抗氧化基因的表达并调节细胞周期进展和程序性细胞死亡。这种信号通路对老化过程特别敏感。在燕麦和番茄（Solanum lycopersicum）等物种中，MAPK相关基因在种子老化过程中的表达发生了明显变化[10,24]。例如，在浸泡24小时的燕麦胚中，与未老化对照组相比，老化的种子中WNK8和MAPK2的转录水平显著降低[10]，而在番茄逐渐老化过程中观察到MPK3和MPK6活性的上调[24]。此外，MAPK级联可以与激素信号通路相互作用以调节种子活力。例如，OsMKKK62–OsMKK3–OsMPK7/14模块被报道可以调节ABA敏感性，从而控制种子休眠和发芽动态[25]。同样，过氧化物酶体功能障碍可能会在种子老化期间加剧ROS的积累。过氧化物酶体含有CAT，这是一种分解H2O2的关键抗氧化酶，是抵御氧化应激的主要酶防御机制。在几种植物物种的种子老化过程中记录到CAT活性降低，这通常与ROS水平升高和活力丧失相关[10,24]。过量的过氧化氢在正常条件下作为一种信号分子发挥作用。然而，当其过度积累时，它可以作为一种有害物质，标志着种子活力的关键生化标志[26,27]。

3.2. 与种子活力相关的基因共表达模块
基于转录组的模块分析为解析种子老化背后的复杂分子事件提供了一种有效方法。在本研究中，几个基因模块与发芽率、幼苗生长、活力指数和发芽指数呈强正相关，并且随着老化逐渐下调。它们主要富集在与碳代谢、脂质代谢、RNA剪接、蛋白质加工、氨基酸生物合成、丙酮酸代谢、MAPK信号传导和辅因子生物合成相关的途径中。这些富集共同表明，在种子老化过程中代谢能力和信号传导效率逐渐下降。相反，有一部分途径在老化过程中上调，尤其是在种子仍保留部分发芽能力的早期阶段。这些途径包括与核糖体功能、蛋白质加工、核酸修复和谷胱甘肽代谢相关的基因。与核糖体活性、蛋白质折叠和DNA修复相关的基因上调并不一定意味着这些过程的真正增强。相反，它可能反映了细胞对广泛大分子损伤的应急反应。这种激活可能是种子试图抵消或延缓退化的尝试，尽管这些修复机制可能不足以抵消累积的损伤。例如，在老化诱导的压力下，细胞通常会提高HSP70和sHSP等分子伴侣的表达水平，这些蛋白通过热休克因子激活，已知可以稳定错误折叠的蛋白质并保持种子活力[28,29,31]。尽管一些热休克蛋白在种子老化过程中被证明具有保护作用，但严重的氧化应激最终可能会超出它们的修复能力。此外，参与谷胱甘肽代谢的基因显著富集，突显了其在维持氧化还原平衡和解毒中的关键作用[10,32]。参与AsA–GSH循环的酶，包括DHAR、GR和APX，已被广泛报道为种子长寿的关键调节因子[8,11,12]。值得注意的是，本研究中观察到的上调APX基因编码了一种关键的过氧化氢清除机制。已经证明APX和CuSOD的共表达可以显著增强种子的耐老化性[11]。GSH依赖性和非依赖性的解毒途径都有助于维持种子活力[10,33]。在水稻中，与这些途径相关的大多数基因在耐老化基因型中显著上调，与敏感基因型相比，glyoxalase I（GLYI3）和Aldo-ketoreductase 1（AKR1）等基因已被实验验证可以缓解种子退化[34,35]。此外，在西伯利亚油菜的老化过程中，phi和tau亚家族的谷胱甘肽S转移酶（GST）成员也上调。在甜玉米中也观察到了类似的趋势，研究发现ROS（活性氧）的产生和清除效率的差异是由GST（谷胱甘肽S-transferase）基因介导的，这些差异被认为是种子耐老化性的主要决定因素[36]。尽管phi类和tau类GST在非生物胁迫响应中的作用已经被广泛认可，但它们在种子老化过程中的具体功能仍不清楚，需要进一步研究。综合来看，上述的热休克蛋白（HSPs）和与谷胱甘肽代谢相关的酶在同一模块中被共定位。基于这些共表达模式，我们假设这两种蛋白都具有维持种子活力的潜力，并可能协同参与种子老化过程中的活力维持机制。

3.3 调节E. sibiricus种子老化的转录因子
种子活力是一个由多个基因控制、由多种转录因子调节的复杂的数量性状，这些转录因子包括bZIP [9]、bHLH [37]、MYB [38]、NAC [39]和WRKY [40]家族的成员。这些因子整合了内源激素、氧化还原平衡和环境胁迫的信号，以协调种子活力的维持。结合先前的研究，我们的共表达分析确定了几个可能是E. sibiricus种子老化调节因子的转录因子。其中，WRKY24、ARF9和ARF19被确定为与种子活力下降高度相关的候选调节因子。在老化种子中，WRKY24的表达下调，以及它与参与氧化应激缓解（TRX1）、蛋白质合成（NRPC1）和运输（ABCB）的基因之间的强关联表明，WRKY24可能参与这些过程的协调。然而，WRKY24是否直接调节这些靶标还有待确定。比较分析显示，不同物种中WRKY介导的调节机制可能存在差异。例如，水稻[9]和紫花苜蓿[40]中的不同WRKY成员在老化过程中的表达模式各不相同，这突显了WRKY调节网络的复杂性，并暗示WRKY24在E. sibiricus中的功能可能是物种或条件特异性的。同样，生长素信号通路在我们的研究中也成为一个重要的调节枢纽。ARF9和ARF19的鉴定与生长素在多个物种（如水稻[41]、拟南芥[42]和玉米[43]）中延长种子寿命的作用一致。值得注意的是，这些ARF在网络中的预测靶标——包括ARF19的ANN5和MT2B，以及ARF9的FQR1、PER2和MAO1B——与氧化还原平衡有关。鉴于过氧化物酶（PER）家族的成员已知会影响种子的储存能力，我们的发现提示ARF9和ARF19可能通过调节参与氧化还原平衡的基因来部分贡献于种子的活力。

根据以上观察，我们提出了一个未来的研究工作假设：转录因子WRKY24、ARF9和ARF19可能是调节E. sibiricus种子寿命的关键节点。具体来说，WRKY24可能会影响氧化应激响应，而ARFs可能通过各自的靶基因介导氧化还原平衡。这些途径是独立发挥作用还是存在相互作用（例如通过共享的靶基因或调节反馈）仍然是一个未解决的问题。通过遗传操作（如敲除或过表达）和分子检测（如ChIP-qPCR、EMSA）进行功能验证对于阐明这些转录因子调节种子老化的确切机制至关重要。

在当前研究中，转录组分析结合WGCNA（全局基因共表达网络分析）提供了关于E. sibiricus种子老化调控网络的宝贵见解。这项工作是对一种多年生高山草类种子老化的全面的转录组特征描述，也是少数关注多年生牧草的研究之一。与之前针对水稻、燕麦、小麦和玉米等一年生作物（这些作物通常研究的是生命周期较短的物种）的研究不同，我们在E. sibiricus中发现了一些候选调节因子（如WRKY24、ARF9、ARF19）和共表达模块（如将热休克蛋白与谷胱甘肽代谢联系起来），这些在适应高海拔环境的多年生草类中尚未被报道。这些发现超越了一年生作物模型，强调了可能存在于生态和农业上重要的多年生物种中的种子长寿潜在机制。然而，也应承认几个限制。首先，尽管加速老化（45°C，80%相对湿度）是一个广泛接受且实用的实验系统来研究种子老化，但它仍然是对长期储存期间自然老化过程的人为替代。在这些条件下观察到的转录组反应可能无法完全捕捉到常规储存条件下发生的所有生理和分子事件。其次，本研究主要关注转录水平的变化，而种子老化还受到转录后调控、蛋白质周转、酶活性、代谢物积累和膜损伤的强烈影响。因此，我们的结论主要是相关性的，并用于生成假设。除了缺乏功能验证（如基因过表达或沉默）之外，这些限制要求对提出的调控框架进行谨慎解读。未来的研究需要结合转录组学与蛋白质组学、代谢组学、ROS测量和抗氧化酶检测，以构建更完整的E. sibiricus种子老化机制模型。此外，还需要通过病毒诱导基因沉默（VIGS）或异源表达来对关键枢纽基因（如WRKY24、ARF9、ARF19）进行功能表征，以验证提出的调控框架。

4. 材料与方法
4.1 植物材料及人工老化处理
2023年8月，从位于中国四川省洪原县的四川省草原科学院实验站收集了E. sibiricus L. ‘Maiwa’品种的种子。收获后，仔细清洗种子以去除空壳或皱缩的籽粒。根据国际种子测试协会（ISTA）的协议，在老化处理前将种子水分含量调整至10%[10]。该种子批次的初始标准发芽率为94%。水分含量为10%的种子在20°C下平衡3天后开始老化处理。平衡后，将种子均匀分布在没有重叠的情况下放置于无菌塑料培养皿（13.5 cm × 13.5 cm）中，每皿200粒种子。然后将培养皿放入恒温恒湿种子老化室（HWS-160，宁波江南仪器厂，中国宁波）中，设置温度为45°C和相对湿度为80%进行人工加速老化[9]。根据初步的发芽测试（图S3），在加速老化1天、2天、4天和6天后收集种子。每个时间点准备三个独立的生物学重复实验，每个重复包含200粒种子。老化后，所有样本在室温下平衡24小时，分别标记为A1、A2、A4和A6。未经处理的对照组种子（A0）在相同条件下保持不动，用于后续分析。

4.2 发芽测定和活力评估
种子发芽率根据ISTA（2019）指南中正常幼苗的数量进行评估。每个处理包括三个生物学重复实验，每个重复包含50粒种子。种子放置在无菌塑料培养皿（12 cm × 12 cm）中，并在恒定25°C的温度下，在8小时光照/16小时黑暗的光周期和1200勒克斯的光照强度下进行培养。每天记录具有2毫米以上根长的种子数量。根据这些数据计算平均发芽时间（MGT），并绘制发芽动力学曲线。在发芽测定的第12天进行最终评估，包括发芽率（GP，正常幼苗的百分比）和出苗率（EP，出苗种子的百分比），以及芽长（SL）、根长（RL）、幼苗长（SDL）、发芽指数（GI）和活力指数（VI）的测量。
MGT的计算公式如下：
GI的计算公式如下：
VI的计算公式如下：
其中“T”是从根长超过2毫米开始计数的天数，“N”是第T天出苗的种子数量，“Gt”是在时间“t”天出苗的种子数量，“Dt”表示相应的出苗天数。

4.3 转录组测序与分析
4.3.1 RNA提取、cDNA文库构建和测序
从每个老化处理的样本中迅速彻底地用液氮研磨种子。对于每个老化时间点（A0、A1、A2、A4、A6），准备三个独立的生物学重复实验。从每个重复实验得到的0.1克粉末中提取总RNA。为了确保高质量的测序数据，严格评估了RNA的完整性、纯度和浓度。使用商业试剂盒去除核糖体RNA以富集信使RNA（mRNA）。然后使用mRNA Capture Beads富集纯化的mRNA，通过高温处理使其片段化，再用逆转录主混合物合成第一条链cDNA。随后进行第二条链cDNA的合成，接着进行末端修复和腺苷酸化。得到的cDNA片段通过Hieff NGS? DNA Selection Beads进行纯化和大小选择，通过PCR扩增以构建最终的测序文库，并进行质量控制。使用Illumina NovaSeq X plus（Illumina, Inc., San Diego, CA, USA）进行双端（PE150）测序，每个样本的平均原始数据量约为6.7 Gb。使用fastp [44]处理原始测序读数以获得高质量的清洁读数，清洁读数的平均Q30分数>93%。然后使用HISAT2软件（v2.1.0）[45]将这些清洁读数与E. sibiricus参考基因组对齐。所有样本的平均映射率约为81%（详见表S1中的每个样本的质量指标）。根据HISAT2的对齐结果，使用StringTie [46]组装每个样本的转录组，并使用RSEM [47]估计基因表达水平。

4.3.2 差异基因表达和功能富集分析
使用R中的DESeq2软件包（http://www.bioconductor.org/packages/release/bioc/html/DESeq2.html，访问日期2025年6月20日）进行差异基因表达分析，该软件利用了从表达水平量化生成的原始读数数据。分析包括数据标准化、基于负二项分布模型的统计假设检验以及多重检验校正以生成假发现率（FDR）值。使用FDR调整后的p值< 0.05和|log2(Fold Change)| > 2来识别显著的DEGs（差异表达基因）。使用GO（基因本体论，https://geneontology.org/，访问日期2025年6月25日）术语富集分析对鉴定出的DEGs进行基因本体分类。计算与每个GO术语相关的DEGs数量，以生成富集的功能类别列表。此外，还使用了京都基因与基因组百科全书（KEGG，https://www.genome.jp/kegg/，访问日期2025年6月25日）通路富集分析，以识别与DEGs显著相关的生化代谢和信号转导通路。

4.3.3 加权基因共表达网络分析（WGCNA）和转录因子靶标预测分析
使用R中的WGCNA包v 1.73（https://cran.r-project.org/web/packages/WGCNA/index.html，访问日期2025年7月20日）构建了一个加权基因共表达网络。在分析之前，过滤掉了表达水平低的基因（样本间计数< 5）。然后使用以下参数构建共表达模块：软阈值功率为8，无符号拓扑重叠矩阵类型，合并切割高度为0.25，最小模块大小为50。这个过程将基因聚类为15个不同的共表达模块。为了进行转录因子靶标的机器预测，从JASPAR数据库（https://jaspar.elixir.no/，访问日期2025年7月5日）检索代表TFs（转录因子）DNA结合基序的位置权重矩阵。这些基序随后用于使用MEME包中的FIMO软件套件（https://web.mit.edu/meme/current/share/doc/fimo.html，访问日期2025年7月5日）扫描基因的启动子序列，识别统计上显著的潜在结合位点。选定的TF-靶基因对可以通过一个交互式在线工具可视化表示，该工具生成一个调控网络图，说明转录因子与其潜在靶基因之间的潜在关联。

4.3.4 实时荧光定量PCR（RT-qPCR）分析
按照制造商的说明，使用Quick RNA Isolation Kit（Huayueyang Biotech Co., Ltd., Beijing, China）从种子样本中提取总RNA。使用EasyScript? All-in-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR Kit（TransGen Biotech Co., Ltd., Beijing, China）从1 μg总RNA合成第一条链cDNA。然后在Archimed R4 qPCR系统上进行RT-qPCR，使用One Step SYBR PrimeScript RT-PCR Kit II（TaKaRa, Dalian, China）。扩增条件如下：首先在95°C下变性3分钟，然后进行40个循环，每个循环包括95°C 10秒和60°C 30秒。EIF4A基因被用作内部参考基因，以标准化基因表达水平。相对转录本丰度通过2-ΔΔCt方法计算。使用Primer Premier 5.0软件（Premier Biosoft International，美国加州帕洛阿尔托）设计了特异性引物，并列在表S2中。所有反应都进行了三次独立的生物学重复实验。

4.3.5 统计分析
所有统计分析均使用SPSS Statistics版本22.0（SPSS Inc.，美国伊利诺伊州芝加哥）中的一元方差分析（one-way ANOVA）和Duncan多重范围检验（p < 0.05）进行。播种子发芽参数、基因表达和相关性分析的图表是用GraphPad Prism版本9（GraphPad Software Inc.，美国加州圣地亚哥）制作的。所有可视化结果（如热图和网络图）均来自一个在线网站（https://www.omicsmart.com/，访问日期为2025年8月8日）。

5. 结论
本研究提供了对E. sibiricus种子衰老的全面转录组分析，揭示了与种子活力下降相关的动态转录重编程和关键调控途径。人工老化导致发芽能力逐渐丧失，并伴随着参与代谢、应激信号传导和氧化还原稳态调节的基因的整体下调。综合分析表明，丙酮酸代谢、MAPK信号通路和过氧化物酶体功能与种子衰老后期的活力下降密切相关。此外，共表达网络分析显示，编码热休克蛋白和谷胱甘肽代谢相关酶的基因位于同一模块中，这表明它们可能在种子衰老过程中具有协同作用，有助于保持种子活力。另外，WRKY24、ARF9和ARF19被鉴定为潜在的核心转录调控因子。其中，WRKY24可能通过调节抗氧化防御相关基因（如TRX1）参与衰老过程，而ARF9和ARF19可能通过其预测的下游靶基因（包括FQR1、PER2、MAO1B、ANN5和MT2B）影响ROS代谢。总之，本研究有助于理解多年生草本植物种子活力衰退的分子机制，并为提高Elymus及其相关物种种子的储存性能和支持种质资源保存提供了潜在的候选基因资源。

补充材料
以下支持信息可下载自https://www.mdpi.com/article/10.3390/plants15091328/s1：
- 表S1：RNA-seq数据质量和映射统计摘要
- 表S2：用于qRT-PCR验证的7个选定基因的引物序列
- 图S1：不同老化时间点转录组样本的主成分分析（PCA）
- 图S2：E. sibiricus种子衰老过程中7个选定基因表达模式的RT-qPCR验证
- 图S3：E. sibiricus种子在初步老化测试中的发芽情况