SARS-CoV-2 N蛋白劫持m6A读取蛋白YTHDF2以抑制抗病毒基因的表达 吴佩涵、 王帅、 李旭

《Viruses》：SARS-CoV-2 N Protein Hijacks the m6A Reader YTHDF2 to Suppress Antiviral Gene Expression Peihan Wu, Shuai Wang and Xu Li

　　摘要：病毒内部核糖体进入位点（IRESs）是一种特殊的RNA结构，它们通过促进无帽依赖性翻译来劫持宿主的翻译机制。6型IRESs是目前已知最精简的机制，因为它们采用三假结RNA结构直接招募核糖体并驱动翻译，无需任何翻译因子。Halastavi árva病毒（HalV）的IRES代表了迄今为止发现的最简化的亚类，其IRES缺乏与40S亚基结合的特定假结结构，而是通过一种尚未完全理解的机制招募预先组装好的80S核糖体。在本研究中，我们探讨了支持HalV IRES翻译的细胞条件。我们证明HalV IRES在昆虫Sf21裂解液和果蝇S2细胞中具有翻译活性，但在哺乳动物RRL和小麦胚芽提取物中则没有活性。热休克或血清饥饿处理会抑制HalV IRES的活性，而病毒感染则显著增强了HalV IRES介导的翻译。最后，HalV IRES可以利用异源病毒复制子支持病毒的翻译和复制。这些发现突显了允许无因子IRES进行核糖体组装和翻译的特定细胞环境。

1. 引言
RNA病毒进化出了多种机制来劫持宿主的翻译机制，以驱动病毒蛋白质合成，从而实现有效感染[1]。其中一种机制是内部核糖体进入位点（IRES）机制，一些正链RNA病毒（包括Picornaviridae、Calciviridae和Dicistroviridae家族）就利用了这一机制[2]。与大多数真核mRNA所依赖的帽依赖性翻译不同，IRESs采用RNA结构来指导5′端无帽依赖性的翻译起始[3,4]。IRESs的功能是通过标准的双顺反子RNA或环状RNA报告基因来定义和识别的，这些报告基因能够支持核糖体进入和翻译。IRESs通常使用一组特定的翻译起始因子，并可能利用称为IRES转录因子（ITAFs）的宿主因子来促进翻译[5,6]。据认为，病毒IRESs在感染期间可以优先进行翻译，尤其是在帽依赖性翻译受到抑制时[7,8]。根据因子需求和保守的RNA结构及域，病毒IRESs被分为不同的类型，目前共有6种类型；然而，随着更多病毒组的发现，可能会发现更多类别[9,10,11]。1型和2型IRES分别以脊髓灰质炎病毒和脑心肌炎病毒（EMCV）为代表，它们需要大部分翻译起始因子，并且其活性受到宿主IRES转录因子（如多聚嘧啶结合蛋白PTB1）的增强[12,13,14,15]。1型IRESs涉及40S核糖体对AUG起始密码子的扫描，而2型IRESs则直接在AUG起始密码子附近招募40S核糖体。3型IRESs（如甲型肝炎病毒（HAV）的IRES）需要帽结合蛋白eIF4E和eIF4G[16,17]。4型IRESs（以丙型肝炎病毒（HCV）和经典猪瘟病毒（CSFV）的IRES为代表）可以直接招募40S核糖体亚基，并仅使用eIF3和eIF2进行翻译起始[18,19,20]。5型IRESs存在于Aichiviruses的基因组中，其因子需求与1型和2型IRESs相似，需要宿主蛋白DHX29来启动翻译[21,22]。6型IRESs位于Dicistroviridae基因组的基因间区域（IGR），因其RNA结构的自主性和能够直接与核糖体结合而独特，可以在无因子和无需起始tRNA的情况下从非AUG密码子启动翻译[23,24,25,26,27,28]。Cricket paralysis病毒（CrPV）、感染蜜蜂的Israeli acute paralysis病毒（IAPV）和Taura syndrome病毒（TSV）的基因间区域IRES就是这类IRES的例子。6型IRES的长度约为160–180个核苷酸，通常包含四个茎环结构，其中三个假结相互重叠[25,29,30,31]。生化和冷冻电镜结构揭示了这些IRES如何利用两个独立结构域来招募核糖体并驱动翻译：PKII和PKIII结合到40S和60S亚基上，而PKI模拟tRNA的反密码子-密码子相互作用[32,33]。IGR IRES跨越所有三个tRNA结合位点，最初与核糖体的亚基间空间结合，其中PKI的tRNA反密码子模拟结构域占据核糖体的A位点，随后被eEF2转移到P位点[28,31]。IGR IRES介导的翻译在通常抑制帽依赖性翻译的细胞应激条件下仍然持续[34,35]。IGR IRESs的效率和功能相关性已在病毒环境中得到验证，突变研究表明核糖体结合和病毒复制需要特定的结构元素[34,36,37,38,39]。根据其特定的RNA结构和作用机制，6型IRESs进一步分为不同的亚型[40]。6a型和6b型IRES分别以CrPV和IAPV的IRES为代表，主要区别在于IAPV IRES在PKI结构域内包含一个额外的茎环（SLIII），此外还保留了特定的L1.1序列[41]。尽管存在这些差异，6a型和6b型IRES都使用类似的核糖体相互作用和翻译起始机制。这些IGR IRES的PKI结构域可以互换而不影响翻译活性[42,43]。6c-6f型IRES的不同之处在于它们能够招募预先形成的80S核糖体，尽管每种亚型具有不同的结构——每种亚型都有不同的PKII和PKIII结构域，但都包含PKI的密码子-反密码子模拟结构域[44,45,46]。例如，6d-6f型IRES包含典型的PKII碱基对，但SLV结构域比6a型和6b型短，且PKIII碱基对位于SLV的顶端茎部。6c型IRES在Halastavi árva病毒（HalV）的基因组中被发现[47]，是迄今为止报道的最简化的IGR IRES[46]。与6a型和6b型IRES不同，HalV IGR IRES缺乏SLV、SLIV和PKIII结构域，但可以通过其PKI结构域与80S核糖体结合。因此，这种IRES不需要eEF2介导的PKI从A位点到P位点的转移[46]。值得注意的是，SERBP1/eEF2复合物在兔网织红细胞裂解液中抑制了HalV IGR IRES介导的核糖体结合和翻译，该复合物与非程序化的80S核糖体结合[46]。这些观察结果表明存在不同的核糖体组装途径，并提出了关于HalV IGR IRES如何招募核糖体以指导病毒蛋白质合成的基本问题，以及在其他细胞环境中是否也存在类似的组装途径。最近的研究揭示了多种病毒RNA的翻译策略，表明无因子翻译起始机制比之前认为的更为普遍，并可能在感染期间由特定的宿主细胞环境选择性激活[10,40,48]。在本研究中，我们定义了HalV IGR IRES能够有效利用宿主翻译机制的细胞条件。通过双顺反子报告基因实验，我们发现HalV IGR IRES介导的翻译在CrPV感染期间得到选择性增强，并且部分抵抗内质网应激引起的翻译抑制，但在热休克或血清饥饿条件下受到强烈抑制。此外，我们还证明了HalV IGR IRES在dicistrovirus复制子背景下支持翻译，提供了IRES驱动的蛋白质合成与病毒RNA复制的功能性证据。这些结果共同定义了允许80S核糖体在HalV IGR IRES上组装的细胞条件，为这种高度精简、无因子的翻译模式提供了见解。

2. 材料与方法
2.1. 细胞培养
果蝇Schneider 2细胞系（S2细胞）（Gibco，加利福尼亚州卡尔斯巴德；目录编号51-4003）在Shields和Sang M3昆虫培养基（Sigma-Aldrich，密苏里州圣路易斯）中培养，添加10%胎牛血清（FBS），温度为25°C，除非另有说明。
2.2. 质粒
HaIV IGR IRES片段（从核苷酸6277到核苷酸6408，登录号MN231041）由Twist Biosciences（加利福尼亚州旧金山）合成，并使用Gibson组装技术克隆到双顺反子和荧光素酶报告基因质粒中。通过定点突变生成缺失突变和特定核苷酸突变，并进行序列验证（Genewiz，华盛顿州西雅图；Plasmidsaurus，华盛顿州西雅图）。
CrPV和HaIV IGR-IRES-Nanoluc复制子是通过修改先前发表的CrPV感染克隆CrPV-3[34]生成的。简要来说，将编码CrPV IGR-Nanoluciferase或HalV IGR-Nanoluciferase的片段插入CrPV-3感染克隆中，其中ORF2被CrPV IGR-IRES-Nanoluciferase或HalV IGR-IRES-Nanoluciferase替换。在这两种情况下，Nanoluciferase ORF的AUG起始密码子都被删除。通过定点突变生成CrPV和HalV复制子的RdRp催化失活突变版本（DD1620-1至NN），并进行序列验证（Plasmidsaurus）。
2.3. 体外转录
双顺反子和复制子质粒分别用BamHI和Eco53KI（NEB，马萨诸塞州伊普斯威奇）限制性内切酶线性化。RNA使用T7 RNA聚合酶转录，然后用Monarch RNA提取试剂盒（NEB）纯化。转录后进行5′端加帽和多聚腺苷酸化（CellScript，威斯康星州麦迪逊）。通过变性琼脂糖凝胶分析确认RNA的完整性和纯度，并用分光光度计（Nanodrop，Thermo Fisher Scientific，特拉华州威尔明顿）测量浓度。
2.4. 转染
将果蝇Schneider S2细胞（2.5 × 10^6个细胞）用Lipofectamine 2000试剂（Thermo Fisher Scientific，马萨诸塞州沃尔瑟姆）转染双顺反子或复制子RNA（2 μg）。S2细胞转染双顺反子RNA 1小时后，再用CrPV感染（MOI = 10）4.5小时以监测报告基因RNA的翻译。对于复制子转染实验，S2细胞在指定时间转染后收获，并用1×被动裂解缓冲液（Promega，威斯康星州麦迪逊）裂解。裂解液澄清后，用Bradford试剂（Bio-Rad，加利福尼亚州赫拉克勒斯）测量蛋白质浓度。
2.5. 体外翻译反应
体外转录的双顺反子报告基因RNA（1 μg）在Sf-21细胞提取物（Promega）、小麦胚芽提取物（WGE）或兔网织红细胞裂解液（RRL）（Promega）中孵育1.5小时（WGE）或1小时（RRL）。使用Tecan Spark-10M多功能板读数器测量荧光素酶活性。
2.6. 40S和60S亚基的纯化
使用HeLa细胞沉淀物（Cell Culture Company，明尼苏达州肖尔维尤）按照先前描述的方法纯化核糖体[49]。简要来说，细胞在温和的裂解缓冲液中裂解，该缓冲液包含15 mM Tris-HCL（pH 7.5）、300 mM NaCl、2 mM Mg(OAc)2、1 mM DTT、0.5% (v/v) NP-40和0.1 U/μL RNA酶抑制剂。通过12,000× g离心去除碎片，然后将上清液与30% (w/w)蔗糖的150 mM KCl缓冲液分层，再以115,800× g离心以沉淀粗核糖体。沉淀的核糖体在4°C下轻轻重悬于缓冲液B（20 mM Tris-HCL（pH 7.5）、6 mM醋酸镁、150 mM KCl、6.8% (w/v)蔗糖）中。接下来，用嘌呤霉素（最终浓度2.3 mM）处理核糖体以释放mRNA，并加入KCl（最终浓度500 mM）以分离80S和60S亚基。然后在BioComp Gradient Station（Biocomp Instruments Ltd，加拿大塔塔马古奇）制备的20–40% (w/w)线性蔗糖梯度上分离核糖体。通过测量260 nm处的吸光度来检测40S和60S亚基，并使用Amicon Ultra spin浓缩器（Millipore Sigma，马萨诸塞州伯灵顿）在缓冲液C（20 mM Tris-HCl（pH 7.5）、0.2 mM EDTA、10 mM KCl、6.8%蔗糖）中浓缩相应的组分。根据1 A260 nm = 50 nM（40S亚基）和1 A260 nm = 25 nM（60S亚基）的转换系数，通过分光光度法测定40S和60S亚基的浓度。
2.7. 核糖体过滤结合试验
使用过滤结合试验分析核糖体:IRES复合物，方法如[42]所述。简要来说，体外转录的RNA先用Antarctic磷酸酶（NEB）去磷酸化，然后用T4多核苷酸激酶（NEB）和[γ32P]-ATP标记。[γ32P]-RNA（最终浓度：0.5 nM）在65°C加热3分钟，然后加入1×缓冲液E（最终浓度：20 mM Tris pH 7.5、100 mM KCl、2.5 mM MgOAc、0.25 mM Spermidine和2 mM DTT），并在室温下缓慢冷却20分钟以适当折叠。然后将RNA与0.1 nM至100 nM的40S核糖体亚基孵育15分钟。对于80S组装/结合，加入0.15 nM至150 nM的40S和60S核糖体亚基，以及50 ng/mL的体外转录的非竞争性RNA（用EcoRV线性化）。Bio-Dot装置（Bio-Rad，Hercules，CA，美国）被用来通过真空过滤含有硝化纤维素（上层）和尼龙（下层）膜的反应物。膜用1X缓冲液E清洗三次后干燥，并通过磷光成像仪（ImageQuant? 800，Amersham Typhoon，Marlborough，MA，美国）进行分析。结合的分数和解离常数（KD）按照之前的描述[50]进行计算。2.8. 代谢放射性标记：用模拟病毒或CrPV（MOI 10）感染S2细胞6小时后，与50 μCi的Easy-Tag Express [35S]蛋白标记混合物（Perkin-Elmer，Waltham，MA，美国）/mL一起孵育30分钟。细胞用冷的1× PBS清洗并在裂解缓冲液中裂解（20 mM HEPES，150 mM NaCl，1% Triton X-100，10%甘油，1 mM EDTA，10 mM四磷酸盐，100 mM NaF，17.5 mM β-甘油磷酸盐，以及一种蛋白酶抑制剂混合物（Roche，South San Francisco，CA，美国））。蛋白质浓度通过Bradford测定法（Bio-Rad）确定，然后将等量的裂解物（20 μg）通过12% SDS-PAGE分离。凝胶干燥后使用Typhoon成像仪（ImageQuant? 800）进行分析。2.9. Replicon RNA的RT-qPCR：使用Trizol（Thermo Fisher Scientific）从转染后的Drosophila S2细胞中提取总RNA，在转染后3小时和18小时进行提取。提取的RNA在37°C下用DNase处理30分钟。按照制造商的协议使用Lunascript RT Supermix Kit（NEB）进行第一链cDNA合成。随后使用Luna Universal qPCR Master Mix（NEB）在QuantStudio实时PCR系统（Applied Biosystems，South San Francisco，CA，美国）上进行定量实时PCR（qPCR）。使用引物：正向，5′-GGCTACAACCTGGACCAAGT-3′和反向，5′-ACGGGATGATGACATGGATG-3′，扩增replicons内的NLuc报告基因序列。作为内部对照，使用引物：正向，5′-CGATATCCTCGGTGACGAGT-3′和反向，5′-CCCTTCTTCAAGACGACCAG-3′扩增house-keeping基因eS6。使用无RT和无模板对照来确认没有非特异性扩增。相对RNA水平使用2?ΔΔCt方法计算，其中目标Ct值首先归一化到eS6参考基因的Ct值（ΔCt）。然后将这些值归一化到每种情况下的野生型RNA水平，定义为1.0。2.10. 统计分析：我们使用GraphPad PRISM版本10软件分析数据。所有数据均以至少三个独立生物实验的平均值±标准差（s.d.）表示。对于比较IRES变体的荧光素酶报告基因测定，数据通过单因素方差分析（ANOVA）后进行Tukey的多重比较测试。对于应激实验和CrPV感染研究，使用配对的双尾Student’s t检验比较每个IRES变体的模拟条件和处理条件。对于RT-qPCR分析，使用ΔΔCt方法计算的倍数变化值在每个时间点使用配对的双尾Student’s t检验比较野生型（WT）和复制酶缺陷型（mRdRP）replicons。差异在p < 0.05时被认为是统计学上显著的。3. 结果 3.1. HaIV IGR IRES在昆虫裂解液和Drosophila S2细胞中具有翻译活性：Hellen及其同事之前的研究表明，HalV IGR IRES在兔网织红细胞裂解液（RRLs）中无法支持翻译，这一效应归因于SERBP1/eEF2复合物与80S核糖体的结合，阻止了IRES的招募[46]。我们研究了HalV IGR IRES（以下简称HalV IGR IRES或HalV IRES）是否可以在其他体外小麦胚芽和昆虫Sf-21翻译提取物中驱动翻译。我们使用了双链报告RNA，这些RNA可以监测扫描依赖的Renilla荧光素酶（RLuc）翻译和IRES介导的萤火虫荧光素酶（Fluc）翻译，然后从相对的FLuc:RLuc比率计算IRES活性（图1C，补充数据S1）。如之前所报道的[51]，野生型CrPV IGR IRES在所有三种提取物中都驱动了强烈的翻译，而含有破坏所有三个PKs突变的突变体则消除了翻译（图1C）。在RRL中孵育含有HalV IRES的双链RNA不支持IRES翻译，这与之前的观察结果相似[46]。此外，HalV IRES在小麦胚芽提取物中也不活跃。相比之下，HalV IRES在Sf21提取物中的Fluc翻译活性约为野生型CrPV IRES的27%（图1C）。同时破坏HalV PKI结构域内的茎部和假结的碱基配对（2mPKI）略微降低了IRES活性，尽管在统计上不显著，而恢复PKI碱基配对的补偿突变（cPKI）部分恢复了IRES翻译（图1C）。这些结果表明HalV IGR IRES可以在体外昆虫裂解液中发挥作用。图1. HalV IGR IRES的体外翻译活性。(A) HalV基因组的示意图。(B) HalV IRES的二级结构。上游ORF1的终止密码子用粗体表示，下游ORF2的起始密码子用粗体和下划线表示。显示了破坏PKI结构域内茎部和假结碱基配对的突变以及恢复碱基配对的补偿突变（cPKI）。(C) 含有野生型或突变型PKI（mPKI，cPKI）CrPV或HalV IGR IRES的双链报告RNA在兔网织红细胞裂解液（RRLs）（1小时，37°C）、小麦胚芽提取物（WGE）（1小时，30°C）和Sf21昆虫裂解液（1.5小时，30°C）中孵育。FLuc/RLuc荧光素酶活性比率归一化为含有野生型CrPV IGR IRES的双链RNA的比率。(D) 在Drosophila S2细胞中 capped双链报告RNA的翻译活性。下面显示了体外 capped和polyadenylated RNA的完整性。S2细胞被转染了含有指定野生型和突变型IGR IRES的5′capped报告RNA（顶部示意图），并在转染后6小时测量荧光素酶活性。使用单因素ANOVA和Tukey的多重比较测试来确定p值（* p < 0.05，** p < 0.01，*** p < 0.001；ns，不显著）。显示的是至少三个独立实验的平均值±标准差。尽管HaIV IGR IRES在体外支持翻译，但其是否依赖于PKI的完整性尚不清楚（图1C）。接下来我们检查了HalV IGR IRES是否在S2细胞中发挥作用。我们将体外转录的5′m7G-capped双链RNA（补充图S1A）转染到S2细胞中，并在转染后6小时测量RLuc和FLuc活性。正如预期的那样，野生型但不是突变型mPKI CrPV IGR IRES在S2细胞中支持FLuc翻译（图1D）。野生型HalV IRES引导的FLuc活性约为CrPV IGR IRES的20%，而同时破坏PKI茎部和假结碱基配对的突变体则消除了HalV IRES的FLuc翻译（图1D）。相比之下，恢复PKI碱基配对的补偿突变恢复了HalV IRES的翻译。因此，与体外Sf21提取物中的观察结果相反，HaIV IGR IRES可以在S2细胞中以依赖于PKI的方式支持翻译。3.2. HaIV IGR IRES结合到纯化的人类核糖体：HalV IRES缺乏其他双链病毒IGR IRES中通常存在的关键茎环SLIV和SLV，这些茎环对于40S核糖体的招募是必需的[46]。因此，HalV IGR IRES不能招募兔40S亚基，但可能招募预先组装的兔80S核糖体[46]。为了更详细地研究这一点，我们使用已建立的过滤结合测定法和纯化的盐洗人类核糖体[40]来监测40S或80S的结合/组装。将逐渐增加浓度的纯化40S和60S亚基与[32P]-末端标记的野生型CrPV IRES一起孵育，得到了CrPV IRES:核糖体复合物，其表观KD为1.3 nM（图2，圆圈），与之前的报告一致[40]。相比之下，所有三个假结的碱基配对都受到破坏的突变型CrPV IRES（ΔPKI/II/III）减少了核糖体结合（图2，方块）。同样，HalV IRES结合到核糖体的表观KD为2.3 nM（图2，三角形）。接下来我们检查了HalV IRES是否结合到40S亚基。野生型CrPV IGR IRES结合到40S亚基的表观KD为2.3 nM；然而，三重假结突变型CrPV IGR IRES和HalV IGR IRES的40S结合显著减少或受限（图2）。这些发现支持了之前的研究，即HalV IRES不能结合到人类40S亚基，但可能招募预先形成的80S核糖体[46]。然而，这些实验条件并不排除40S首先结合到HalV IRES然后60S加入的可能性。图2. HalV IRES:80S复合物。[32P]-HalV IGR IRES，[32P]-(CrPV) IGR IRES或突变型（ΔPKI/II/III）CrPV IGR IRES与逐渐增加量的纯化盐洗40S/60S或单独的40S一起孵育，然后将反应加载到硝化纤维素/尼龙过滤结合测定上。通过磷光成像仪分析滤膜以量化结合的分数。显示的是至少三个独立实验的平均值±标准差。3.3. HalV IGR IRES在细胞应激条件下的翻译：HalV IGR IRES可以在体外组装预先形成的80S核糖体[46]；然而，尚不清楚这是否可以在体内以及在可能积累空预组装80S核糖体的特定细胞条件下发生。我们系统地研究了HalV IGR IRES是否能在特定细胞应激条件下支持S2细胞中的翻译，特别是在热休克（图3A）、血清饥饿（图3B）和内质网应激（图3C）期间。我们选择这些细胞应激条件是因为CrPV IGR IRES和其他双链病毒IGR IRES在这些条件下已被证明是被刺激的[35,52]。此外，有先例表明，在营养缺乏期间——特别是在酵母中的葡萄糖饥饿和哺乳动物细胞中的氨基酸或血清饥饿期间——可能会积累空80S核糖体[53,54]。我们在有和没有细胞应激的情况下将含有IGR的5′m7G-capped polyadenylated双链RNA转染到S2细胞中，并在转染后6小时测量RLuc和FLuc活性。正如预期的那样，在所有细胞应激条件下，依赖帽的RLuc翻译被显著抑制（超过90%），表明蛋白质合成全面停止。相比之下，野生型CrPV IGR IRES在热休克和内质网应激（DTT）条件下支持FLuc翻译（图3A,C），与之前的观察结果一致[52,55]。有趣的是，CrPV IGR IRES在血清饥饿条件下翻译减少。在所有细胞条件下，仅破坏PKI碱基配对的突变型PKI CrPV IGR IRES不支持IRES翻译。HalV IRES的FLuc翻译在热休克和血清饥饿条件下被抑制或不受支持，这与依赖帽的RLuc翻译的减少相呼应（图3A,B）。然而，在内质网应激下经过DTT处理的细胞中，HalV IGR IRES的FLuc翻译部分得到支持（约25%，与基础条件相比），这与依赖帽的翻译显著减少（DTT处理细胞相比减少了超过90%）形成对比。总之，这些结果表明HalV IGR IRES可以在Drosophila和人类细胞的内质网应激条件下支持翻译。图3. HalV IGR IRES在细胞应激条件下的翻译。S2细胞被转染了含有指定野生型或突变型IGR的5′m7G capped和polyadenylated双链报告RNA，在未经处理的S2细胞中或在（A）热休克（32°C，3小时后再恢复2小时），（B）血清饥饿（转染前24小时添加FBS）或（C）内质网应激（4 mM，4小时）条件下。收集细胞并测量荧光素酶活性。通过配对的双尾Student’s t检验评估每种构建物在应激和未应激条件下的绝对荧光素酶单位之间的统计差异。只有统计学上显著的差异用星号表示（* p < 0.05，** p < 0.01，*** p < 0.001）；所有其他比较均不显著。所有数据都是至少三个独立实验的平均值±标准差。3.4. 在CrPV感染的S2细胞中，HalV IGR IRES的活性增强：在双链病毒感染期间，结构蛋白的表达量超过非结构蛋白，表明IGR IRES的翻译在感染期间被刺激[55,56,57]。由于尚未建立HalV病毒感染的细胞模型，我们接下来测试了HalV IGR IRES是否在CrPV感染中发生翻译。我们首先监测了用体外转录的含有IGR的 capped双链RNA转染的模拟和CrPV感染细胞中的整体蛋白质合成。通过[35S]-甲硫氨酸脉冲标记监测了30分钟的整体蛋白质合成。在所有情况下，CrPV感染（感染后6小时）导致翻译全面停止，同时CrPV的结构和非结构蛋白质合成也停止（图4A）[55,56]。同时，我们监测了荧光素酶活性。在模拟和CrPV感染的S2细胞中，依赖帽的Renilla翻译增加了约10倍（图4B,C），这与之前的观察结果一致[56]。尽管通过35S-甲硫氨酸脉冲标记和多聚核糖体分析测量到CrPV感染细胞中的全球翻译关闭[55]，但在CrPV感染的S2细胞中仍可重复观察到转染的报告基因RNA的翻译，这归因于新生mRNA在这些细胞条件下具有优先权并能够稳定翻译[56,58]。同样，在CrPV感染下，CrPV和HalV IGR IRES萤火虫荧光素酶的翻译都得到了刺激（图4B,C）。假结碱基配对的破坏消除了CrPV和HalV IRES的翻译，而恢复PK碱基配对的补偿突变则挽救了HalV IRES的翻译（图4C），表明RNA结构的完整性对CrPV感染细胞中的IRES翻译至关重要。图4. CrPV感染增强了S2细胞中HalV IGR IRES介导的翻译。(A) 在SDS-12% PAGE凝胶上加载的蛋白质裂解物的磷光成像分析。S2细胞分别被模拟感染或CrPV感染（MOI 10）1小时后，转染了指定的体外转录的5′ capped双链RNA。转染后6小时（h.p.t.），细胞用[35S] Met/Cys进行脉冲标记。同时，测量了含有野生型（WT）或突变型（B）CrPV IRES或（C）HalV IRES的双链报告基因RNA的细胞的荧光素酶活性。mPKI—单个PKI碱基对破坏；2mPKI—双个PKI碱基对破坏突变；cPKI—恢复PKI碱基配对的补偿突变。显示了绝对的Renilla荧光素酶（帽依赖性翻译，左）和萤火虫荧光素酶（IRES介导的翻译，右）。通过配对双尾Student’s t检验评估了模拟感染和感染条件下每种构建体之间荧光素酶单位的统计差异。只有统计学上显著的差异用星号表示（** p < 0.01, *** p < 0.001）。所有数据均为至少三次独立实验的平均值±标准差。

3.5. HalV IGR IRES在异源病毒复制子中支持翻译
鉴于HalV IGR IRES可以在CrPV感染的细胞中支持翻译（图4C），我们接下来研究了HalV IRES是否可以在病毒复制子中支持翻译。目前还没有HalV感染性克隆，因此我们探讨了HalV IRES是否可以支持异源病毒复制子。我们通过用Nanoluciferase（NLuc）报告基因ORF替换了先前建立的CrPV感染性克隆和复制子中的CrPV ORF2来改造它，该Nanoluciferase ORF可以由CrPV或HalV IGR IRES驱动[36]。我们删除了NLuc的AUG起始密码子，以确保NLuc的翻译依赖于IGR IRES。最后，我们通过将RNA依赖性RNA复制酶（RdRP）的催化位点DD1621-2突变为NN来生成一个复制酶缺陷型复制子。我们在体外转录了野生型和RdRP突变型复制子（图5B，补充图S1B），并将复制子RNA转染到S2细胞中，并在转染后3、9、18和24小时监测NLuc的活性。转染CrPV IGR IRES复制子RNA后，在转染后9和18小时观察到强烈的NLuc活性（图5C）。相比之下，RdRP失活的CrPV复制子显示的NLuc活性显著较低，表明野生型复制子观察到的强烈NLuc活性代表了有效的病毒复制（图5C）。同样，将HalV IGR IRES复制子RNA转染到S2细胞后，在转染后9、18和24小时（h.p.t.）观察到的NLuc活性高于转染RdRP突变体版本的细胞（图5D）。值得注意的是，含有CrPV IGR IRES的复制子的NLuc活性比含有HalV IGR IRES的复制子高约10倍，这可能反映了IGR IRES翻译效率的差异（图1D和图4）。为了验证NLuc报告基因表达是否真实反映了病毒RNA复制，我们使用RT-qPCR定量了复制子RNA的水平。在转染后18小时（h.p.t.），WT CrPV和HalV RNA的水平分别比3小时基线增加了约9.5倍和8.2倍。相比之下，RdRP突变体在转染后18小时的RNA积累增加可以忽略不计，这证实了观察到的RNA积累依赖于活跃的病毒复制。这些结果表明HalV IGR IRES可以支持双链病毒复制子的复制。图5. 使用病毒复制子系统评估HalV IGR IRES活性。(A) 基于CrPV的复制子系统的示意图。CrPV感染性克隆的结构开放阅读框（ORF2）被Nanoluciferase（NLuc）ORF替换，该ORF由指定的IGR IRES（CrPV或HalV）驱动。删除了NLuc基因的AUG起始密码子，以确保翻译严格依赖于IGR IRES。(B) 体外转录的野生型（WT）和RdRp突变体（mRdRp；DD1621-2NN）RNA的变性琼脂糖凝胶。(C,E) 随时间变化的S2细胞中转染指定复制子的相对NLuc活性。(D,F) 使用eS6作为参考，通过RT-qPCR分析测量的S2细胞中野生型（WT）和RdRP突变型CrPV及HalV复制子的相对病毒RNA水平。RT-qPCR倍数变化（E,F）通过配对双尾Student’s t检验在每个时间点比较WT和mRdRp RNA水平（*** p < 0.001）。数据代表至少三次独立实验的平均值±标准差。

4. 讨论
HalV IGR IRES（Type 6c）是迄今为止最精简的真核生物翻译机制，缺乏典型Type 6a和6b IGR IRES中的主要核糖体结合RNA结构域（SLIV/SLIV）[46]。在这项研究中，我们展示了HalV IGR IRES可以在昆虫Sf21裂解液和果蝇S2细胞中驱动翻译。我们还证明了HalV IGR IRES可以在内质网应激细胞中部分支持翻译，并且在CrPV感染中完全指导翻译，但在热休克和血清饥饿细胞中则不能。最后，我们展示了HalV IGR IRES可以在异源病毒复制子中支持病毒复制。这些发现突出了能够支持HalV IGR IRES翻译的特定细胞环境。
关于HalV IGR IRES的一个主要谜团是其在RRLs中的不活性，这之前被归因于SERBP1/eEF2复合体阻塞了核糖体亚基间的空间[46]。先前的冷冻电镜结构显示，像SERBP1（哺乳动物）和Stm1（酵母）这样的因子占据了mRNA通道和亚基间空间以防止降解[53,54,59,60]。我们观察到HalV IGR IRES在Sf21昆虫裂解液和果蝇S2细胞中是活跃的，但在RRL或小麦胚芽提取物中不活跃（图1），这可能表明不同系统之间的核糖体组成存在差异。昆虫中的同源休眠因子如Lso2[60]、SERBP1和IFRD2[54,59]可能对80S核糖体的亲和力较低，或者以不会阻碍HalV IRES上核糖体组装的构象结合。或者，昆虫细胞中空闲的80S核糖体池可能比RRL中更多。尽管预形成的80S如何结合到HalV IRES的机制细节仍不清楚，但这种现象并不限于这种IRES；CrPV IGR IRES不仅可以通过首先结合40S然后结合60S来组装80S:IRES复合体，还可以在较低程度上结合预形成的80S[61]。因此，这种核糖体组装途径可能比最初认为的更为普遍。已知细胞应激如氨基酸饥饿、渗透压应激或葡萄糖饥饿会导致非翻译/休眠的80S核糖体积累[54,62,63]。这种增加的空闲核糖体池可能被HalV IGR IRES利用来启动翻译。在这项研究中，我们展示了HalV IGR IRES在特定细胞条件下（包括CrPV感染和部分在内质网应激细胞中）支持翻译（图3）。在这些细胞条件下，当帽依赖性翻译被关闭时，增加的空闲核糖体池可以被HalV和CrPV IGR IRES利用来驱动翻译。然而，可能存在额外的核糖体相关因子（如SERBP1和IFRD2）的损失或不活性，这进一步允许HalV IGR IRES在特定细胞条件下（如CrPV感染和内质网应激期间）发挥作用，但在热休克或血清饥饿细胞中则不行。研究允许HalV IGR IRES翻译的细胞条件下的核糖体相关因子和核糖体状态将非常重要，这可能会提供关于这种病毒翻译策略的见解。
HalV IGR IRES代表了一种进化上的权衡：通过放弃招募40S亚基所需的域，它获得了更高的效率，但可能变得严格依赖于预形成的空闲80S核糖体的可用性。这指出了核糖体状态作为特定IRES翻译调节的焦点，这可能为病毒对特定宿主或感染阶段的限制提供见解。未来工作将识别在特定物种和细胞条件下结合到空闲80S核糖体上的具体因子，有助于理解这种最小病毒RNA元件的限制性质。

补充材料
以下支持信息可以在以下链接下载：https://www.mdpi.com/article/10.3390/v18050492/s1。补充图S1A，图1D中使用的体外转录的带帽双链RNA；补充图S1B，图5中使用的体外转录的复制子RNA；补充数据S1。