尼古丁代谢与慢性阻塞性肺疾病：孟德尔随机化研究及表型特征分析

《International Journal of Chronic Obstructive Pulmonary Disease》：Nicotine Metabolism and Chronic Obstructive Pulmonary Disease: Mendelian Randomization and Phenotypic Characterization Analysis

　　摘要
背景：具有相似吸烟暴露量的吸烟者患慢性阻塞性肺疾病（COPD）的风险存在显著差异，目前尚不清楚通过尼古丁代谢物比率（NMR）测量的基因决定的尼古丁代谢是否独立于吸烟暴露量与COPD相关。

方法：本研究整合了遗传证据和基于人群的表型分析。首先，使用全基因组关联研究（GWAS）的汇总统计数据进行了双样本孟德尔随机化（MR）分析，以评估NMR对COPD的因果效应，并通过共定位分析来评估共享的因果遗传变异。其次，在中国国家戒烟队列研究中进行了横断面表型分析，比较了在相似吸烟暴露量下不同代谢表型的COPD患病率，并通过中介分析评估了吸烟行为的贡献。

结果：MR分析显示，较高的NMR与COPD风险增加有关（OR = 1.06，95% CI：1.05–1.08）。共定位分析确定了共享的因果变异。基于人群的表型分析表明，无论吸烟暴露层如何，正常代谢者（NMR ≥ 0.31）的COPD患病率始终高于慢代谢者（NMR < 0.31），更重要的是，在相似的累积吸烟量下也是如此。中介分析显示，吸烟行为部分介导了这种关联（间接效应β = 0.0049，P < 0.001），占总效应的14.5%。

结论：通过NMR反映的尼古丁代谢与COPD易感性存在因果关联。这些发现表明，在吸烟暴露评估中纳入尼古丁代谢可能有助于改善COPD的风险分层。

关键词：COPD；尼古丁代谢；吸烟行为

引言：
慢性阻塞性肺疾病（COPD）在中国非常普遍，根据中国肺健康研究的估计，超过8.6%的成年人受到影响。吸烟是COPD最重要的可改变的环境因素，占疾病负担的70%以上。在发展为COPD的吸烟者中，研究显示吸烟暴露量与疾病风险存在剂量-反应关系。然而，传统的自我报告吸烟指标（如每天吸烟支数、吸烟持续时间和包年数）容易受到社会期望、访谈环境和健康意识变化的影响，可能导致回忆偏差。为了克服这些限制，研究人员越来越多地关注来自尼古丁代谢物的生理暴露指标，如可替宁（COT）及其进一步代谢物3’-羟基可替宁（3-HC）。特别是尼古丁代谢物比率（NMR），定义为3-HC/COT比率，受遗传因素强烈影响，其60%–80%的变异可归因于遗传因素，因此具有较高的时间稳定性。尼古丁代谢较快的吸烟者通常需要吸入更多尼古丁以维持相似的稳态浓度，这可能导致更高的吸烟强度和更大的毒素暴露。此外，负责尼古丁代谢的主要酶也参与香烟烟雾中多种其他有毒成分的生物转化。因此，个体间的代谢率差异可能影响吸烟行为和有毒物质的代谢，最终导致系统暴露水平的差异。动物研究表明，小鼠CYP2A6的同源物Cyp2a5上调，并伴随可替宁诱导的ROS生成增加，这可能促进氧化应激相关的肺损伤。一项回顾性研究提示，较高的NMR可能与COPD的存在有关，表明尼古丁代谢可能在临床易感性方面具有相关性。然而，现有证据基于相对较小的样本量，限制了其普遍性。迄今为止，中国人群中的此类证据尚缺乏。为了解决这些空白，我们将遗传因果推断与基于人群的表型分析相结合，以检查在相似吸烟暴露量下个体间尼古丁代谢的差异是否与COPD相关，并评估吸烟行为对此关联的贡献。

方法：
本研究将遗传流行病学与基于人群的表型分析相结合，系统地评估NMR与COPD之间的关系。首先，使用GWAS汇总统计数据进行了MR分析，以评估NMR对COPD的因果效应，并进行了共定位分析以评估共享的因果变异。其次，在CNTCCS中进行了横断面分析，比较了在相同吸烟暴露量下不同代谢表型的COPD患病率，以评估NMR与COPD之间的关联，并进一步研究了吸烟行为的中介作用（图1）。

图1：研究流程图。注意：带有十字符号的线条表示在MR中假设不存在直接因果途径。

图1的详细描述：
该信息图展示了两个部分：A部分：遗传因果推断；B部分：表型特征。A部分：遗传因果推断显示用于暴露的SNP（NMR），标记为“Buchwald等人，N = 5,185”；NMR与结果（COPD）相关，列出了“FinnGen病例/对照组18,266 / 311,286”和“MVP病例/对照组103,054 / 315,405”。显示了一个混杂因素框，虚线路径包含十字符号，表示在MR中假设不存在直接因果途径。分析块包括：主要分析：“逆方差加权（IVW）MR”；敏感性分析：“MR-RAPS”、“MR-PRESSO”、“最大似然”和“MR-Egger”；最后一块是“共定位分析”。B部分：表型特征列出了“研究人群CNTCCS（N = 2,943）”。纳入/排除框列出了“无COT和3-HC（N = 1,412）”和“缺失基线信息（N = 165）”，从而得到“符合条件的参与者（N = 1,366）”。两个分组框分别列出了“NMR表型：慢代谢者（NMR小于0.31）；正常代谢者（NMR大于或等于0.31）”和“结果状态：COPD（N = 254）；非COPD（N = 1,112）”。其余块包括“按吸烟暴露分层的核心表型比较”和“在相同暴露水平下的比较”以及“中介分析”。

本研究获得了中日友好医院伦理委员会的批准（2024-KY-336），所有程序均遵循赫尔辛基宣言的原则。

孟德尔随机化：
NMR的GWAS汇总数据来自Buchwald等人进行的大规模研究，包括5,185名欧洲血统的个体。COPD的汇总数据最初来自FinnGen联盟（J10_COPD、早发性COPD、晚发性COPD），详细信息见FinnGen研究的数据库（https://www.finngen.fi/en），包含18,266例病例和311,286例对照组。COPD的汇总数据还来自美国退伍军人事务部百万退伍军人计划（MVP_COPD），包括103,054例病例和315,405例欧洲血统的对照组。

工具选择和功能途径富集分析：
在全基因组范围内具有显著性的单核苷酸多态性（SNPs，P < 5×10^-8）被选为工具变量，并使用1000 Genomes参考面板进行了连锁不平衡（r2 < 0.2，500 kb窗口）的筛选。排除了次要等位基因频率高（>0.40）的回文SNPs以及结果数据集中不可用的变异。使用F统计量（F > 10）评估工具变量的强度。FinnGen数据集中包括68个独立SNP，其中59个也存在于MVP数据集中（补充表1和2）。使用MR-PRESSO和RadialMR评估潜在的异常值和水平多效性。

双样本MR：
使用逆方差加权（IVW）方法进行了单变量双样本MR，以估计NMR对COPD的因果效应。敏感性分析包括最大似然、MR-RAPS和MR-PRESSO。进行了反向MR和留一法分析，以评估潜在的反向因果关系和单个SNP的影响。所有分析均使用“TwoSampleMR”R包进行。

分层双样本MR分析分别针对早发性COPD（定义为65岁之前的首次COPD诊断）和晚发性COPD（定义为65岁及以后的首次COPD诊断）进行了分析。

共定位分析：
共定位分析用于评估NMR和COPD是否在每个工具SNP的±500 kb范围内共享因果变异。使用“coloc R”包估计了五个假设（H0–H4）的后验概率，共享因果关系的后验概率（PPH4）>75%被视为共定位的证据。

横断面分析：
研究人群来自之前描述的大规模国家队列CNTCCS。符合条件的参与者需满足以下标准：（1）年龄20岁或以上；（2）具有完整的基线问卷数据；（3）提供血液样本进行实验室检测；（4）提供书面知情同意书。有自报其他肺部疾病史（包括哮喘、肺结核、肺癌或肺部感染）的个体以及关键变量缺失的个体被排除在分析之外。

测量：
COPD根据支气管扩张剂使用后的1秒用力呼气容积（FEV1）与用力肺活量（FVC）的比率小于0.7来定义。NMR计算为3-HC/COT比率。COT和3-HC的血浆水平通过液相色谱-串联质谱（LC–MS/MS）测定，定量下限为0.5 ng/mL。其他协变量（包括人口统计特征和吸烟行为）来自基线问卷。

统计分析：
NMR使用预定义的临界值0.31进行二分类（根据我们之前的研究），NMR < 0.31定义为慢代谢，NMR ≥ 0.31定义为正常代谢。患病率计算为每个代谢表型和吸烟暴露层中COPD参与者的比例。在不同每天吸烟支数、吸烟持续时间和包年数的层间进行了代谢表型之间的患病率比较。中介分析使用“mediation”R包基于Baron和Kenny框架进行。为了与遗传分析保持可比性，中介分析在65岁以下参与者中进行。回归模型用于估计NMR对COPD的总效应、NMR与吸烟行为（包年数）之间的关联，以及在NMR条件下的吸烟行为与COPD之间的关联，并调整了相关协变量。间接效应使用5,000次重样的自助法进行估计。所有回归和中介模型均调整了年龄、性别、国籍、婚姻状况和教育水平。关键变量缺失的参与者被排除在分析之外。双侧P值<0.05被视为统计学上显著。所有分析均使用R软件（版本4.3.2）和SPSS软件（版本26.0）进行。

结果：
NMR与COPD之间的遗传关联证据：
IVW方法显示，遗传预测的NMR与COPD易感性呈正相关（FinnGen：OR = 1.065，95% CI：1.052–1.078，P < 0.001；MVP：OR = 1.058，95% CI：1.050–1.065，P < 0.001）。这些关联在多种敏感性分析中均具有稳健性，包括最大似然（FinnGen：OR = 1.063，95% CI：1.050–1.077；MVP：OR = 1.056，95% CI：1.048–1.064）、MR-RAPS和MR-PRESSO（图2）。

图2：双样本孟德尔随机化显示NMR对COPD的因果证据。注意：森林图显示了每种双样本MR方法的标准化beta值（95% CI）。

数据类型：IV计数、带有95%置信区间和P值的比值比。关键模式：所有P值均小于0.001，所有比值比均大于1.00。
- 第1行：FinnGen_COPD；逆方差加权；68个样本；OR = 1.065（95% CI：1.052–1.078），P < 0.001。
- 第2行：FinnGen_COPD；MR-RAPS；68个样本；OR = 1.068（95% CI：1.056–1.081），P < 0.001。
- 第3行：FinnGen_COPD；最大似然；68个样本；OR = 1.065（95% CI：1.053–1.077），P < 0.001。
- 第4行：FinnGen_COPD；MR-PRESSO；68个样本；OR = 1.064（95% CI：1.052–1.078），P < 0.001。
- 第5行：FinnGen_COPD；MR-Egger；68个样本；OR = 1.072（95% CI：1.043–1.110），P < 0.001。
- 第6行：MVP_COPD；逆方差加权；59个样本；OR = 1.058（95% CI：1.050–1.065），P < 0.001。
- 第7行：MVP_COPD；MR-RAPS；59个样本；OR = 1.058（95% CI：1.049–1.066），P < 0.001。
- 第8行：MVP_COPD；最大似然；59个样本；OR = 1.058（95% CI：1.050–1.066），P < 0.001。
- 第9行：MVP_COPD；MR-PRESSO；59个样本；OR = 1.058（95% CI：1.050–1.065），P < 0.001。
- 第10行：MVP_COPD；MR-Egger；59个样本；OR = 1.070（95% CI：1.053–1.088），P < 0.001。

散点图、森林图和留一法图一致支持MR结果的稳健性（补充图1–5）。基于MR-Egger和MR-PRESSO测试未检测到水平多效性（所有P > 0.05；补充表3），漏斗图对称性进一步表明没有方向性偏差（补充图6）。在将COPD视为暴露的反向MR分析中，所有方法均未发现支持COPD对NMR的因果效应的证据（补充表4）。

基于FinnGen研究中定义的发病年龄类别的分层孟德尔随机化分析显示，早发性COPD的ORivw为1.118（95% CI：1.099–1.136，P < 0.001），晚发性COPD的估计值为1.026（95% CI：1.009–1.042，P = 0.001）。MR-Egger和MR-PRESSO分析未显示出水平多态性的证据（P > 0.05；见补充表5和补充表6）。共定位分析识别出共享的遗传信号，在19号染色体上的CYP2A6–EGLN2位点中，NMR和COPD之间存在共享的遗传信号。在FinnGen数据集中，主要变异rs8102683显示出强烈的共定位证据，共享因果变异的后验概率（PPH4）为0.935。在MVP数据集中也观察到了类似的共定位信号，涉及rs56113850、rs12610432和rs7937（PPH4范围：0.864–0.996）（见补充表7和补充图S7）。

CNTCCS中NMR与COPD的表型关联
在CNTCCS的2,943名参与者中，有1,531名提供了COT和3-HC数据。排除缺失基线信息的个体后，最终分析纳入了1,366名参与者，其中254人（18.6%）患有COPD。与没有COPD的参与者相比，COPD患者的吸烟持续时间更长（37.78 ± 9.99年 vs 24.74 ± 11.48年），累计吸烟暴露量（以包年计算）也更高（37.24 ± 20.01包年 vs 24.06 ± 16.30包年）（P < 0.001）。COPD患者更可能具有正常的尼古丁代谢能力，其平均NMR值也高于没有COPD的参与者（0.31 vs 0.26，P < 0.001）。表1总结了基线特征。

NMR表型与不同吸烟暴露层中的COPD患病率相关
在所有吸烟暴露层中，正常代谢者的COPD患病率始终高于慢代谢者，尤其是在吸烟暴露量较大的参与者中差异显著。具体来说，在吸烟少于20包年和大于或等于20包年的参与者中，正常代谢者的COPD患病率分别为10.5%和33.0%，而慢代谢者分别为7.9%和20.7%（见图3）。图3显示了在不同吸烟暴露水平下，NMR代谢表型与COPD患病率的关系。注意：(A和B) 每天吸烟支数（<20支和≥20支）；(C和D) 吸烟持续时间（<20年和≥20年）；(E和F) 包年（<20年和≥20包年）。误差条代表95%置信区间。* P < 0.05，*** P < 0.001。

NMR表型在相似吸烟暴露水平下分层后，COPD患病率也有差异。进一步控制累计吸烟暴露量后，无论是慢代谢者还是正常代谢者，COPD患病率都逐渐增加；然而，在每个包年层内，正常尼古丁代谢者的COPD患病率始终高于慢代谢者（见补充图8）。

吸烟行为部分介导了NMR与COPD之间的关联
中介分析表明，吸烟行为部分介导了NMR与COPD之间的关联，具有显著的间接效应（β = 0.0049，P < 0.001），占总效应的约14.5%。调整吸烟行为后，NMR对COPD的直接效应仍然显著（β = 0.0288，P = 0.004）（见表2）。

讨论
据我们所知，这是首次通过整合遗传因果推断和基于人群的表型分析系统评估NMR与COPD之间关联的研究。我们的研究揭示了几个有意义的发现。首先，结果表明NMR作为一种高度稳定的代谢表型，与COPD相关。其次，正常代谢者在不同吸烟行为层中的COPD患病率高于慢代谢者，即使在相似的包年类别中也是如此，这表明仅靠吸烟暴露无法完全解释观察到的差异。最后，中介分析表明吸烟行为仅解释了部分关联，表明个体间尼古丁代谢的差异可能影响COPD的易感性。

我们的发现与先前的研究一致，这些研究表明尼古丁代谢和CYP2A6在呼吸系统疾病中起作用。一项在戒烟诊所进行的观察性研究涉及78名参与者，报告称即使考虑到传统的吸烟暴露指标，较高的NMR也与COPD的存在独立相关。此外，多项前瞻性队列研究表明，年轻吸烟者的肺部损伤对吸入模式和毒素处理的差异更为敏感，这突显了代谢和行为异质性在疾病早期阶段的潜在重要性。我们的研究还进一步证明尼古丁代谢是与COPD相关的独特表型特征。吸烟持续时间反映了长期接触烟草的情况，而COPD和短期生物标志物（如可替宁）主要捕捉近期暴露强度。COPD特别容易受到回忆偏差和短期行为改变的影响，尤其是在已经出现呼吸系统症状的个体中，他们可能会有意减少每日吸烟量。相比之下，NMR是一个稳定的生物学特征，受短期吸烟行为变化的影响较小。尼古丁代谢较快的吸烟者可能会通过更深或更频繁地吸入来维持所需的尼古丁水平，从而在较短的时间内增加有害烟草成分的摄入量，可能增加COPD的风险。共定位分析表明，NMR和COPD可能在CYP2A6–EGLN2位点共享潜在的因果变异。EGLN2参与缺氧信号传导和炎症调节，这些过程与早期气道重塑和小气道损伤密切相关。

我们的发现具有重要的公共卫生意义。目前对吸烟者的COPD风险评估仍然主要依赖于自我报告的吸烟史，可能导致对实际烟草暴露的低估或误分类。个体尼古丁代谢的指标可以提供更全面的烟草暴露特征描述，并有助于识别尽管吸烟水平相似但COPD易感性较高的个体。将代谢表型纳入吸烟暴露或COPD易感性评估框架中，可能有助于制定更精细和个性化的COPD预防策略。

我们研究的优势包括确定尼古丁代谢是一种与COPD易感性相关的稳定代谢表型，这一发现得到了遗传学和基于人群的证据支持。然而，本研究也存在一些局限性。首先，MR分析基于公开可用的GWAS汇总统计数据，因此缺乏个体层面的数据，无法按吸烟行为或疾病进展进行分层遗传分析。其次，遗传分析基于欧洲血统的GWAS数据集，而表型分析是在中国人群中进行的，这可能影响结果的普遍性。第三，基于人群的分析是横断面的，没有包括一年的随访，限制了对时间关系和疾病发病率的评估。由于数据缺失比例较高，BMI未被纳入作为协变量，可能导致残余混杂。此外，表型队列的样本量适中，可能限制了某些亚组分析的统计功效，因此应对相应结果持谨慎态度。此外，CYP2A6–EGLN2区域中共定位的共享变异需要通过功能研究进一步验证。还需要进一步的纵向和机制研究。

结论
总之，我们的研究表明，个体间尼古丁代谢的差异（通过NMR捕捉）与COPD易感性增加相关，这部分差异只能部分通过吸烟行为来解释。这些发现表明，将尼古丁代谢纳入吸烟暴露评估可能有助于改进COPD的风险分层。

伦理声明
该研究获得了中日友好医院伦理委员会的批准（2024-KY-336），所有程序均遵循赫尔辛基宣言的原则进行。所有参与者均签署了书面知情同意书。

数据共享声明
当前研究中使用和/或分析的数据集可应要求从相应作者处获取。