利用佩特里网和不变量计算对信号网络进行定性分析 Rza Bashirov

《Eng》：Qualitative Analysis of Signaling Networks Using Petri Nets and Invariant Computation Rza Bashirov

　　摘要：对生化反应系统的定性分析揭示了系统层面的基本属性，这些属性独立于精确的动力学参数，通常是依赖上下文的，或者无法通过实验获得。通过关注结构和拓扑特征——如守恒关系、反馈循环和路径互连——定性分析能够识别出信号网络固有的不变行为、鲁棒机制和潜在的故障模式。在这项研究中，我们使用Petri网作为一种形式化的建模框架，对整合的MAPK和PI3K/Akt信号网络进行了定性分析。通过利用包括位置不变量、转换不变量和虹吸现象在内的结构属性，分析建立了Petri网结构与生物学上有意义的守恒定律、信号模块和特征动态行为之间的直接对应关系。研究结果表明，所提出的模型在结构上是一致的，在生物学上是合理的，并且是模块化的。最小的半正位置不变量证实了质量守恒，表明蛋白质和酶在封闭的分子池中循环；最小的半正转换不变量识别出了支持持续和可逆信号传导的典型激酶-磷酸酶循环。层次分解显示了一个可简化为可重用酶基元的模块化组织，反映了跨级联的生物学再利用，并支持可扩展性。此外，识别出的十六个虹吸现象（它们同时也是陷阱）突显了确保关键调节因子持续可用的持久子系统，证实了整合网络的鲁棒性和动态可持续性。

1. 引言
信号网络的结构属性对于癌症治疗与单个分子组件的行为同样重要。因此，研究整合的丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）和磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（PI3K/Akt）信号网络中的分解、模块化、反馈模式和不变子网络等特征，对于理解黑色素瘤的进展和治疗失败至关重要。在黑色素瘤中，MAPK信号的持续激活非常普遍；然而，其药理学抑制通常会导致PI3K/Akt通路的补偿性激活，从而迅速产生耐药性。这种现象不能仅通过孤立突变或单一通路元素来充分解释。相反，它是由于信号网络的模块化组织造成的，这种组织允许与生存相关的模块在增殖驱动的模块被有效抑制时仍然保持活跃。
结构分析为这种鲁棒性提供了系统级的解释，并阐明了为什么单一通路靶向策略在黑色素瘤治疗中往往不够有效。通过将网络分解为功能模块，并识别出结构上保守的核心以及脆弱的模块间界面，我们可以区分那些维持持续生存信号传导的子网络和那些容易受到协调性干扰的子网络。这些见解对于合理设计联合疗法至关重要，因为它们指出了必须同时针对哪些模块以防止网络的适应性重连。重要的是，即使在没有详细动力学参数的情况下，强调结构属性也能得出稳健的结论，这使得这种方法特别适合于应对黑色素瘤癌症的内在异质性和复杂性。

每个生物系统——无论是信号系统、代谢系统还是基因调控系统——都可以被形式化为一系列相互作用的生化反应的集合。Petri网为这样的系统提供了一种自然且严谨的建模形式：分子物种被映射到位置上，生化反应被映射到转换上，反应物和产物之间的化学计量关系被映射到有向弧上。由于这种紧密的结构对应关系，Petri网特别适合捕捉生化反应网络的组织和动态。
Petri网在系统生物学中的应用可以追溯到20世纪90年代初，Reddy及其同事首次认识到生化反应系统的行为与Petri网底层执行语义之间的强烈相似性 [1]。自此之后，Petri网被广泛用于建模和分析生化网络，包括连续、混合、彩色、层次化、随机和模糊Petri网的扩展，并提供了许多案例研究，凸显了其分析能力 [2,3,4,5,6,7,8,9]。
几项先前的工作已经具体使用了基于Petri网的方法来研究MAPK和PI3K/Akt信号通路。例如，在 [10] 中，一个连续的Petri网模型明确包含了通过Ras介导的MAPK和PI3K/Akt通路之间的相互作用，将Ras及其调控机制确定为克服黑色素瘤BRAF抑制剂耐药性的潜在治疗靶点。在 [11] 中，提出了结合图论中心性度量的Petri网中的虹吸分析，作为一种用于识别MAPK通路内多组分疗法靶点的策略。此外，Heiner及其同事的工作系统地建立了位置不变量（P-不变量和T-不变量）在揭示生化网络（包括MAPK信号传导）的模块化组织方面的实际效用 [12]。特别是，他们报告了如何使用基于不变量的分析将大型复杂的生化网络分解为生物学上有意义的模块。
在这些方法论基础上，本研究采用了Snoopy软件 [13] 来构建整合的MAPK和PI3K/Akt信号网络的Petri网模型，并使用Charlie软件 [14] 来计算和分析结构属性，包括P-不变量、T-不变量以及虹吸现象和陷阱。我们方法的创新之处在于，据我们所知，这是第一项系统地从分解、模块化和其他结构属性的角度，使用基于不变量的Petri网分析来研究整合的MAPK和PI3K/Akt信号网络的研究——这对于理解黑色素瘤和其他类型的癌症至关重要。
研究表明，所提出的模型在结构上是一致的，在生物学上是有意义的，并且是模块化的。最小的半正P-不变量证实了所有主要信号组分在其生化状态下的守恒，表明蛋白质和酶在封闭的分子池中循环；最小的半正T-不变量识别出了支持两条通路中持续和可逆信号传导的典型激酶-磷酸酶循环。层次分解揭示了一个模块化组织，其中复杂网络可以简化为可重用的酶基元，反映了信号级联中的生物学再利用，并支持模型的可扩展性和可解释性。识别出的十六个同时作为陷阱的虹吸现象进一步证明了系统的鲁棒性，因为这些持久子系统确保了关键调节因子的持续可用性，包括Ras、RAF、MEK、ERK、Akt及其相关的磷酸酶。总的来说，基于不变量的Petri网分析提供了一个简洁的、与动力学无关的框架，用于验证信号模型，揭示模块化结构，并支持后续的定量模拟、扰动分析和针对MAPK–PI3K/Akt相互作用的治疗策略探索。

本文的其余部分组织如下：第2节介绍了生物学背景，第3节概述了本研究采用的研究方法。第4节详细介绍了生化反应网络中的模块化，第5节详细介绍了模型创建的主要步骤。第6节提出了模拟结果，并对网络的结构和行为属性进行了详细讨论，包括最小的半正P-不变量和T-不变量及其生物学解释。第7节总结了主要发现和未来研究的方向。第8节将所提出的基于Petri网的方法与其他常用的系统生物学建模框架进行了对比。

2. 生物学背景
本节总结了MAPK和PI3K/Akt信号通路及其分子互连，这些信息基于京都基因与基因组百科全书（KEGG）[15,16]、Reactome（一个包含反应、通路和生物过程的数据库）[17] 以及相关文献。

2.1 MAPK通路
MAPK通路代表了一个典型的多阶段信号转导级联，在这个过程中，外部刺激通过一系列激活和失活事件传播。信号通过一个分层的组件链进行传递，每个阶段通过磷酸化激活下一个阶段，形成一个有向的层次结构。
激活始于与膜相关的受体，并通过一个中间转换元件（Ras）传递，随后是RAF–MEK–ERK级联。这种架构展示了计算管线的典型特征，包括放大、模块化和上游信号检测与下游响应执行之间的分离。
调节控制是通过由磷酸酶介导的专用失活过程实现的，这确保了信号的时间限制、可逆性和防止不受控制的传播。这些对立的激活-失活循环自然形成了适合基于不变量分析的保守子结构。

2.2 PI3K/Akt通路
PI3K/Akt通路构成了一个平行的信号模块，它处理相同的上游输入，但强调系统状态的持久性和稳定性。信号传播是通过产生一个中间的膜相关状态变量（PIP3）来实现的，这使得下游组件的条件性激活成为可能。中央效应因子（Akt）的激活需要多个协调的事件，这反映了正式模型中常见的逻辑连接。负调节是通过一个专门的对抗过程（PTEN）实现的，它将系统恢复到其基线状态并强制资源守恒。从建模的角度来看，该通路的特点是状态依赖的转换、反馈控制和激活与失活过程之间的竞争。

2.3 MAPK和PI3K/Akt通路之间的相互关系
MAPK和PI3K/Akt通路形成一个耦合网络，而不是独立的线性链。它们共享上下游的激活因子，并在下游层面表现出双向的调节交互。这些互连引入了非平凡的依赖性、反馈循环和条件约束，这些因素显著影响了整个系统的行为。通路之间的交叉调节可以根据系统状态来加强或抑制信号传播，从而防止单一通路的主导并增强鲁棒性。共享的调节组分，特别是磷酸酶，在通路边界之间运作，有助于协调和同步信号活动。
从计算的角度来看，整合的MAPK–PI3K/Akt网络体现了一个分布式的、资源受限的系统，具有并发性、反馈和模块化组织。这些特性激发了使用形式化建模框架（如Petri网）来分析守恒关系、不变结构以及独立于动力学参数的涌现的定性行为。

图1示意性地描绘了MAPK和PI3K/Akt通路及其相互作用，明确指出了关键的激酶和磷酸酶，如RasGTP、RAFP、MEKPP、PTEN和PP2A，同时额外的调节过程由第1阶段到第6阶段表示。

3. 研究方法
本研究采用基于结构Petri网的方法论，在抽象的、定性的层面对信号网络进行解析。我们关注那些能够捕捉守恒性、连通性和与死锁相关行为的成熟Petri网属性，这些属性独立于动力学参数。更多细节请参考参考文献 [18]，这是一篇关于Petri网原理的永恒且基础性的论文。

定义1. Petri网是一个5元组，包括位置集合、转换集合、输入弧集合、输出弧集合和初始标记。
在Petri网模型中，物质和反应由不同的图形元素表示：位置用圆圈表示，转换用矩形表示。转换的输入位置对应于反应前的底物，而输出位置则表示该反应产生的产物。有向弧表示从底物到产物的流动。具体来说，输入弧连接输入位置到转换，而输出弧从转换延伸到其对应的输出位置。在图形上，位置可能包含称为标记的离散单元。每个标记表示与相应位置相关联的组分的存在，标记的数量量化了系统中该组分的数量。标记在位置之间的初始分配称为初始标记。
关于Petri网，唯一需要了解的规则是转换触发的规则。尽管这个规则看起来非常简单，但它对Petri网理论的影响却是深刻而复杂的。接下来，我们将详细阐述与Petri网相关的标记流规则。
如果每个输入位置p至少有标记t，则称转换t是启用的或可用的。因此，如果对于所有的p和t都满足条件，则t是启用的，其中w(p)是从p到t的弧的权重，P(t)是t的输入位置的集合。如果存在一个输入位置p，其标记数量少于t中的标记数量，则称转换t在标记M中是禁用的或不可用的。也就是说，如果存在满足条件的p，则t是禁用的。一个启用的转换可能会或可能不会触发或发生，这取决于事件是否实际发生。一个启用的转换t的发生会从P(t)中移除标记，并将标记添加到P(t)中，其中w(t)是从t到p的弧的权重，P(t)是t的输出位置的集合。用更数学化的语言来说，启用转换t的发生会将Petri网的状态从M变为如下状态：自循环（或简单循环）是位置和转换之间的双向连接。如果不存在这样的循环，Petri网就是纯的，这确保了位置不会同时被同一个转换消耗和生产。在建模术语中，纯性强制生产与消耗机制之间的明确分离。如果所有弧的权重都 equal to one（即单位化学计量比），则Petri网是普通的。如果一个位置的所有出弧具有相同的多重性，则Petri网是同质的，这意味着转换之间的消耗速率是均匀的。结构连通性确保所有节点属于单一组件，而强连通性则保证通过有向路径可以实现相互可达。额外的结构约束用于评估平衡和竞争性。如果每个位置的输出弧权重不超过输入弧权重，Petri网具有非阻塞多重性，反映了生产和消耗的平衡。如果每个转换都保持总令牌计数不变，Petri网是保守的，表明存在结构守恒定律。如果没有任何位置向多个转换供能，Petri网就是静态无冲突的，从而消除了资源之间的结构竞争。我们还考虑了特定结构元素的缺失。没有输入转换的Petri网确保每个转换至少需要一个前置位置，而没有输出转换则意味着每个转换都会产生令牌。同样，没有输入位置确保每个位置都至少由一个转换产生，而没有输出位置则保证每个位置最终都会被消耗。这些属性排除了自发创建、纯粹的降解和无限积累的可能性。与死锁相关的行为通过“虹吸”和“陷阱”来分析。“虹吸”是一组非空的位置，一旦被清空就无法重新填充；“陷阱”是一组非空的位置，一旦被标记就无法失去所有令牌。形式上，如果集合S满足特定条件，则它是虹吸；如果集合T满足其他条件，则它是陷阱。“虹吸-陷阱”属性表明，在一个活跃的Petri网中，每个虹吸都包含一个被标记的陷阱，确保虹吸不能被完全清空。这一属性对于验证大规模Petri网模型的活性和鲁棒性至关重要。本工作中的定性分析基于P-不变量和T-不变量。设A表示Petri网的关联矩阵。非平凡的非负整数解x是P-不变量，而解y是T-不变量。P-不变量表征了位置的守恒加权和，并暗示了有界性，而T-不变量代表了不改变标记的转换序列。在计算上，不变量分析归结为解决非负整数上的齐次线性系统。这种分析通过揭示结构守恒定律和循环执行模式来支持模型验证。具有相同支持集的P-不变量是线性相关的，不变量的非负线性组合仍然是不变的。本研究中的所有Petri网模型都是使用Snoopy构建的，不变量分析则是使用Charlie进行的，从而能够系统地验证结构正确性和一致性。

4. 反应网络的模块化
4.1. 基本模块模式
生物反应网络具有内在的模块化结构，复杂的细胞行为源于简单和重复反应模式的相互连接。这些模式被称为反应模块，可以在多个组织层次上识别，并为生物学解释和基于Petri网的建模提供了自然的基础。在系统生物学中，模块化支持可扩展性、鲁棒性以及在不同细胞环境中的功能组件的重用。我们考虑了从基本转换到酶循环的各种反应模块，这些都在明确的动力学假设下进行讨论。每个模块都构成了一个可重用的构建块，可以在保持其结构和功能特性的同时嵌入到更大的生化网络中。在最基本的层面上，不可逆反应代表了一个基本的转换模式。它捕捉了如合成或降解这样的单向过程，并在反应网络中建立了方向性。尽管简单，但这种模式作为更复杂反应结构的核心构建块。将这种模式扩展到可逆反应可以模拟在代谢和信号网络中普遍存在的平衡驱动过程。可逆性引入了双向性和缓冲能力，使分子物种之间能够动态平衡。在层次化表示中，正向和反向反应可以抽象为一个单一的可逆模块，展示了如何将多个基本步骤组合成一个连贯的功能单元。酶催化作用通过特定形式的反应来捕捉，通常在Michaelis-Menten动力学下进行解释。这个模块表示通过底物结合和产物释放实现的酶介导的转换，明确编码了酶的特异性和守恒性。它用一个更符合生物学现实的、仍然是模块化的抽象替换了简单的反应。这一概念进一步扩展到可逆的酶反应及其层次化抽象。在详细层面上，两个方向都由酶-底物复合物介导；而在更高层次上，整个过程被表示为一个紧凑的可逆模块。这说明了如何根据所需的抽象层次选择性地暴露或隐藏酶的细节。在质量作用动力学下，酶反应被明确地建模为特定形式，使得所有基本步骤和酶在自由状态和结合状态下的守恒都变得显式。这加强了酶驱动过程的多模态解释。最后，循环酶模块源于如特定形式的耦合可逆反应。这些循环代表了涉及不同酶的正向和反向转化的封闭催化过程。虽然详细表示暴露了多个结合和转化步骤，但层次化抽象将循环简化为一个单一的功能模块，捕捉了其净可逆行为。总之，生化反应网络本质上是模块化和层次化的。基本反应、可逆转换、酶机制和酶循环都可以被视为自包含的、可重用的模块。层次化表示允许在不丢失基本功能的情况下进行抽象，支持定性分析、基于不变量的推理以及大型生化系统的可扩展建模。

4.2. 集成MAPK-PI3K/Akt网络的Petri网模型
图2展示了使用Snoopy工具构建的集成MAPK和PI3K/Akt信号通路的Petri网模型。该Petri网包含50个位置和67个转换。通过宏转换（表示为同心圆）实现了层次化建模，这些宏转换用于抽象可逆反应。读弧（显示为一对对立的弧）在不对令牌计数进行修改的情况下对转换的触发施加了启用条件。

5. 创建模型
Petri网模型的构建基于从已建立的通路数据库（主要是KEGG和Reactome）获得的生化知识，以及相关文献的补充。建模过程侧重于捕捉集成MAPK和PI3K/Akt信号通路的基本结构，同时保持适合定性分析的抽象层次。反应的选择基于包含核心信号组件和定义MAPK和PI3K/Akt通路的典型相互作用。特别是，关键的分子实体如Ras、RAF、MEK、ERK、PI3K、Akt和PTEN及其相关的磷酸化-去磷酸化循环和酶介导的转换被纳入模型。特别关注保留生物学上重要的相互作用机制，尤其是那些由共享的上游调节因子介导的机制，以便准确反映信号网络的互连性质。为了确保一致性和分析的可行性，模型采用了介观层次的抽象。在这个层次上，生化反应以标准的Petri网模式表示，例如酶过程的结合-转化-释放模式，而不引入过多的分子细节。这种方法允许模型保持生物学可解释性，同时适用于基于不变量的分析。当不同数据源之间存在差异或不一致时，通过优先考虑在多个数据库中一致报告并得到文献支持的相互作用来解决问题。在存在替代表示的情况下，使用了众所周知的典型通路结构（如RAF-MEK-ERK级联和PI3K-PIP3-Akt轴）作为参考框架。缺乏足够共识或生物学支持的相互作用被排除在外，以保持模型的可靠性和清晰性。构建完成后，Petri网经过了结构验证，包括连通性和一致性的验证，以及不变量分析以确认守恒性质和生物学上有意义的循环行为的存在。因此，该模型在结构上是健全的，在生物学上也是合理的，为信号动态及其在黑色素瘤中的影响提供了合适的基础。

6. 模拟和定性分析
使用Charlie软件[14]对集成MAPK-PI3K/Akt Petri网模型进行了定性分析。该分析有效地验证了模型的关键结构和行为属性，提供了形式上的证据，表明该网络架构适合研究黑色素瘤特征性的信号鲁棒性和适应性行为。
6.1. 结构属性
分析确认Petri网是纯的且无循环的，排除了读弧和双弧。这一属性强制生产与消耗事件之间的明确分离，这对于准确模拟黑色素瘤驱动的MAPK和PI3K/Akt信号传导的顺序步骤至关重要。所有弧的权重都为单位权重，表明该模型是一个普通的Petri网。此外，每个位置的所有出弧具有相同的权重，确保了同质性。从建模的角度来看，这保证了跨竞争反应的令牌流动的均匀性，使得在靶向通路抑制下变得相关的替代信号路径得到公平表示。Petri网既是连通的也是强连通的，这意味着所有信号组件都可以通过反应序列相互可达。这一结构属性正式捕捉了通路间的相互影响和反馈，这些在黑色素瘤中已知有助于PI3K/Akt信号的补偿性激活。非阻塞多重性属性的满足进一步保证了令牌流动的平衡，防止了结构死锁，并支持了持续的信号传播。该网络是非保守的，反映了信号组件之间的结合和解离反应。这是表示与黑色素瘤进展和药物抵抗相关的瞬态复合物和通路重配置事件的必要建模特征。所有转换都有前置位置，满足了无输入转换的属性，所有位置都有前置转换，确保信号组件既不会自发产生也不会独立于上游反应。最后，无输出位置的属性保证了组件不会在结构上耗尽，允许持续的服务信号活动。总体而言，这些属性支持使用该模型分析治疗扰动下的长期黑色素瘤信号行为。

6.2. 行为属性
行为分析显示Petri网是1-有界的（安全的），更一般地说是k-有界的，确保所有位置的令牌计数保持有限。从建模的角度来看，这保证了状态空间的数值稳定性，并使得黑色素瘤信号动态的可靠模拟成为可能，而不会出现信号活动的无限制积累。Petri网是活跃的，意味着每个转换最终都可能被触发，并且可能会无限次触发。这一属性正式捕捉了即使在抑制性扰动下，MAPK和PI3K/Akt信号在黑色素瘤中的持续激活潜力。该网络也是可逆的，意味着系统可以通过适当的触发序列恢复到初始标记状态，反映了黑色素瘤信号网络在暂时抑制后重新建立活跃状态的能力。该网络并非动态无冲突的，表明存在不能同时被激活的竞争转换。从结构上讲，这编码了互斥的信号事件和条件性的反应可用性。在黑色素瘤的背景下，这样的冲突对应于有助于治疗抵抗的适应性通路选择机制。重要的是，没有发现死亡标记，且没有死亡转换的存在确保了信号活性不会被永久阻断，从而支持了信号通路的持续重新激活。这个Petri网被转换不变量所覆盖，证明了所有反应都参与了能够再现初始标记的循环激发序列。这种不变的结构为长期存在的黑色素瘤细胞存活提供了形式上的证据。位置不变量的覆盖进一步确保了每个组件状态空间内的令牌循环是有限的，证实了MAPK和PI3K/Akt网络中信号资源的结构保守性。最后，该网在转换不变量方面不是强连接的，表明存在局部的循环子网络。这些短反应循环在结构上代表了最小的反馈模式，使得快速补偿反应成为可能，这是黑色素瘤信号系统中观察到的鲁棒性和治疗抗性的关键因素。

6.3. 最小半正P-和T-不变量及其生物学解释
不变量分析识别出了十二个最小半正P-不变量，每个不变量代表了一组封闭的位置，其总令牌计数得到保持。从结构上讲，每个P-不变量聚合了单一信号实体的所有可达状态，建立了其状态空间上的保守定律。完整的P-不变量集合在表1中报告。例如，不变量包括所有与Akt、AktP、AktPP及其相应复合体相关的位置，表明尽管在多个生化状态之间转换，总Akt浓度仍然得到保持。同样，不变量将RAF、RAFP及其相关复合体组合在一起，反映了磷酸化-去磷酸化过程中的RAF保守性。图3、图4和图5分别展示了对应于P-不变量的代表性网络结构。所有这三个P-不变量都是使用Charlie软件自动识别的，之后对其生物学含义进行了解释。这些不变量表明集成MAPK和PI3K/Akt网络的所有核心组件能够在多个功能状态之间循环，而不会产生新的令牌或丢失令牌。因此，Petri网完全被位置不变量所覆盖，证实了质量的守恒，并确保了模型的物理一致性。这一属性保证了信号活性的重新分配，而不是放大或减少，这是分析在扰动下长期网络行为的前提条件。

此外，还识别出了十一个最小半正T-不变量，每个不变量对应于一个最小的循环激发序列。从形式上看，这些T-不变量定义了将系统恢复到初始标记的基本动态构建块。这样的循环构成了网络的基本动态组成部分，并确认所有转换都参与了持续的活动。完整的T-不变量集合及其相关的转换序列在表2中总结。在图6的右侧面板中，T-不变量对应于PI3K–PTEN脂质信号循环，其结构由转换集合=(R45, R48, R43, R46, R67)定义，如表2所示。从生物学上讲，这个循环代表了一系列反应，包括PI3K的激活、PI3K与PIP2的结合、PIP2向PIP3的磷酸化、PTEN与PIP3的结合以及随后的PIP3向PIP2的去磷酸化。这些反应共同构成了一个完整的磷酸化-去磷酸化循环，其中PI3K介导正向转换，而PTEN催化反向过程。从机制上看，如图6右侧面板所示，这个不变量捕捉了一个封闭且自我维持的脂质信号循环。包含转换R67（对应于PI3K的激活），表明该循环是有条件激活的，并依赖于上游的调控信号，如Ras介导的激活。功能上，它代表了MAPK/Akt通路的一个核心调控模块。它维持了PIP2和PIP3之间的动态平衡，它们共同形成了一个可逆的脂质池，没有净积累，这与T-不变量的循环性质一致。

在黑色素瘤的背景下，这一结构属性解释了Akt信号持久的原因是：即使在受到干扰的情况下，该循环也无法被结构上消除，从而确保了持续的信号活动。此外，该模块内PI3K和PTEN之间的不平衡可能导致持续的通路激活，从而有助于产生治疗抗性。T-不变量（见图6左侧面板）代表了RAF激活循环，它是MAPK信号通路的入口模块。从结构上讲，它由转换集合=(R3, R6, R1, R4)定义。从生物学上讲，这个循环包括Ras_GTP与RAF的结合、RAF被磷酸化为活性形式(RAFP)、磷酸酶(Phase1)与RAFP的结合以及随后将RAF去磷酸化回其非活性状态的过程。从机制上看，如图6左侧面板所示，这个不变量形成了一个封闭的磷酸化-去磷酸化循环。它包括一个激活阶段，其中Ras_GTP促进RAF向RAFP的转换，以及一个失活阶段，其中Phase1催化反向反应RAFP到RAF。这种结构构成了一个最小的酶循环，涉及一个由上游Ras信号驱动的类似激酶的激活步骤和一个由磷酸酶介导的反向步骤。功能上，它对应于MAPK级联的初始调控模块。它表现出关键特性，如非活性和活性RAF状态之间的切换行为、可逆性，以及通过重复循环实现持续激活的能力。在黑色素瘤的背景下，这个不变量为MAPK信号即使在受到RAF靶向抑制的情况下也能持续重新激活提供了结构上的解释。

最小半正T-不变量对应于不可约的生化循环，确保了持续、可逆和模块化的信号活动。P-不变量控制脂质介导的生存信号，而T-不变量控制MAPK通路的激活动态。它们共同证明了集成网络由相互连接的循环模块组成，每个模块在结构上都得到保证可以运行，从而解释了黑色素瘤信号系统的鲁棒性和适应性。P-和T-不变量的共存表明Petri网既具有保守性又具有持续的动态特性。每个信号模块都具有一个保守的状态空间（P-不变量）和一个相关的循环执行模式（T-不变量），反映了基于重复反应模式的模块化组织。这种结构使得各个模块能够无限期运行，并支持在短暂中断后信号活动的恢复。此外，虹吸分析表明所有虹吸结构也是陷阱。从形式上看，这意味着一旦令牌进入这些位置集合，它们就不能通过任何激发序列完全移除。这样的陷阱结构保证了特定子网络的持久性，并防止了全局死锁。下面列出的识别出的虹吸结构代表了其活性不能被结构上消除的不变子系统。综合来看，不变量和虹吸分析表明，集成的MAPK和PI3K/Akt Petri网是保守的、动态上可持续的且模块化的。持续的循环行为在结构上是强制性的，关键子网络在所有可达标记下都保持活跃。这些属性为模拟中观察到的信号动态的鲁棒性提供了形式上的解释，并激发了使用该模型来研究致癌信号网络中的稳定和适应性行为。

= (PI, PIP, PIP2, PIP3, PIP_PHASE5, PIP2 sourceMapping5, PIP3_PTEN, PI_PHASE4, PIP穿搭4, PIP2_PI3K, AKT_PIP3) = (AKTP_PP2A, AKTPP_PP2A, PP2A) = (MEK_RAFP, MEK, MEKP, MEKPP, MEKP_RAFP, MEKP_phase2, MEKPP_phase2, ERK_MEKPP, ERKP_MEKPP) = (AKT, AKT_PIP3, AKTP, AKTP_PP2A, AKTP_PDK, AKTPP, AKTPP_PP2A, BAD_AKTPP) = (PI_PHASE4, PIP_PHASE4, PHASE4) = (BADP_PHASE6, PHASE6) = (BAD, BAD_AKTPP, BADP, BADP_PHASE6) = (RAF_RASGTP, RAF, RAFP, RAFP_phase1, MEK_RAFP, MEKP_RAFP) = (ERKP_phase3, ERKPP(phase3, PHASE3) = (RAS_GTP, PIP2_PI3K, PI3K, RAF_RASGTP) = (RAFP_phase1, PHASE1) = (MEKP_phase2, PHASE2, MEKPP_phase2) = (ERK, ERK_MEKPP, ERKP, ERKP_MEKPP, ERKP_phase3, ERKPP_PHASE3) = (AKTP_PDK, PDK) = (PIP_phrase5, PIP2_phrase5, PHASE5) = (PIP3_PTEN, PTEN) 脂质信号和PI3K/PTEN模块 虹吸捕获了完整的磷酸肌醇池以及酶结合的中间产物。它的虹吸-陷阱特性确保了脂质介导的信号状态不会在结构上耗尽，从而保持了Akt的招募和下游信号能力。虹吸捕捉了PHASE5介导的PIP/PIP2去磷酸化循环，表明脂质周转的持续调节。虹吸对应于PTEN–PIP3子系统，在结构上保证了MAPK/Akt信号中负调控的持续存在。这些虹吸共同反映了平衡但持续的脂质信号架构，这是黑色素瘤药物抗性中经常涉及的特征。

Akt信号和生存控制 虹吸包含PP2A及其与磷酸化Akt的复合体，确保Akt失活机制不会被耗尽。虹吸涵盖了所有Akt状态及其相关复合体，证实了Akt信号能力的结构上的保守性。虹吸捕捉了PDK及其与AktP的相互作用，保证了Akt完全激活的持久性。最后，虹吸和涵盖了BAD及其磷酸化形式以及PHASE6，确保了对凋亡相关信号的持续控制。总体而言，这些虹吸在结构上编码了生存信号的持久性，这是黑色素瘤治疗抗性的关键因素。

MAPK级联：RAF–MEK–ERK核心 虹吸代表了RAF模块，包括RasGTP依赖的激活和磷酸酶介导的失活，确保了MAPK通路的入口在结构上是可用的。虹吸捕捉了RasGTP及其直接的下游相互作用，反映了MAPK和PI3K/Akt通路共享的上游激活剂的持久性。虹吸和代表了MEK模块及其调控磷酸酶，保证了通过MEK的不间断信号传播。虹吸和代表了ERK池及其相关磷酸酶，结构上保证了MAPK输出的持续性和ERK激活的可逆性。这些属性与在MAPK靶向抑制后观察到的黑色素瘤中快速的通路重新激活一致。总体而言，虹吸与之前识别出的最小P-不变量紧密对齐，每个不变量对应于一个保守的信号实体或调控模块。它们的双重虹吸-陷阱性质表明，集成的MAPK–PI3K/Akt网络在结构上受到保护，防止了关键组分的耗尽。这保证了激酶-磷酸酶循环的长期功能性，以及通路之间的鲁棒性交叉对话，即使在缺乏明确动力学假设的情况下也是如此。

7. 结论
本研究提出了一个集成的MAPK-PI3K/Akt信号网络的Petri网模型，并对其进行了全面的定性分析，包括P-不变量、T-不变量、虹吸-陷阱属性和其他结构特征。结果证明，所提出的Petri网模型在结构上是一致的、模块化的，并且在生物学上是合理的。最小半正P-不变量在所有主要信号组分上建立了严格的保守定律，正式证实了蛋白质和酶既不会被创造也不会被破坏，而是会在明确定义的生化状态之间循环。最小半正T-不变量识别了典型的激酶-磷酸酶循环，确保了两个通路上的持续和可逆的信号动态。网络的层次分解揭示了一种模块化组织，其中复杂的信号行为源自可重用酶基序的组成。从建模的角度来看，这种模块化支持了大规模信号网络的可扩展性、可解释性和系统化精细调整。从疾病导向的角度来看，它反映了黑色素瘤细胞利用的保守信号机制，以在药理学扰动下维持通路活动。识别出的十六个既是虹吸又是陷阱的结构提供了结构鲁棒性的强有力形式证据。这些虹吸-陷阱结构对应于不能被网络动态耗尽的信号子系统，保证了Ras、RAF、MEK、ERK、Akt及其相关磷酸酶等关键调节因子的持续可用性。在黑色素瘤的背景下，这种结构持久性为模拟中观察到的MAPK和PI3K/Akt信号的韧性提供了解释，并与靶向抑制后出现的适应性和补偿性反应一致。综合来看，不变量和虹吸分析表明，集成的MAPK和PI3K/Akt网络在质量上是守恒的、动态上可持续的，并且对结构关机具有抵抗力。这些属性为长期信号活动及其通路重新激活提供了形式上的、与动力学无关的解释，这些现象与黑色素瘤中的药物抗性密切相关。总之，本文中使用的基于不变量的Petri网框架为验证信号模型提供了严格的方法，揭示了保守的结构，并在没有依赖参数化动力学的情况下对长期系统行为进行了推理。结果为后续的定量模拟、系统扰动研究以及旨在破坏MAPK–PI3K/Akt通路交叉对话的治疗策略的形式化分析奠定了坚实的基础。

8. 讨论
除了本文中呈现的结构分析之外，将所提出的基于Petri网的方法与其他常用的系统生物学建模框架进行比较也是有益的。常微分方程（ODE）模型提供了信号动态的详细定量描述，并能够精确模拟时间行为。然而，这些方法的适用性在很大程度上依赖于可靠动力学参数的可用性，而这些参数在复杂系统中（如黑色素瘤信号网络）往往是不完整的、依赖于具体情境的，或者无法通过实验获得。相比之下，本研究采用的Petri网框架本质上不依赖于动力学机制，它关注的是结构和拓扑特性，从而能够在无需参数估计的情况下识别出守恒定律、循环行为以及模块化组织结构。逻辑和布尔模型提供了一种替代的定性方法，它们通过将分子组分表示为离散状态来捕捉大规模的调控相互作用，但这样做通常会降低复杂度。虽然这些模型适用于粗粒度分析，但它们并没有明确考虑化学计量比、并发性或资源守恒问题。Petri网通过其基于令牌的形式主义自然地编码了这些特征，并支持基于不变量的分析，从而提供了对生化过程的更精细的表征。随机建模方法则纳入了内在的噪声和概率效应，这在低分子浓度下尤为重要。尽管这些方法有助于捕捉变异性和不确定性，但它们主要是基于模拟的，并不本质上能提供结构上的保证。相比之下，Petri网中的不变量分析提供了形式化的、可验证的性质——例如守恒关系和循环执行模式——这些性质独立于具体的参数值或随机实现情况。总体而言，基于Petri网的方法论通过提供一个严格的结构导向视角，补充了现有的研究方法。它能够识别出系统的基本属性，支持模块化分解，并提供了关于系统鲁棒性和持久性的见解，这对于理解黑色素瘤信号网络中的适应性行为和治疗抗性尤为重要。

补充材料
以下支持信息可以在以下链接下载：
https://zenodo.org/records/18467372
https://doi.org/10.5281/zenodo.18467372
这些材料将从2026年2月3日起可供查阅。