《ANALYTICAL AND BIOANALYTICAL CHEMISTRY》：Resolving charge and glycosylation variants of cetuximab combining offline ion-exchange and hydrophilic interaction chromatography–HRMS
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为了解决复杂单克隆抗体电荷与糖基化异质性的表征难题，本研究建立了一种离线的离子交换色谱（IEC）与亲水作用色谱-高分辨质谱（HILIC-HRMS）正交联用方法，并以西妥昔单抗为模型抗体。该方法通过IEC分离电荷变体，并利用RPLC捕集柱脱盐后，将各组分转移至低流速HILIC-MS进行糖型分析，成功实现了Fc和Fab相关糖型的高分辨分离，甚至可区分仅含Fc糖型的变体。此工作为深度表征下一代蛋白治疗药物的电荷与糖型多样性提供了有力工具，对全面评估其质量属性具有重要意义。
随着生物制药的迅猛发展，治疗性单克隆抗体（mAb）因其高效性和特异性，已成为治疗癌症、自身免疫病等多种疾病的重要武器。然而，这些“生物大分子”并非“标准化”产物，它们在生产和储存过程中，会经历一系列复杂的翻译后修饰，其中电荷变体（如脱酰胺、唾液酸化、C末端赖氨酸截断）和糖基化模式（glycoform patterns）的异质性尤为关键。这些微小的化学“指纹”差异，直接影响着药物的疗效、安全性和药代动力学，是严格监控的关键质量属性。想象一下，一个看似相同的单抗药物，内部却可能因糖链结构或电荷分布的不同，而呈现成千上万个不同的“亚型”，这给质量控制带来了巨大挑战。
传统的单维液相色谱-质谱（LC-MS）方法在分析完整单抗时，往往难以分辨这种高度复杂性，对低丰度“亚型”的检测力不从心。例如，常用的离子交换色谱（IEC）是分离电荷变体的“金标准”，但难以直接与质谱联用，且对中性糖型没有选择性。而能有效分离糖型的亲水作用色谱（HILIC），其分离又会受到共流出的电荷变体的严重干扰，导致质谱谱图复杂，难以解卷积。这就好比在嘈杂的集市中，难以听清每个人的独白。为了“听得”更清楚，研究人员需要一种能将复杂“混响”按不同“声部”逐一分离的方法。因此，将基于电荷分离的IEC与基于糖链亲水性分离的HILIC正交联用，理论上可实现对特定电荷变体上糖型分布的精准“对焦”，是解决此问题的理想途径。然而，IEC常用的高盐缓冲液与HILIC所需的高有机相起始条件存在严重的溶剂不兼容性，使得两者的在线联用极具挑战。
为此，本研究在《ANALYTICAL AND BIOANALYTICAL CHEMISTRY》 杂志上，报告了一种创新的离线IEC-HILIC-HRMS正交工作流程，成功应用于高度复杂的嵌合IgG1抗体西妥昔单抗（Cetuximab）的深入表征。西妥昔单抗因其拥有四个N-糖基化位点（Fab区和Fc区各两个）和显著的电荷异质性，成为验证新方法的理想模型。
为开展研究，作者主要运用了以下关键技术与方法：首先，使用非挥发性缓冲液的强阳离子交换色谱（SCX-UV）对西妥昔单抗的电荷变体（酸性、主成分、碱性）进行高分辨分离，并按预设时间窗口自动收集五个组分。随后，为解决高盐组分与HILIC-MS的溶剂兼容性问题，创新性地引入一个C4反相液相色谱捕集柱作为接口，对IEC组分进行在线脱盐和体积浓缩。最后，将处理后的样品注入基于丙烯酰胺整体柱的低流速亲水作用色谱-高分辨质谱（HILIC-HRMS）系统，对脱盐后的各电荷变体组分进行高灵敏度、高分辨率的糖型分析。所有质谱数据通过Unidec软件进行去卷积处理以获得精确质量数。
结果与讨论
直接低流速HILIC-MS分析西妥昔单抗
首先，作者用之前开发的基于丙烯酰胺整体柱的HILIC-MS方法直接分析完整的西妥昔单抗。结果显示，该方法可分辨多达九个糖型洗脱区域，但质谱谱图复杂，难以清晰归属所有观察到的蛋白质变体。有趣的是，在13-15分钟处观察到的洗脱区域，其质量数（约148,000 Da）比主异构体（约152,500 Da）轻约4000 Da，对应于两个Fab糖链的质量。这提示该方法可能检测到了此前未被充分关注的、仅含Fc糖基化的位点占有变体。后续的洗脱区域中发现了高亲水性的单电荷物质，推测可能是样品中存在的少量游离糖链或在酸性高有机相流动相中从完整蛋白上柱上水解释放的N-糖链。
利用SCX-UV分离和收集电荷变体组分
为了分解质谱的复杂性，研究者使用浅盐梯度的SCX-UV方法分离西妥昔单抗的电荷变体。色谱图显示，主异构体约占26.4%，酸性和碱性变体分别约占37.0%和36.6%。基于此分离，研究人员自动收集了五个组分：酸性变体（A1, A2）、主成分（M）和碱性变体（B1, B2）。酸性变体主要源于Fab糖的唾液酸化，而碱性变体则通常与Fc结构域中不完全的C末端赖氨酸截断有关。
西妥昔单抗SCX组分的HILIC-MS分析
这是本工作的核心创新。通过优化RPLC捕集柱的洗涤体积（增至40 μL）和样品进样体积（增至20 μL），成功解决了IEC高盐组分与HILIC-MS的兼容性问题，并在不损失分离效率的前提下显著提高了对低浓度电荷变体组分的检测灵敏度。所有SCX组分的HILIC-MS洗脱图谱在糖型分离谱上基本对齐，证实了IEC（基于电荷）和HILIC（基于糖链亲水性）两个维度的正交性。
通过HILIC-MS表征糖型和电荷变体
对组分化的样品进行HILIC-MS分析，糖型分辨率显著提高，在M组分中可色谱区分多达15个糖型峰，而直接进样仅观察到9个。去卷积质谱图揭示了三个对应于不同糖基化复杂程度的HILIC洗脱窗口：
- 1.
Fc-only糖型（约12分钟）：质量数与理论计算的仅含Fc糖基化的西妥昔单抗（如G0/G0F, G0F/G0F）匹配，表明缺乏Fab糖链。
- 2.
中性和单唾液酸化糖型（19-21分钟，紫色区域）：以中性糖型（如结合了中性Fab糖的G0F/G1F）和单唾液酸化物质为主。
- 3.
高度唾液酸化糖型（22-24分钟，黄色区域）：富含N-羟乙酰神经氨酸（Neu5Gc）的高质量物质。Neu5Gc带来的强亲水性使其在该酰胺固定相上保留最强。
对比不同组分的质谱图发现，酸A1和A2组分中富含唾液酸化（特别是含Neu5Gc）的糖型，证实了其酸性源于Fab区域的唾液酸化。而碱性B1和B2组分的糖谱与主成分相似，但存在系统性质量偏移：B2组分最丰富的峰比主异构体重256 Da，对应于两个C末端赖氨酸残基（2 × Lys）的存在。+128 Da（一个赖氨酸）和+16 Da（甲硫氨酸氧化）的偏移也被观察到。与文献相比，本研究数据中观察到丰度更高的低糖基化形式（如G0F/G0F和G0F/G1F），这可能源于IEC分离时的不完全分馏以及IEC-MS与HILIC-MS在电离效率上的差异。
结论与意义
本研究扩展了基于丙烯酰胺的整体固定相在多维分离和结构表征中的应用，成功解析了拥有四个N-糖基化位点的西妥昔单抗的复杂性。所开发的离线IEC-HILIC-HRMS正交工作流程，通过SCX分离电荷变体组分，再经RPLC捕集柱接口转移至HILIC-MS进行深入糖型分析，巧妙地克服了溶剂不兼容的难题。
该方法的成功之处在于，它不仅实现了比单独使用HILIC-MS更高的糖型分辨率，深入揭示了电荷异质性与糖型分布之间的关联，甚至能够将仅含Fc糖型的变体与主异构体区分开来。这种正交分离策略为同时获取电荷和糖基化异质性信息提供了互补视角，从而能对西妥昔单抗等复杂治疗性蛋白进行更完整的结构解读。
这项工作为深入表征下一代蛋白治疗药物（如Fc融合蛋白、抗体药物偶联物等）的电荷与糖型异质性提供了一种高效的分析蓝图。在生物药越来越复杂、质量属性叠加的今天，此类能“同时看清”多种关键修饰的高分辨、多维分析方法，对于确保药物的批间一致性、优化生产工艺、评估生物类似药的相似性以及深入理解结构与功能关系，都具有至关重要的科学与实际意义。
