《ANALYTICAL AND BIOANALYTICAL CHEMISTRY》：A hierarchical lectin-based multimodal workflow for spatial mapping of extracellular matrix glycans in fibrotic hearts
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为解决心脏纤维化中细胞外基质(ECM)聚糖空间重塑难以解析的问题，研究人员建立了一种整合凝集素微阵列(LMA)组织糖组图谱、凝集素组织化学染色和低真空扫描电子显微镜(LVSEM)的多模式空间糖组学工作流程。该工作流程成功绘制了高血压心力衰竭大鼠心脏纤维化区域N-糖和O-糖的分布，发现WFA反应性去唾液酸N-糖和MAH反应性唾液酸化O-糖在纤维化ECM中具有不同的空间分区。这为研究纤维化等ECM丰富组织的空间糖组学建立了新的分析框架。
心脏是人体的“发动机”，其健康运转离不开精细的结构支撑。心脏纤维化，即心肌组织中细胞外基质(ECM)过度沉积，是高血压心力衰竭等心血管疾病的典型病理特征。ECM并非惰性的“脚手架”，其复杂的分子构成，尤其是其上的聚糖（糖链）修饰，在细胞信号传导、组织结构和疾病发生发展中扮演着关键角色。然而，在纤维化进程中，ECM中的聚糖是如何在空间上被重塑的，一直是科研人员难以看清的“黑箱”。传统的基于核酸的空间组学技术对富含ECM、细胞稀少的纤维化区域“束手无策”，而聚糖结构也无法从转录组数据直接预测。因此，开发能够整合分子检测、空间定位和结构信息的分析策略，对于理解心脏纤维化的分子机制至关重要。
为了破解这一难题，一项题为“A hierarchical lectin-based multimodal workflow for spatial mapping of extracellular matrix glycans in fibrotic hearts”的研究在《ANALYTICAL AND BIOANALYTICAL CHEMISTRY》上发表。该研究建立了一套创新的、基于凝集素（一种能特异性结合特定糖链结构的蛋白质）的多模式层级化空间糖组学工作流程，如同为研究者配备了一套“糖链定位追踪系统”，首次在纤维化心脏组织中实现了对ECM聚糖的高分辨率空间映射。
研究人员开展这项研究，主要运用了几个关键技术方法：首先，他们使用了激光显微切割(LMD)辅助的凝集素微阵列(LMA)技术，对高血压心力衰竭模型大鼠（高盐饮食组）和对照大鼠（低盐饮食组）心脏的特定区域（特别是WFA阳性的纤维化区域）进行组织糖组图谱分析。其次，通过凝集素组织化学染色（单染和共染）和糖苷酶预处理，验证了关键凝集素信号的特性和空间定位。最后，他们创新性地将凝集素荧光组织化学与低真空扫描电子显微镜(LVSEM)成像结合在同一张组织切片上，实现了聚糖信号在ECM超微结构中的可视化验证。
WS1: 通过组织糖组图谱检测高血压心力衰竭纤维化和非纤维化区域的糖组信号
研究人员首先确认紫藤凝集素(WFA)可以作为高血压心力衰竭模型中心脏纤维化的标记物，并以此为指导，利用LMD从WFA阳性的纤维化区域和阴性区域精确采集微量组织。通过对45种凝集素的LMA分析，他们发现高盐组大鼠心脏中，多种O-糖结合凝集素信号显著升高，其中Maackia amurensis血凝素(MAH)对唾液酸化O-糖的反应信号增加最为显著。这提示在高血压心力衰竭的纤维化区域，WFA反应性的去唾液酸N-糖和MAH反应性的唾液酸化O-糖均有所增加。
WS2: 通过凝集素组织化学验证纤维化相关聚糖信号的空间定位
为了验证LMA的发现，研究人员对组织切片进行了WFA和MAH的染色。结果显示，WFA信号更特异地定位于纤维化区域，而MAH信号则广泛分布，但在纤维化区域尤其密集，两者仅部分重叠。通过糖苷酶预处理实验证实，WFA染色主要依赖于N-糖，而MAH染色则依赖于唾液酸化O-糖，从生化角度确认了这两种凝集素信号的特异性。
WS3: 通过单切片凝集素荧光组织化学结合LVSEM进行超微结构验证
为了在更高分辨率下观察WFA和MAH信号在纤维化ECM中的空间关系，研究人员将荧光染色后的同一张切片进行了LVSEM成像。高分辨率图像显示，WFA表位主要出现在间质区域，而MAH染色则在心肌细胞和细胞外区域均有观察。这种单切片多模态成像技术，首次在超微结构水平上可视化了纤维化ECM中不同聚糖的空间分区模式。
评估携带纤维化相关聚糖的候选糖蛋白
为了探究这些聚糖信号可能来源于哪些蛋白质，研究人员将WFA和MAH与候选的ECM糖蛋白进行了共染色。他们发现，已知的纤维化相关糖蛋白骨膜蛋白(POSTN)和胶原VI α6链(COL6A6)与WFA信号存在部分空间共定位。对于MAH，基于RNA-seq数据筛选出的候选蛋白——软骨中间层蛋白1(CILP)和血小板反应蛋白4(THBS4)——在细胞外区域与MAH信号存在共分布，尤其是在MAH密集的纤维化区域。这提示，观察到的凝集素信号可能反映了多种ECM糖蛋白的丰度增加和/或其糖基化模式的改变。
研究结论与讨论
本研究成功建立并验证了一个层级化的、基于凝集素的空间糖组学工作流程。该工作流程无缝整合了糖组信号检测(LMD-LMA)、空间定位（凝集素组织化学）和超微结构验证（LVSEM）三个步骤。应用该流程，研究人员在高血压心力衰竭大鼠模型的心脏纤维化组织中，绘制了WFA反应性（去唾液酸N-糖）和MAH反应性（唾液酸化O-糖）的差异化空间分布图谱。研究表明，WFA和MAH可作为检测心脏纤维化相关聚糖模式的有效组织化学探针。更重要的是，这项研究的意义远超出这两个具体发现。它为研究纤维化等富含ECM、细胞稀少的组织中的空间糖组重塑提供了一个全新的、强大的分析框架。这套方法弥补了传统核酸空间组学技术的不足，使得在复杂的组织微环境中解析具有重要生物学功能的聚糖空间信息成为可能，有望推动对心脏纤维化及其他纤维化疾病病理机制的更深入理解，并为相关生物标志物的发现和靶向治疗策略的开发提供新的思路。
