毛茛属植物（Clitoria ternatea L.）的提取物：在莴苣（Lactuca sativa L.）中的植物化学成分及化感作用 作者：金伯利·洛佩兹·塞德尼奥（Kimberly López Cede?o）、胡安·安东尼奥·托雷斯-罗德里格斯（Juan Antonio Torres-Rodriguez）、胡安·何塞·雷耶斯·佩雷斯（Juan José Reyes Pérez）、丹娜·卡斯蒂略（Danna Castillo）、亚历克斯·莱奥内尔·卡尼亚尔·里瓦斯（Alex Leonel Ca?ar Rivas）、豪尔赫·阿尔贝托·阿莱汉德罗·罗萨斯（Jorge Alberto Alejandre Rosas）、亚历杭德拉·阿尔瓦拉多·马维尔（Alejandra Alvarado Mávil）和赫拉尔多·萨帕塔-西富恩特斯（Gerardo Zapata-Sifuentes）

《Sci》：Extracts of Clitoria ternatea L.: Phytochemical Profile and Allelopathic Activity in Lactuca sativa L. Kimberly López Cede?o, Juan Antonio Torres-Rodriguez, Juan José Reyes Pérez, Danna Castillo, Alex Leonel Ca?ar Rivas, Jorge Alberto Alejandre Rosas, Alejandra Alvarado Mávil and Gerardo Zapata-Sifuentes

　　摘要：从化感作用开发基于植物的杂草管理工具需要证明植物毒性在化学上得到支持，并且在生物学上能够重复。本研究调查了Clitoria ternatea L.的化感活性在叶子、茎以及叶茎混合物之间是否存在差异，以及这种差异是否与器官特异性的化学特性有关。通过组织化学、植物化学和薄层色谱分析对水乙醇提取物进行了表征，并在75、150和300 mg L?1的浓度下对Lactuca sativa L.进行了体外测试。所有样品中均含酚类/单宁、黄酮类和三萜类/甾醇；然而，叶提取物显示出最强的香豆素信号、皂苷的存在以及最丰富的TLC图案。这些化学差异与明显的生物梯度相匹配，抑制活性依次为叶子 > 叶茎混合物 > 茎。在300 mg L?1的浓度下，叶提取物使发芽率降到了71%，根长降低到10.23毫米，活力指数降到1372，同时使平均发芽时间延长至5.78天，并产生了最低的化感反应指数（?0.663）。总体而言，研究结果确定叶子是C. ternatea中植物毒性代谢物的主要储存库，支持其在植物基杂草管理研究中的潜在应用。

1. 引言
在可持续农业中，寻找基于植物的合成除草剂替代品变得越来越重要。传统除草剂的密集和长期使用导致了抗性杂草种群的出现、环境问题以及日益严格的法规限制[1,2,3]。在这种情况下，植物来源的化合物作为杂草管理和植物生长调节的生物活性分子来源引起了人们的关注。化感作用是指一种植物通过释放次级代谢物对另一种植物产生的刺激或抑制效应，这是开发此类产品的最有前景的生物学途径之一[4,5,6]。然而，化感作用的实用价值不仅仅取决于在植物组织中检测到代谢物。为了支持农艺应用，必须在受控条件下证明植物毒性效应，并将其与可重复的化学证据联系起来[7,8]。这一点尤为重要，因为化感反应往往是剂量依赖的，并且可能因用于提取的植物器官而异[9,10,11]。Clitoria ternatea L.是一种因其农艺多样性、生态适应性和丰富的次级代谢物而被广泛认可的豆科植物[12,13]。它被用作覆盖作物、饲料作物和改良土壤的植物，并且也被报道为多种生物活性化合物的来源[12,13,14]。然而，这些代谢物的存在并不一定意味着具有生物活性，它们在叶子和茎之间的分布可能影响提取物的化学组成及其对目标物种的影响[9,10,11]。化感化学物质可以在发芽和幼苗早期建立期间干扰基本的生理过程，包括氧化还原平衡、膜完整性、呼吸作用和储备物质的动员[15,16]。在体外条件下，这些效应通常反映在发芽率、发芽速度、平均发芽时间和幼苗伸长上，这些都是植物毒性的敏感指标[17,18,19]。由于这些响应可能与剂量非线性相关，因此需要评估浓度梯度以区分抑制效应和潜在的刺激效应[20,21]。在化感生物测定中，Lactuca sativa L.常被用作模式物种，因为它具有均匀的发芽率和对外来化合物的高敏感性[18,19,20,21,22,23,24]。生菜的反应提供了植物毒性的有用初步指标，但当结合测试提取物的化学特性进行分析时，其解释更为准确[7,8]。因此，植物化学表征对于理解C. ternatea的化感潜力至关重要。诸如酚类化合物、黄酮类、香豆素、皂苷、萜类和甾醇等代谢物组已被发现与不同植物系统的发芽和早期生长抑制或促进效应有关[25,26,27,28,29]。尽管人们对基于植物的生物投入越来越感兴趣，但许多化感研究仍然提供关于器官特异性变异的信息有限、剂量范围定义不足或仅进行了部分的化学表征，这限制了研究之间的可重复性和比较性。因此，本研究旨在表征C. ternatea的叶子、茎和叶茎混合物提取物的组织化学、植物化学和色谱特征，并评估它们在体外条件下对L. sativa的化感活性。从基础角度出发，本研究旨在确定C. ternatea的化感活性是否依赖于器官，并考察生物活性的差异是否由提取物化学特性的差异所支持。从应用角度出发，本研究旨在识别具有最大植物毒性潜力的提取物组分，为未来基于植物的杂草管理研究提供基础。

2. 材料与方法
2.1. 植物材料的收集与处理
Clitoria ternatea L.的植物材料（叶子和茎）是在Cotopaxi技术大学La Maná分校的Sachawiwa实验中心的牧草和饲料花园（Jardín de Pastos y Forrajes del Centro Experimental Sachawiwa）收集的。该地点位于Guasaganda教区（海拔500米），平均气温为22°C，年降水量为2761毫米，平均相对湿度为88%。收集工作于2024年2月上午8:00至10:00之间进行，所选植物已经生长了60天并且处于开花结果阶段。通过随机抽样选取了20株植物，从中取出了包含叶子和茎的样品。衰老组织或受损组织被丢弃。

对于组织学分析，新鲜材料（叶子和茎）的一部分用 FAA 溶液（70%乙醇、冰醋酸和37–40%甲醛，比例为90:5:5, v/v/v）固定24小时。同时，为了进行植物化学分析和生物测定，分别取了100克新鲜叶子和茎材料的三份样品（使用Pioneer?分析天平，OHAUS Corporation，Parsippany, NJ，容量520克；±0.1毫克）。样品用流水冲洗，用1%次氯酸钠消毒，然后用蒸馏水冲洗。之后在Memmert?干燥箱（Memmert GmbH + Co. KG，Schwabach, Germany）中在35°C下脱水至恒定质量。最终重量在同一分析天平上记录下来。干燥后的材料在配备2毫米筛网的Arthur Thomas?研磨机（Arthur H. Thomas Co., Philadelphia, PA, USA）中粉碎。研磨过程中 continuously 防止材料温度超过40°C。得到的粉末储存在琥珀色瓶中，置于25 ± 2°C下避光保存，直到后续分析使用。

2.2. 提取物的制备
从干燥并粉碎的C. ternatea植物材料（叶子、茎和1:1叶茎混合物）中制备了20%（m/v）的粗提物，即每1升溶剂使用200克植物粉末（固液比1:5）。提取是在避光的玻璃容器中，用70%（v/v）水乙醇混合液在室温下浸渍48小时，并定期手动搅拌以促进代谢物的扩散。浸渍后，提取物通过Whatman? 41级滤纸（Cytiva, Marlborough, MA, USA，直径125毫米，截留范围约20–25 μm）进行过滤。过滤后的液体制存于琥珀色瓶中，并在Indurama?冰箱（Indurama ERT25G2HUG, Indurama, Cuenca, Ecuador）中冷藏（2–5°C）直至使用。为了确保不同提取物之间的可比性以及分析与生物学测定之间的可比性，粗滤液随后在减压条件下浓缩以获得干提取物（总固体）。然后通过将干提取物重新溶解在每个测试所需的溶剂中来制备工作溶液（植物化学筛选/TLC或生物测定）。

2.3. 微形态学和组织化学表征
为了对C. ternatea进行微形态学表征，使用了之前用 FAA 溶液（70%乙醇：冰醋酸：甲醛 37–40%；90:5:5, v/v/v）固定的叶子和茎。从固定材料中，通过从叶片上剥离/刮取表皮碎片获得叶子上表面（向轴）和下表面（背轴）的表皮切片。此外，还对干燥和粉碎的叶材料进行了诊断元素的鉴定（表皮碎片、气孔复合体、毛状体和晶体）。所有切片都制成甘油：蒸馏水（1:1, v/v）的临时载玻片。观察使用奥林巴斯显微镜（Olympus Corporation, Hachioji, Tokyo, Japan），配备10×物镜和10×及40×透镜（总放大倍数为100倍和400倍），并用连接的Canon相机（8 MP）记录显微照片。为了验证特征的一致性，每种器官（叶子和茎）和每种制备类型（表皮切片和粉碎材料）制备了三个独立的切片。对粉碎材料进行了组织化学测试：用Lugol碘液检测淀粉（蓝黑色表示阳性反应），用三氯化铁（FeCl3）检测酚类化合物和/或单宁（深绿色-黑色表示阳性反应）。记录了观察到的结构中的颜色变化。

2.4. 植物化学谱型
使用植物化学筛选方法对C. ternatea提取物（叶子、茎和1:1叶茎混合物）中主要次级代谢物家族进行了定性鉴定，包括树脂、皂苷、三萜类/甾醇、香豆素、生物碱、醌类、还原糖、游离氨基酸、酚类化合物/单宁和黄酮类[30]。为了确保不同样品之间的可比性，测试是在70%乙醇（v/v）中重新溶解的干提取物（总固体）上进行的。每次测定重复三次，并包括一个阴性对照，即不含提取物的溶剂。反应强度以半定量方式记录。“?”表示未检测到，“+”表示弱，“+++”表示强，根据颜色的强度和/或沉淀物的形成情况确定[31]。

2.4.1. 树脂的检测
使用酒精浊度测试进行了树脂的定性检测。在单独的试管中，将2毫升乙醇提取物溶液与2毫升蒸馏水混合，剧烈摇晃后静置2分钟。作为阴性对照，将2毫升乙醇提取物溶液与相同体积的溶剂（70% v/v乙醇）混合在另一个试管中，在相同条件下进行。当提取物-水混合物的浊度和/或沉淀明显大于提取物-乙醇对照组时，认为反应为阳性。每种提取物重复三次进行测定[32]。

2.4.2. 皂苷的检测
使用泡沫测试评估了皂苷的定性存在。将提取物的酒精溶液 aliquot 放入试管中，并用蒸馏水稀释至体积增加五倍。混合物剧烈摇晃5–10分钟后静置。当液体表面形成稳定泡沫且持续超过2分钟时，认为反应为阳性[33]。

2.4.3. 三萜类和甾醇的检测
使用Liebermann–Burchard测试进行了三萜类和/或甾醇的定性检测。将提取物溶液 aliquot 在水浴中蒸发至干燥，然后将残留物重新溶解在1毫升氯仿（CHCl3）中。随后加入1毫升乙酸酐并混合均匀。然后小心地从试管侧面加入2–3滴浓硫酸（H2SO4），避免搅拌。当观察到快速的颜色变化（粉红色-蓝色、深绿色或某些情况下甚至黑色）时，认为反应为阳性，表明存在三萜类和/或甾醇[34]。

2.4.4. 香豆素的检测
使用Baljet反应进行了香豆素的定性检测。将提取物溶液 aliquot 在水浴中蒸发至干燥，然后将残留物重新溶解在1毫升乙醇中。随后加入1毫升Baljet试剂并轻轻混合。当观察到红色-橙色或红色沉淀时，认为反应为阳性，与溶剂的白色相比。

2.4.5. 生物碱的检测
使用三种经典筛选试剂（Dragendorff、Mayer和Wagner）对提取物（叶子、茎和叶茎混合物）中的生物碱进行了定性检测。对于每种测试，取1毫升提取物溶液并用1% HCl酸化以促进生物碱碱基的质子化。接着加入3滴相应的试剂，轻轻混合后与白色溶剂进行比较以记录反应。反应的强度被半定量地评定为：+（轻微的乳光）、++（明显的浑浊）和+++（明显的沉淀）。所有的测定均重复进行三次[35]。

**Dragendorff试验**：在将提取物的等分液酸化后，加入3滴Dragendorff试剂。如果出现乳光/浑浊现象或形成橙红色至砖红色的沉淀，则结果为阳性，表明含有生物碱。

**Mayer试验**：向先前酸化的提取物等分液中加入少量NaCl，随后再加入3滴Mayer试剂。生物碱的存在通过乳光（+）、浑浊（++）或絮状沉淀（+++）来判定，沉淀通常呈奶油色、白色或黄白色。

**Wagner试验**：向酸化的提取物等分液中加入3滴Wagner试剂。如果出现明显的浑浊和/或沉淀（++或+++），则结果为阳性。由于可能存在干扰，轻微的乳光反应（+）需要通过三种试验结果的一致性来确认。

**2.4.6. 醌类的检测**
醌类（萘醌和/或蒽醌）的定性检测采用Borntr?ger试验进行。将提取物的等分液在水浴中蒸发至干涸，然后将残渣重新溶解在1 mL氯仿（CHCl3）中。接着加入1 mL 5%（w/v）NaOH并剧烈搅拌以促进分离。当水性碱性相呈现粉红色至红色时，反应结果为阳性。粉红色表示有少量醌类存在，而深红色则表示有大量醌类存在，这与溶剂的白色形成对比[36]。

**2.4.7. 还原糖的检测**
还原糖的定性检测使用Fehling试验。将提取物的等分液在水浴中蒸发至干涸，然后将残渣重新溶解在2 mL蒸馏水中。随后加入2 mL Fehling试剂（Fehling I和II按等比例混合），并在水浴中加热30分钟。如果形成砖红色沉淀和/或出现红色，则反应结果为阳性，这与溶剂的白色形成对比[37]。

**2.4.8. 游离氨基酸的检测**
游离氨基酸和/或胺的定性检测采用 ninhydrin 测定法。将酒精提取液的等分液蒸发至干涸，然后将残渣重新溶解在2 mL 0.2%（w/v）ninhydrin中，同时在水浴中加热5–10分钟，随后冷却至室温。如果出现蓝紫色，则反应结果为阳性，这与溶剂的白色形成对比[38]。

**2.4.9. 酚类化合物的检测**
酚类化合物和/或单宁的定性检测使用三氯化铁测定法。向提取物等分液中加入醋酸钠以调整溶液性质，然后加入3滴5%（w/v）FeCl3并轻轻搅拌。根据颜色变化来判定反应结果：酚类一般为酒红色，焦性儿茶酚型单宁为深绿色，可水解的单宁为蓝色，这与溶剂的白色形成对比[37,39]。

**2.4.10. 黄酮类的检测**
黄酮类的定性检测使用Shinoda试验进行。将提取物的等分液（2 mL）在水浴中蒸发至干涸，然后将残渣重新溶解在2 mL乙醇中。随后加入少量金属镁，再缓慢加入1 mL浓HCl（从试管侧面加入），让混合物反应2–5分钟。如果淀粉相呈现粉红色至红色，则反应结果为阳性，这与溶剂的白色形成对比[40]。

**2.5. 色谱分析**
采用薄层色谱法（TLC）来补充植物化学成分的筛选，并进一步了解C. ternatea提取物（叶片、茎部及叶片+茎部混合物）中代谢物的分离情况[41]。分离使用预涂有硅胶60 F254（Merck, Darmstadt, Germany）的铝板作为固定相，层厚为0.2 mm[42]。商业色谱板（20 × 20 cm）裁剪成5 × 3 cm大小。样品通过玻璃毛细管施用于距板下边缘1.0 cm处。每次施加样品之间保持1.0 cm的间距，每侧边缘留出0.5 cm的空白区。色谱分离在色谱室中进行，使用不同的洗脱系统（见表1）。分离完成后立即标记溶剂前沿，然后将板在室温下晾干[43]。选择最佳分辨率和斑点分布的洗脱系统进行最终对比分析[2.6]。

**2.6. 在Lactuca sativa L.中的体外生物测定**
用于评估Clitoria ternatea L.提取物的剂量-反应效应。

**2.6.1. 干提取物的制备及工作液的配制**
C. ternatea的粗提物（乙醇提取物，体积分数70%）通过浸渍法获得（浓度20% m/v；200 g/L；时间48小时；室温），然后用Whatman? 41级滤纸（Cytiva, Marlborough, MA, USA）过滤。在旋转蒸发器（Laborota 4000, Heidolph Instruments, Schwabach, Germany）中减压蒸发溶剂以获得干提取物（总固体）。蒸发过程使用恒温浴（TE-2005, Tecnal, Piracicaba, SP, Brazil）和水循环装置（TE-186/1, Tecnal, Piracicaba, SP, Brazil），操作条件为40 °C和200 mbar，每次处理约30分钟，直至得到无可见液体的干残留物。干提取物储存在密封的琥珀色瓶中，置于4 °C下保存，避免光照。

**2.6.2. 实验设计及处理**
生物测定采用3 × 3因子设计，包括两个因素：（A）植物提取物类型（A1：叶片；A2：茎部；A3：叶片+茎部）和（B）提取物浓度（B1：75 mg/L；B2：150 mg/L；B3：300 mg/L），共生成九种组合（A × B）。此外还包括一个对照组（C0），即空白组（无菌蒸馏水）。每种处理重复10次；一个培养皿构成一个实验单元[2]。

**2.6.3. 生物测定装置与培养条件**
Lactuca sativa种子在实验前进行表面消毒：先用70%乙醇浸泡30秒，然后用1.0%次氯酸钠处理2分钟，最后用无菌蒸馏水冲洗（三次）。实验在无菌条件下进行（使用 laminar flow hood、无菌培养皿和无菌镊子）。直径115 mm的培养皿内铺上两张无菌滤纸并标记处理组别。每个培养皿加入5毫升相应处理液，确保滤纸均匀湿润但无液体积聚。每个培养皿放置10粒种子（每种处理10个培养皿，共100粒种子）。培养皿置于黑暗环境中24小时，然后在25 ± 2 °C下进行光照/黑暗周期为12小时的培养。为减少蒸发和稀释，培养皿用Parafilm? M（Amcor, Neenah, WI, USA）密封，每天检查湿度。必要时补充少量（0.2–0.5 mL）相同处理液或对照组溶液。

**2.6.4. 变量评估**
发芽情况每日监测7天。记录每个培养皿（实验单元）中的发芽种子数量。当观察到可见的根尖出现时，认为种子已发芽（≥2 mm）。实验结束后（第7天），量化发芽率和初始生长指标[44]。

- **发芽率（GP, %）**：以实验结束时发芽种子数量占培养皿总种子数量的百分比计算[45]。
- **相对发芽率（RGP, %）**：以处理组的发芽率与对照组发芽率的比值计算[46]。
- **活力指数（VI）**：结合发芽率和幼苗生长情况综合评估早期活力[47]。
- **根长（RL, mm）**：第7天用卡尺（Mitutoyo Corporation, Kawasaki, Kanagawa, Japan，精度±0.02 mm）测量发芽幼苗的根长。根长为从根尖到根端之间的距离，按每个培养皿的平均值计算[48]。
- **下胚轴长（HL, mm）**：实验结束时（第7天），从每个培养皿中选取发芽幼苗，用卡尺测量下胚轴长度[6]。
- **平均发芽时间（MGT, 天）**：根据每天发芽的种子数量计算发芽所需的平均时间[6]。
- **发芽速度指数（GSI, Maguire）**：考虑早期发芽情况，对发芽速度进行加权评估[49]。GSI = ∑(Gi/ti)，其中Gi表示在第ti天逐渐萌发的种子数量（Gi = ni），ti表示从生物测定开始以来的时间（天数）。化感反应指数（RI）：该指数用于以无量纲形式整合提取物对发芽率与对照组相比的净效应，其计算方法遵循Williamson和Richardson [50]的研究方法。RI根据以下阶段进行估算：如果S ≥ C，则RI = 1 ? (C/S)；如果S < C，则RI = (S/C) ? 1，其中C代表对照组（无菌蒸馏水）的GSI值，S代表处理组（提取物×浓度）的GSI值。RI值大于0表示促进作用（发芽率高于对照组），而RI值小于0表示抑制作用（发芽率低于对照组）。绝对值|RI|被解释为化感作用强度的估计指标。具体来说，|RI|越大，化感作用越强。

2.7 统计分析
统计分析使用R（v4.4.2）中的stats、emmeans、glmmTMB和DHARMa软件包进行，显著性水平α = 0.05。评估了3 × 3因子设计（矩阵：叶片、茎和叶片+茎；浓度：75、150和300 mg L?1），模型中包含了矩阵、浓度及其交互作用（matrix × concentration）的固定效应。对照组（溶剂）未包含在因子设计中，而是作为计划中的处理组与对照组比较的外部参考。生长参数GP使用带有logit链接的二项广义线性模型进行分析，响应变量定义为cbind(y, n ? y)。正向连续生长变量（HL和RL，单位mm）以及动态指标MGT和GSI使用带有log链接的Gamma GLMs进行分析，并报告了95%置信区间。对于RI的分析仅限于因子处理组，排除了对照组。RI的建模使用了带有logit链接的beta回归，并在调整后避免了边界值。固定效应的显著性通过全局模型检验（包括适用时的LR χ2检验）进行评估，当交互作用显著时也估计了简单效应。使用Tukey的调整方法对估计的边际均值进行了多重比较（图中的字母表示）。处理组与对照组之间的对比使用了Holm的方法进行多重性调整（图中的星号表示：* p < 0.05，** p < 0.01，*** p < 0.001）。

3. 结果
3.1 微形态学和组织化学特征
从宏观上看，C. ternatea具有互生、奇数小叶的复叶，小叶对生。叶片表面有毛，两面颜色对比明显，上表面（腹面）为深绿色，下表面（背面）为浅绿色（图1A,B）。茎较细，半木质化，表面也可见毛（图1C）。在组织水平上，发现了与叶脉相关的棱纹区域、叶脉间区域以及与气孔一致的椭圆形结构（图2A,B）。从侧视图中看，C. ternatea的叶片表皮细胞呈波浪状轮廓（图2D,E）。背面表皮上的气孔比腹面表皮更多，表明这是一个典型的下位气孔模式。两面都观察到了并胞和非并胞气孔（图2C–F）。在叶片表皮中观察到不同长度的非腺毛，尤其在叶脉相关区域更为丰富（图3A）。区分出两种毛状体类型：(i) 顶端细胞弯曲且细胞壁光滑的毛状体；(ii) 顶端细胞直且细胞壁粗糙的毛状体（图3B）。
在干燥并磨成粉末的叶片材料中，发现了与该器官特征一致的微形态学元素。观察到具有波浪状细胞轮廓的表皮片段以及孤立的气孔结构（图4B,C）。还识别出了与叶脉相关的层状组织片段，其中可见维管组织。然而，由于材料的粉末状性质，内部解剖结构不明显（图4B）。此外，在整个样品中散布着棱柱状的草酸钙晶体（图4D），非腺毛以完整或部分片段的形式存在。在某些情况下，外壁呈现出粗糙或疣状的表面特征（图4E,F）。
在干燥并磨成粉末的C. ternatea叶片材料进行的组织化学测试中，Lugol碘染色显示出淀粉的存在，表现为深蓝黑色的颗粒，主要呈棱柱状或角状。与三氯化铁（FeCl3）的反应在组织片段中产生了深绿黑色的着色，这可能与酚类化合物和/或单宁的存在有关（图5B）。这些反应模式支持了分析材料中储备物质（淀粉）和结构酚类代谢物的差异性分布。

3.2 定性植物化学成分分析
定性植物化学筛查显示，不同植物器官提取物中的次级代谢物具有广泛的共同特征，但存在显著差异（表4）。在任何评估的提取物中均未检测到树脂、醌类、游离氨基酸/胺类。相比之下，三萜类/固醇、还原糖、酚类化合物和/或单宁以及黄酮类在所有三种提取物中均有检出。表4显示了C. ternatea提取物（叶片、茎和1:1叶片+茎混合物）的定性植物化学成分。皂苷和香豆素的模式存在差异：皂苷在叶片和叶片+茎提取物中被检测到，但在茎提取物中未检出。香豆素在叶片提取物中的反应最强（+++），而茎和叶片+茎提取物中的反应强度为中等（++）。假设的生物碱测试（Dragendorff、Mayer和Wagner）在所有提取物中均为阳性，尽管反应强度因试剂而异。叶片提取物显示出最强烈的定性植物化学特征，特别是因为其较强的香豆素信号和皂苷的存在。茎提取物保留了酚类化合物/单宁、黄酮类、三萜类/固醇和还原糖的共同特征，但缺乏皂苷，且生物碱和香豆素的信号较弱。叶片+茎混合物显示出介于两种单独器官之间的特征（表4）。

3.3 色谱分析
薄层色谱（TLC）用于补充植物化学筛查（表4），并定性比较C. ternatea的叶片（L）、茎（S）和叶片+茎（L + S）提取物。在评估的溶剂系统（表1）中，Tol:AcOEt:Ac2O（1:0.5:0.1, v/v/v）提供了最佳的带分离度和斑点清晰度，因此被选用于比较分析（图6）。在可见光下（图6A），L和L + S提取物显示出两个主要斑点，保留因子（Rf）值分别为约0.50和0.83。而在365 nm的紫外光下（图6B），所有提取物在相同的Rf区域都观察到荧光带，尽管在L和L + S中的荧光带更为明显。此外，叶片提取物在较低的Rf区域（约0.25–0.40）显示出额外的弱带，在茎提取物中则不清晰。TLC谱显示出提取物之间的质量差异，叶片提取物的色谱模式更为复杂和强烈，而叶片+茎混合物的色谱模式介于两者之间（图6）。

3.4 C. ternatea提取物对Lactuca sativa L. 发芽和初期生长的影响
L. sativa的表现取决于提取物类型和浓度，总体上呈现叶片>叶片+茎>茎的抑制梯度（图7）。总体而言，叶片提取物对发芽率和幼苗生长的抑制作用最强，茎提取物的效果最弱，叶片+茎混合物则表现出中等程度的抑制作用。图7显示了提取物类型（叶片、茎和叶片+茎）和浓度（75、150和300 mg L?1）对发芽率和幼苗生长的影响。（A）发芽百分比（GP，%）；（B）相对发芽百分比（RGP，%）；（C）下胚轴长度（HL，mm）；（D）根长度（RL，mm）；（E）活力指数（VI）；（F）平均发芽时间（MGT；天）；（G）发芽速度指数（GSI）；（H）化感反应指数（RI）。符号代表从拟合模型中得到的估计边际均值，条形表示95%置信区间（CI）。对照组（水；0 mg L?1）作为参考。字母（a–c）表示每种浓度下各提取物之间的显著差异（p < 0.05），通过因子模型（matrix × concentration）和多重均值比较（事后分析和Tukey型调整得到）。星号表示与对照组（水）相比的显著差异，使用Holm的多重比较方法进行调整：* p < 0.05；** p < 0.01；*** p < 0.001。在75 mg L?1浓度下，各提取物之间未检测到发芽百分比的差异（叶片85%，叶片+茎87%，茎92%；p ≥ 0.379）。然而，在150和300 mg L?1浓度下，叶片提取物相对于茎提取物降低了发芽百分比（150 mg L?1：77% vs. 94%，p = 0.00424；300 mg L?1：71% vs. 92%，p = 9.47 × 10?4）。与对照组（97%）相比，叶片提取物在75、150和300 mg L?1浓度下分别降低了12.37%、20.62%和26.80%（p = 0.0441、0.00269和3.40 × 10?4）。相比之下，茎提取物在任何浓度下都与对照组无差异，而叶片+茎混合物仅在300 mg L?1时显示出显著降低（81%；?16.49% vs. 对照组；p = 0.0107）（图7A）。正如预期的那样，相对发芽百分比（RGP）与GP模式密切相关（图7B）。茎提取物在任何浓度下都与对照组无差异（p = 0.280–0.312），而叶片+茎混合物在三种浓度下均显示出显著降低（75 mg L?1：?10.31%，p = 0.00516；150 mg L?1：?8.25%，p = 0.0319；300 mg L?1：?16.49%，p = 3.35 × 10?6）。叶片提取物在所有评估的浓度下始终显示出最低的RGP值。幼苗生长比最终发芽更敏感，尤其是根部的发育。子叶长度（HL）显示出剂量依赖性的下降，这种下降在叶提取物中最为明显：300 mg L?1的浓度将子叶长度从对照组的13.83 mm减少到9.12 mm（减少了34.06%；p = 2.60 × 10?15），而75 mg L?1的浓度与对照组（13.71 mm；p = 0.8641）没有显著差异。在茎提取物中，只有300 mg L?1的浓度显著降低了子叶长度（从13.71 mm减少到11.32 mm，减少了18.15%；p = 4.19 × 10?4）（见图7C）。根长（RL）是对这些处理最为敏感的指标：在300 mg L?1的浓度下，叶提取物将根长从25.48 mm减少到10.23 mm（减少了59.85%；p = 1.18 × 10?61），而叶+茎混合物将根长从24.26 mm减少到12.66 mm（减少了50.31%；p = 1.31 × 10?36）。75 mg L?1的浓度下，茎提取物与对照组没有显著差异。在每个浓度下，叶提取物产生的根长始终短于茎提取物，尤其是在300 mg L?1的浓度下（p = 1.96 × 10?26）（见图7D）。综合指数进一步证实了这种抑制作用。活力指数（VI）在叶提取物中显著下降，在300 mg L?1的浓度下降至1372.0，而对照组为3811.9（减少了64.01%；p = 8.06 × 10?90），并且在75 mg L?1到150 mg L?1以及150 mg L?1到300 mg L?1的浓度范围内也出现了显著的逐步下降（p = 2.94 × 10?9和2.32 × 10?15）（见图7E）。平均发芽时间（MGT）则呈现出相反的趋势：在300 mg L?1的浓度下，叶提取物中的平均发芽时间增加到5.7808天，而对照组为3.01天（增加了92.05%；p = 9.87 × 10?60）。75–150 mg L?1的茎提取物与对照组在平均发芽时间上没有差异（p = 1.000），而叶+茎混合物在整个浓度范围内显示出中等程度的增加（p ≤ 1.96 × 10?10）（见图7F）。发芽速度指数（GSI）在300 mg L?1的叶提取物中从4.06降至1.309（减少了67.76%；p < 1 × 10?16），叶+茎混合物也将GSI降至1.845（减少了54.56%；p < 1 × 10?16）。茎提取物的抑制效果最弱，在75–150 mg L?1的浓度下与对照组没有差异，在300 mg L?1的浓度下仅有轻微下降（p = 0.0286）（见图7G）。化感反应指数（RI）也证实了提取物的整体抑制作用：所有处理组的RI值均为负值，其中叶提取物在300 mg L?1的浓度下显示出最强的抑制作用（RI = ?0.6632；p = 6.34 × 10?94），表明其化感强度最高（见图7H）。

通过对主要发芽和幼苗生长变量进行Spearman相关性分析，发现发芽百分比（GP）与早期幼苗生长呈正相关，与子叶长度（HL）和根长（RL）有中等程度的相关性（ρ = 0.48，p_FDR < 0.001）以及与发芽速度指数（GSI）有很强的正相关性（ρ = 0.75，p_FDR < 0.001）。相反，发芽百分比与平均发芽时间（MGT）呈负相关（ρ = ?0.60，p_FDR < 0.001），表明更高的发芽百分比与更快的出苗速度相关（见图8）。主成分分析（PCA）表明，发芽性能和幼苗活力的主要梯度是相反的：PC1代表了发芽性能和幼苗活力的主要方向，其正加载值与更高的发芽率和更快的出苗速度相关；相反，PC1的负加载值与延迟的发芽和较低的幼苗活力相关。此外，叶提取物中酚类化合物、香豆素相关信号和皂苷的富集为生化差异和生物学活性之间的关联提供了合理的机制基础。多变量分析也支持了这一解释，表明提取物的效应主要由快速发芽和幼苗生长与延迟发芽之间的对比驱动。随着PC1负侧浓度的增加，叶处理效果的逐渐变化进一步证明了化感响应不仅依赖于植物器官，还受到剂量的定量影响。从这个意义上说，根长成为检测该系统中植物毒性的最具有信息价值的指标之一。从应用的角度来看，这些结果表明叶片是C. ternatea中植物毒性代谢物的最有可能来源，并支持对其进行进一步研究，以开发用于杂草管理的植物基产品。同时，这项研究还指出器官选择并非简单的提取细节，而是一个具有生物学意义的因素，它会影响植物的化学组成和化感作用。更具体地说，这项工作的主要贡献在于将特定器官的化学特征分析与三种提取物基质下的剂量-响应生物测定相结合，从而加强了对C. ternatee器官依赖性化感作用的理解。然而，目前的发现应仅基于模型物种的体外生物测定和定性化学分析来解释。未来的研究应通过目标化合物的鉴定、在相关杂草物种上的测试以及在土壤、温室和田间条件下的验证来确认这些模式。

5. 结论

C. ternatea的化感作用明显依赖于植物器官和剂量。在所评估的各种提取物中，叶片提取物对L. sativa的萌发和幼苗早期生长具有最强的抑制作用，而茎提取物则表现出最弱的作用，在许多指标上与对照组没有显著差异。在300 mg L?1的浓度下，叶片提取物使平均萌发时间延长至5.78天（对照组为3.01天），萌发速度指数降低约68%，根长减少约60%，活力指数降低约64%。根长是最敏感的指标，这表明幼苗早期生长受到的影响比最终萌发更为明显。叶片提取物导致的更强抑制作用与其更丰富的植物化学成分和色谱特征一致，表明其中含有更多的化感代谢物。这些发现表明，C. ternatea的化感潜力强烈依赖于植物器官和浓度，因此需要进一步对叶片提取物进行化学表征，并在农艺条件下进行验证。不过，要将观察到的效应归因于特定化合物，还需要通过实验手段加以证实。因此，为了提高其适用性和解释能力，未来的研究应使用HPLC-DAD和LC-MS等技术对代谢物进行定量分析和表征，并在田间条件下验证其效果，同时整合剂量-响应模型，以便将实验室结果应用于实际农业场景中。