猪肝酯酶催化的内酯桥联联芳烃的动态动力学拆分：有机共溶剂对对映选择性的影响

《European Journal of Organic Chemistry》：Porcine Liver Esterase‐Catalyzed Dynamic Kinetic Resolution of a Lactone‐Bridged Biaryl: Impact of Organic Cosolvents on Enantioselectivity

　　内哈·迪曼（Neha Dhiman）| 安克·胡梅尔（Anke Hummel）| 金之都介（Kyohei Kanomata）| 沢上良成（Yoshinari Sawama）| 田口彻（Tohru Taniguchi）| 哈拉尔德·格罗格（Harald Gr?ger）| 赤井修二（Shuji Akai）
日本大坂大学药学研究生院，Suita

由于人们对合成对映纯联芳基化合物的兴趣日益增长，我们在本文报告了一种由商业猪肝酯酶（PLE）催化的立体选择性的环开反应，该反应能够将外消旋内酯桥联联芳基化合物转化为联芳基羧酸。这种方法的一个显著特点是，具有低旋转势垒（ΔG?rot?= 21.9 kcal/mol）的底物在30°C下会迅速发生外消旋化，而生成的环开产物则具有构象稳定性（ΔG?rot?=?30.5 kcal/mol）。因此，底物和产物的内在旋转性质使得无需外部外消旋化催化剂即可实现动态动力学拆分。值得注意的是，使用一种与水不溶的有机共溶剂（如环戊基甲基醚）和缓冲溶液作为反应介质，显著提高了PLE催化反应的对映选择性，从而获得了联芳基产物（产率>90%，ee值为65%）。此外，研究发现，在商业销售的粗制PLE中存在的多种同工酶中，内酯的水解主要由PLE-5和PLE-6催化。

**引言**
联芳基化合物在对映异构体药物[1, 2]、生物活性天然化合物[3, 4]、手性配体或有机催化剂[5]以及功能材料[6]中具有重要作用。因此，过去几十年中，联芳基化合物的对映选择性合成一直是不对称催化领域的热门研究课题[7, 8, 9]。在这种情况下，通过对立体不可挠性的桥联联芳基化合物进行立体选择性环开反应（DKR）成为了一种有吸引力的方法[10, 11, 12]，这种方法利用两个芳香环在邻位上的交联来实现两者之间的快速互变和外消旋化。相比之下，在环开产物中，来自桥接部分的相邻取代基之间存在空间排斥作用，限制了绕轴的旋转。因此，这种立体选择性环开反应能够获得构象稳定且对映体富集的联芳基化合物。此外，通过这种高对映选择性的环开反应，理论上可以从外消旋底物中以100%的产率获得所需的对映纯产物，而无需额外的外消旋化试剂或催化剂。

自1992年Bringmann内酯被发现以来[13]，使用手性亲核试剂进行对映选择性环开的研究迅速而广泛地展开，许多具有挑战性的立体异构天然产物也通过这种方法合成[4, 10, 11, 14, 15, 16, 17]。此外，使用手性催化剂还对一系列六元桥联联芳基体系进行了深入研究，取得了高产率和高的对映选择性[10, 11, 18, 19]。将这种方法进一步扩展到相应的七元内酯及其同类化合物也是非常有吸引力的，但目前仍处于发展阶段[20, 21, 22]。一个成功的例子是通过立体选择性环开反应成功拆分了联芳基噁唑嗪[21]。相比之下，类似的立体 hindered 底物仅实现了简单的动力学拆分[20]。因此，底物的结构是不需外消旋化催化剂实现DKR的最关键因素。

迄今为止，六元和七元桥联联芳基化合物的催化和对映选择性环开主要是在手性有机催化剂和过渡金属催化剂的存在下进行的[10, 11]。一个典型的例子是七元内酯1的催化还原反应（图1A）。虽然关于生物催化替代方案的研究尚不充分，但仅有一篇关于脂肪酶/酯酶催化六元联芳基内酯3转化为4的报道[23]。作为我们研究的一部分，我们旨在利用生物催化法制备对映体富集的联芳基化合物[24, 25, 26, 27, 28, 29]，从而为可持续发展方法做出贡献[30]，本文报告了通过猪肝酯酶（PLE）实现七元桥联联芳基内酯5的立体选择性酶促环开的概念验证（图1C）。从生物催化的角度来看，我们发现使用极性较低的有机溶剂与水溶液缓冲液相结合能够显著提高酯酶的对映选择性，而与水混溶的有机溶剂与缓冲液组合（通常用于PLE的应用）几乎只能得到外消旋产物6。我们还发现PLE中的特定同工酶在促进rac-5向6的转化中起着重要作用。

**结果与讨论**
先前的研究[23]表明，使用七种脂肪酶和PLE对六元联芳基内酯3进行环开反应时，产物4的产率（ee值高达13%）即使在7天后也只有1%–11%（图1B）。我们认为，与大芳香环相邻的羰基可能是导致这些酶反应性低的原因。因此，我们设计了七元联芳基内酯5，其中羰基距离芳香环一个碳原子，使其成为更适合酶促环开的底物（关于合成5的详细信息，请参见支持信息）。

首先，通过DFT计算确定5的旋转势垒为21.9 kcal/mol，这表明5在室温下可能自发外消旋。另一方面，6的旋转势垒为30.5 kcal/mol，足以使其具有构象稳定性（图1；计算细节见补充信息）。这些结果表明5是无需外消旋化催化剂即可进行DKR的合适底物。

基于这些有利的数据，我们初步筛选了多种可用的水解酶，并将rac-5与多种商购的脂肪酶和酯酶进行了反应。反应在30°C下进行24小时，使用1:1 v/v的缓冲液（0.1 M磷酸盐缓冲液，pH 7.4）和iPr2O作为反应介质（表1）。一些脂肪酶能够将rac-5水解为羧酸6，但所有情况下的产率都非常低（表1中的条目1–8）。相比之下，来自Amano和Sigma的商用冻干PLE获得了较高的(S)-6产率（分别为65%和95%）（条目9和10）。产物6的绝对立体化学结构通过振动圆二色性（VCD）确定（详情见支持信息）。当iPr2O与缓冲液的比例降至4:1 v/v时，Sigma PLE催化的反应产率达到了99%（条目11）。我们还确认，在没有酶的条件下反应完全不会发生（条目12）。实验中直接测量的反应混合物温度（29°C–31°C）对反应结果至关重要，因为在稍高的温度（如37°C–40°C）下进行相同反应时，仅获得了大约10%的rac-6。除条目1外，所有条目中显示的实验结果都表明6具有相同的立体化学构型。在类似的反应条件下使用Sigma PLE对rac-6的甲酯混合物进行水解后，48小时后获得了68%的(S)-6（ee值35%）和62%的未反应酯（ee值20%）（详情见支持信息），这表明rac-5的水解速度更快。这些结果鼓舞我们进一步优化了使用Sigma PLE的反应条件，并筛选了多种有机溶剂与缓冲液的组合。

**表1. 对rac-5水解的酶初步筛选**
| 脂肪酶/酯酶 | (S)-6的产率（%） | ee值（%） |
|-----------------|------------------|------------------|
| Candida rugosa脂酶（Meito） | 21 | <1 |
| Pencillium roqueforti脂酶（Amano） | <1 |
| Pencillium camemberti脂酶（Amano） | <1 |
| Mucor miehei脂酶（Roche） | 5 | 25 |
| 猪胰腺脂酶（Sigma） | 3 | 32 |
| Pseudomonas fluorescens脂酶（Amano） | <1 |
| Burkholderia cepacia脂酶（Amano） | <1 |
| Candida antarctica脂酶B（Novozymes） | <1 |
| PLE（Amano） | 6 | 53 |
| PLE（Sigma） | 9 | 52 |
| PLE（Sigma） | 9 | 95 |
| PLE（Sigma） | 11 | 26 |
| （空白） | <1 |

**反应条件**：反应在30°C下进行24小时，使用2毫克rac-5和2毫克商业可用的固定化脂肪酶/冻干PLE，以及在1:1 v/v的0.1 M磷酸盐缓冲液（pH 7.4）和iPr2O（总共2毫升）混合物中。

通过1H NMR分析粗产物来确定产率（ Detail见支持信息）。使用手性HPLC分析来确定ee值（详细信息见支持信息中的方法A）。

我们惊讶地发现，所用有机溶剂的类型对PLE催化水解的产率和ee值有显著影响。一些典型的观察结果如下：单独使用缓冲液，以及缓冲液与水混溶的有机溶剂（如DMSO、乙腈和丙酮）的组合，虽然提高了产物的转化率，但对对映选择性产生了不利影响。相比之下，使用弱极性和非极性溶剂（如甲苯、环己烷和正己烷）可以提高对映选择性（ee值11%–33%），但反应产率较低（31%–78%）。值得注意的是，本研究中最高的对映选择性出现在使用环戊基甲基醚（CPME；ee值53%）和叔丁基甲基醚（MTBE；ee值50%）的情况下，而产率则适中（分别为52%和32%）。令人惊讶的是，我们在酯酶催化的生物转化反应中发现了醚类共溶剂这种独特的效果，因为据报道酯酶在水混溶溶剂中的反应性和选择性通常更高[32, 33, 34]，而在水不溶溶剂中的效果则相反[35]。以异丙醇和叔丁醇为例，在使用PLE作为粗酶混合物时，对映选择性有所提高[36]。这种粗酶混合物通常包含多种PLE同工酶。此外，当使用单独的重组PLE同工酶时，尤其是乙醇的存在已被证明可以提高对映选择性[33]。据我们所知，图2中的结果首次证明酯酶在含有水不溶有机溶剂的条件下表现出了更高的对映选择性，特别是当使用中等极性的醚类作为有机溶剂成分时。后续的研究使用了CPME，其表现出的对映选择性略高于MTBE，尽管两者的对映选择性几乎相同。

**图2. 共溶剂对PLE催化的rac-5水解的影响**
反应在30°C下进行4小时，使用2毫克rac-5和4毫克Sigma PLE，在0.1 M磷酸盐缓冲液（pH 7.4）与共溶剂（总共2毫升）的4:1 v/v混合物中。通过1H NMR分析粗产物来确定6的产率，使用（三甲硅基）二唑甲烷通过手性HPLC分析从(S)-6衍生的甲酯来确定ee值（详细信息见支持信息中的方法B）。结果按照有机溶剂的极性排列（图3）。蓝色条形表示(S)-6的产率（%），灰色条形表示(S)-6的ee值（%）。

基于这些有趣的结果，我们进一步研究了CPME对PLE的反应性和对映选择性的影响，通过改变CPME与缓冲液的比例（% v/v）来进行实验（图3）。如上所述，完全不含CPME或仅含1% v/v CPME时，对映选择性较差，尽管仍可实现到一定程度上向6的转化。随着CPME比例从2% v/v逐渐增加到35% v/v，对映选择性有所提高（ee值最高达到65%），但(S)-6的产率逐渐降低（CPME比例2% v/v时为99%，35% v/v时为62%）。过多使用CPME（65%–90% v/v）对对映选择性没有影响（ee值保持在50%–54%），但(S)-6的产率逐渐降低（CPME比例增加时为33%–12%）。通过考虑产率和对映选择性（% ee），发现20%体积比的CPME溶剂系统或缓冲液与CPME的4:1混合物是最佳条件。据我们所知，这是首次通过添加水不溶性溶剂（如醚类）显著提高PLE催化的生物转化中的对映选择性的例子。下载：下载高分辨率图片（30KB）下载：下载全尺寸图片

3. CPME对PLE催化的rac-5水解的影响
反应在30°C下进行22小时，使用rac-5（2毫克）和Sigma PLE（4毫克），在0.1 M磷酸盐缓冲液（pH 7.4）和CPME（总共2毫升）的混合物中。通过使用内标物对粗混合物进行1H NMR分析来确定产率。(S)-6的对映选择性通过手性HPLC分析来确定。蓝色条形：(S)-6的对映选择性（%），?：(S)-6的产率（%）。

接下来，对在30°C下，缓冲液/CPME（4:1体积比）中PLE催化的rac-5水解的时间过程研究揭示了该反应的一些特征（表2）。首先，延长反应时间增加了(S)-6的产率，48小时后几乎定量形成了(S)-6。其次，(S)-6的对映纯度在48小时内保持几乎恒定（60%-65%的对映选择性，略有波动），表明(S)-6在这些条件下构象稳定。第三，另一个重要的观察是，在整个反应过程中回收的5始终是外消旋的，表明5中反应性较低的对映体的外消旋化非常快。这两种底物5和产物(S)-6的构象特性最适合在没有外消旋化催化剂的情况下实现DKR（差向立体选择性转化）。最后，我们在0.2毫摩尔规模上进行了PLE催化的rac-5水解反应，经过硅胶柱层析纯化后获得了(S)-6（对映选择性为60%）。

表2. PLE催化的rac-5水解的时间过程研究。
a. 进行时间 (S)-6的产率（%）
b. (S)-6的对映选择性（%）
c. 回收的5

a. 反应在30°C下使用rac-5（2毫克）和Sigma PLE（4毫克），在缓冲液和共溶剂（总共2毫升）的4:1体积比混合物中进行。
b. 通过使用内标物对粗混合物进行1H NMR分析来确定产率。
c. 通过手性HPLC分析来确定回收的5和(S)-6的对映选择性。
d. 使用rac-5（50毫克，0.2毫摩尔）和Sigma PLE（100毫克）进行了类似的反应。

商业上的PLE并不是由单一多肽链组成的均质蛋白质，而是由几种同工酶组成[32, 37]。它们在氨基酸序列上有所不同，这可能导致基底物范围、对映选择性、对映偏好以及pH值或温度依赖性等生化性质上的差异[38, 39, 40]。通过整合重组PLE的选择方面，我们认为可以消除商业上可获得的天然猪肝提取物中其他水解酶对结果潜在的影响。因此，我们检验了六种不同重组PLE同工酶（rPLEs；购自Enzymicals AG）对rac-5的反应性和对映选择性。首先通过标准的对硝基苯乙酸（pNPA）活性测定法分析了每种同工酶在缓冲液溶液中的活性（详细信息见补充信息）。然后在优化条件下（见表2中的条目3）使用40单位（以对pNPA的活性为标准）的同工酶/Sigma PLE进行了后续的rac-5酶促水解（表3）。然而，对于活性较低的rPLE-1至rPLE-3，同工酶的加载量（以U计）小于标准条件（条目1-3）。尽管我们不能直接讨论每种同工酶的反应速率，因为酶的加载量不同，而且酶活性是用pNPA而不是5来评估的，但我们认为可以对映选择性进行直接比较。在这项工作中筛选的六种同工酶中，rPLE-1和rPLE-4的对映选择性非常低（条目1和4），而rPLE-2和rPLE-3的对映选择性中等（分别为36%和对64%）（条目2和3）。rPLE-5和rPLE-6显示出相当高的对映选择性（分别为53%和对60%）（条目5和8），这与商业Sigma PLE的对映选择性几乎相同（条目11）。使用rPLE-5和rPLE-6时，(S)-6的产率相对较低（分别为18%和13%）（条目5和8）。然而，在类似的反应中，将溶剂体积减少一半（即总共1毫升）的情况下，两种情况下(S)-6的产率都翻倍，同时保持(S)-6的对映选择性（条目6和9）。当使用40单位的商业Sigma PLE时，其酶的加载量是表2中条目3的反应的八分之一，(S)-6的产率只有7%（条目11）；而将溶剂体积减少一半（即总共1毫升）时，(S)-6的产率达到了39%（条目12）。使用rPLE-5、rPLE-6和Sigma PLE获得的结果表明，酶的量和产品的产率成正比，而对映选择性与酶的量无关，并且每种酶的对映选择性几乎保持不变。此外，当这三种反应在仅含缓冲液的介质中进行时，反应性显著提高，但产物6几乎呈外消旋状态（条目7、10和13）。综合这些结果，我们可以得出结论，在商业上可获得的Sigma PLE中，同工酶rPLE-5和rPLE-6主要负责rac-5的对映选择性水解。

表3. 各同工酶rPLE-1–rPLE-6与Sigma PLE对rac-5的水解活性比较。
a. 同工酶或Sigma PLE
酶加载量，Ub (S)-6的产率（%）
对映选择性（%）
1 rPLE-1 2.5 —— 2
2 rPLE-2 5 36 3
3 rPLE-3 20 44 4
4 rPLE-4 40 23 6
5 rPLE-5 40 18 5
6 rPLE-5 40 39 5
7 rPLE-5 40 7 1
8 rPLE-6 40 13 6
9 rPLE-6 40 25 6
10 rPLE-6 40 11 0

a. 反应在30°C下使用rac-5（2毫克）和酶（40单位）在缓冲液（1.6毫升）和CPME（0.4毫升）的混合物中进行，除非另有说明。
b. 对每种同工酶的水解活性测量，请参见：支持信息。
c. 通过使用内标物对粗混合物进行1H NMR分析来确定产率。
d. 通过对6进行手性HPLC分析来确定对映选择性。
e. 酶的加载量低于标准条件，因为活性较低。

结论
我们报告了第一个含7元内酯桥的外消旋双芳基化合物5的DKR（差向立体选择性转化）的例子，其中通过商业上可获得的PLE催化了立体选择性内酯水解，产率高达99%，生成相应的羧酸(S)-6。通过选择由缓冲液（pH 7.4）和二烷基醚（如CPME）组成的混合溶剂系统，(S)-6的对映选择性提高到了65%。这项研究的一个特点是5在30°C下迅速外消旋，而生成的环开产物在构象上稳定，保持了和对映体的纯度。换句话说，DKR是在没有外消旋化催化剂的情况下进行的，仅基于底物5和产物6在其轴上的旋转难易程度的固有性质。从酶催化的角度来看，这是一个前所未有的发现，即通过向缓冲液中添加水不溶性有机溶剂（如CPME和MTBE），PLE提供的对映选择性显著提高。此外，基于对分离出的同工酶的研究，我们假设在商业上可获得的PLE中存在的几种同工酶中，内酯水解主要由其同工酶rPLE-5和rPLE-6催化。我们相信观察到的溶剂效应也适用于其他类似的底物。基于这一概念，我们的下一个目标是通过创造PLE同工酶的突变体来提高对映选择性，并使这种涉及双芳基内酯立体选择性水解的DKR概念更加实用。

实验部分
酶筛选和优化用于rac-5的水解（表和图中的所有反应，表2中的条目5除外）
在试管中，将rac-5（2毫克，8微摩尔）溶解在有机溶剂中，并加入酶溶液（每种酶的量在相应的表和图中显示）和0.1 M磷酸盐缓冲液（pH 7.4）以及相同的缓冲液（总体积为2毫升，有机溶剂与缓冲液的体积比在每种表和图中显示）。反应混合物在30°C下以650转/分钟的速度搅拌（实际反应混合物的温度在29°C–31°C范围内），使用ChemiStation进行指定时间的反应。混合物用2 M HCl酸化至pH 3，然后通过短垫的Celite过滤。洗脱液用EtOAc提取两次，合并的有机层用Na2SO4干燥并在真空下浓缩。粗产物使用1,1,2,2-四氯乙烷作为内标物进行1H NMR分析。对于5的手性HPLC分析；紫外光220纳米，手性柱：CHIRALPAK IF-3，n-己烷/iPrOH = 95:5， oven温度 = 30°C，流速 = 1毫升/分钟，t1 = 12.2分钟，t2 = 16.5分钟。对于6的手性HPLC分析，请参见：方法A和B，见S4和S5页。

对于表2中的条目5以外的所有反应，使用了特定活性为322 U/毫克的Sigma PLE（通过标准pNPA测定法测量）。

0.2毫摩尔规模上的rac-5水解（表2中的条目5）
在100毫升圆底烧瓶中，将rac-5（50.2毫克，0.193毫摩尔）溶解在CPME（10毫升）中，然后加入Sigma PLE的缓冲液溶液（40毫升）。所得悬浮液在29°C–30°C的孵育器中搅拌48小时。通过加入EtOAc（50毫升）停止反应，并用2 M HCl酸化反应混合物至pH 3。含有沉淀的反应混合物在20°C下以4 × 103 g的离心力离心5分钟，将上层有机层转移到另一个烧瓶中。剩余的水层用EtOAc重新悬浮并在相同条件下再次离心，然后将上层转移到同一个烧瓶中。这个过程总共重复3次。合并的有机层用Na2SO4干燥并在真空下浓缩。粗产物通过flash柱层析纯化（己烷/EtOAc = 5:1至1:5），得到(S)-6（54毫克），其中包含EtOAc和己烷（根据1H NMR分析，6的EtOAc和己烷比例为1:0.2:0.07）。计算产物的重量为49.9毫克（产率90%）。该产物通过将其保持在-20°C下2小时，然后立即转移到真空环境中（在旋转蒸发器上温和加热）得到(S)-6（41毫克），其中包含EtOAc和己烷（根据1H NMR分析，6的EtOAc和己烷比例为1:0.05:0.02）；见：支持信息中的图S1-A）。对映选择性为60%。[α]D26 = –124.9° (c = 0.95, CHCl3)。

1H NMR（500 MHz, CDCl3）δ 7.83–7.80 (m, 2H), 7.53–7.47 (m, 3H), 7.34–7.29 (m, 3H), 7.24 (dd, J = 8.9, 2.6 Hz, 1H), 7.09–7.06 (m, 1H), 3.47 (d, J = 16.9 Hz, 1H), 3.38 (d, J = 16.9 Hz, 1H)。
13C NMR（126 MHz, CDCl3）δ 177.6, 151.2, 134.9, 134.7, 133.5, 132.6, 131.4, 130.3, 129.5, 129.2, 129.0, 128.5, 127.1, 124.5, 119.7, 118.4, 38.7。
IR（NaCl）ν cm?1: 3330 (br, OH), 1706 (C=O)。
HRMS（ESI-）m/z：C18H13O3 [M-H]?的计算值：277.0870；实测值：277.0872。
手性HPLC分析：紫外光235纳米，手性柱：Daicel CHIRALPAK AD-3，n-己烷/EtOH/TFA = 90:10:0.2，oven温度 = 40°C，流速 = 0.8毫升/分钟，t1 = 11.7分钟（次要峰），t2 = 21.8分钟（主要峰，80%）。

支持信息
更多支持信息可以在支持信息部分找到。支持信息中引用的额外参考文献（参考[41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51]。

资助
本研究得到了日本学术振兴会（21H02605, 22KK0073, 24K02148）、日本医疗研究开发机构（JP25ama121054）、德国研究联合会（GR 3461/7-1）以及日本冈崎计算科学研究中心（25-IMS-C414）的支持。

利益冲突
作者声明没有利益冲突。

数据可用性声明
支持本研究发现的数据可在合理请求下从相应作者处获得。