基于3D微组织阻抗模型的平台，优化电场联合疗法对肺肿瘤微球的治疗效果

《Chemical Engineering Journal》：Efficacy optimization of electric field combined therapy on lung tumor microspheres using 3D micro-tissue impedance model-based platform

　　

蒋玉清|罗欣茹|姜阿灿|邱斌|凌双|吴慧全|徐晨瑞|陈瀚|张旭|陈红|陈松月|孙道恒

厦门大学微纳科学技术研究院，中国厦门361102

摘要

肿瘤球体是一种重要的3D体外肿瘤模型，具有很高的临床相关性，因为它们能够再现缺氧/营养梯度以及细胞间和细胞与细胞外基质的相互作用。目前对肿瘤球体的研究通常在培养皿中进行，使用外部设备和离线检测方法进行调节和评估，这无法满足原位过程监测和动态控制的需求。为了解决这些挑战，我们提出了一种基于三维微组织阻抗模型（3DμTM）的肺癌芯片平台，该平台集成了物理场调节、阻抗检测和参数分析功能，用于体外肿瘤治疗研究。与现有的阻抗等效电路模型相比，3DμTM能够模拟肺癌芯片和肿瘤球体内的电荷三维运动，涵盖了从亚细胞到组织尺度的多级生物物理参数。这使得可以分析微电极检测到的阻抗曲线，并优化基于电场的治疗（FCT）的参数。利用3DμTM，我们发现将电场信号频率从150 kHz提高到1 MHz几乎使A549肿瘤球体的阻抗比翻倍，从而可能提高治疗效果。FCT实验结果显示，与SinEF（150 kHz）相比，SinEF（1 MHz）和组合电场（正弦波+脉冲电场）分别将细胞增殖率降低了21.9%和13.2%。这一平台不仅为肺癌疗法提供了集成的在线评估工具，还为FCT的优化和不同癌症的治疗策略制定提供了新的理论基础。

引言

肿瘤的特点是细胞外基质密集、血管结构紊乱以及肿瘤微环境中的细胞间相互作用强烈，这对药物递送和免疫治疗产生了重大挑战[1]、[2]、[3]、[4]。包括电离辐射、光场、超声波和电场（EFs）在内的物理场介导的癌症疗法已成为联合治疗中的有希望的辅助手段，显示出它们重塑肿瘤微环境并提高其他疗法疗效的潜力[5]。基于电场的联合疗法（FCT）因其初步疗效和安全性的积极结果而受到了广泛关注[6]、[7]、[8]、[9]，这促使人们继续研究EFs与各种治疗方式结合使用对实体瘤治疗的协同效应[10]。肿瘤球体常用于3D癌症培养，它们能很好地模拟肿瘤的微环境[11]、[12]、[13]，因此对于临床可转化的治疗研究具有重要意义。

电场参数（包括强度、频率和波形）在决定FCT疗效方面起着关键作用[14]、[15]、[16]、[17]。目前对这些参数的优化主要依赖于使用平面培养的癌细胞的体外控制实验[15]、[17]、[18]、[19]、[20]、[21]、[22]。然而，这些方法劳动强度大，且无法准确复制肿瘤结构和微环境，导致疗效不佳和副作用发生率较高。研究人员已经探索了使用外部设备和生物染色方法在培养板和孔中进行肿瘤球体研究[23]、[24]、[25]，但这些繁琐的程序和终点检测方法不适合评估复杂的疗法和动态调整参数。随着计算技术的进步，建模和仿真已被用来降低实验成本和时间[26]、[27]、[28]。然而，肿瘤的异质性导致生物物理参数的变化，限制了优化结果的有效性，而仿真的复杂性又阻碍了其更广泛的应用。电场分布由治疗系统与肿瘤组织之间形成的等效电路决定。基于精心设计的3D组织等效电路模型的肺癌芯片可以从机制上指导FCT疗效的提高，显著简化实验程序并减少所需的实验次数。

传统上用于器官芯片的阻抗等效电路模型，如电细胞-基底阻抗感应（ECIS）模型[29]、[30]、[31]，以及阻抗流式细胞术（IFC）和电化学阻抗光谱（EIS）模型[32]、[33]、[34]、[35]、[36]，都是基于二维培养或简单的悬浮细胞系统，已广泛应用于癌细胞行为分析。当将这些模型应用于复杂的三维肿瘤球体时，由于缺乏垂直维度，相应的串联和并联电路缺失，导致总阻抗表达失真。此外，这些模型未能充分捕捉电场对细胞和细胞外基质在三维分布中的非均匀影响。更针对性的扩展模型，如并联电路模型[37]、[38]，已被应用于3D肺癌细胞培养的阻抗分析，但忽略了串联分布的细胞和细胞外基质生物物理参数对电场分布的影响。因此，这些模型的过度简化以及缺乏串联参数限制了它们有效捕捉电场参数对肿瘤全面影响的能力。

为了解决这些挑战，我们开发了一种基于新的三维微组织（μTissue）阻抗模型（3DμTM）的肺癌肿瘤球体芯片平台。3DμTM结合了多级串联-并联混合电路，已被证明能够捕捉在不同FCT条件下A549肺癌组织生物物理参数的差异变化。使用3DμTM，我们发现将电场信号频率从150 kHz提高到1 MHz几乎使肺癌球体的局部电压分压翻倍，从而可能提高治疗效果。平台上的实验结果表明，与传统的150 kHz正弦电场（SinEF）相比，1 MHz SinEF和组合电场（CombEF）分别显著降低了A549的增殖率（21.9%和13.2%），并且有效减少了电极损伤。基于3DμTM的场优化也适用于其他组织，如PC12组织，其中组织参数的差异导致疗效改善程度不同。这些发现强调了3DμTM在指导FCT疗效提高方面的价值。这一基于3DμTM的平台为肺癌疗法提供了更方便和全面的评估工具，同时也为FCT的优化和不同癌症的治疗策略制定提供了新的理论基础。

章节片段

肺癌组织的细胞培养和3D培养

细胞按照标准程序进行复苏和扩增。本研究使用了人NSCLC细胞系A549（上海中桥新洲生物技术有限公司，中国）和PC-12大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞（上海中桥新洲生物技术有限公司，中国）。A549细胞被转移到10 cm的培养皿中，并加入8 mL的A549人非小细胞肺癌细胞特异性培养基（上海中桥新洲生物技术有限公司，中国）。

肺癌芯片的设计和制造过程

肺癌芯片总共包含16个微电极，分为4组。每组包括2个用于电场刺激的刺激电极和2个用于阻抗测量的检测电极。微电极是通过在200 μm厚的PDMS薄膜（杭州Westru科技有限公司，中国）上使用磁控溅射制造的。使用PI胶带作为掩模，将PDMS预混料（SYLGARD 184，Dow Corning）涂覆在薄膜上，暴露出1 mm长的刺激电极。

讨论与结论

我们提出了基于3D μTissue阻抗模型（3DμTM）的肺癌芯片平台，用于评估FCT对肺癌肿瘤球体的疗效，并优化电场参数以增强治疗效果。3DμTM受到已建立的溶液电极双层模型[48]、[49]和单细胞等效电路模型[50]、[51]、[52]的启发，创新性地通过串联和并联的组合来模拟组织内的复杂电荷路径。

CRediT作者贡献声明

蒋玉清：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原稿，方法论，概念化。 罗欣茹：可视化，软件，研究。 姜阿灿：软件，研究，形式分析。 邱斌：验证，形式分析。 凌双：形式分析，数据管理。 吴慧全：验证，资源协调。 徐晨瑞：监督。 陈瀚：监督。 张旭：资源协调，研究。 陈红：资源协调，资金获取。 陈松月：撰写 – 审稿与编辑，撰写

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能影响本文工作的竞争性财务利益或个人关系。

致谢

本研究得到了中国国家重点研发计划（2022YFB4600600）、福建省自然科学基金（编号2023J01044）和临港实验室项目（LGL-2615-08）的支持。