《Chemical Engineering Journal》：Gelatin microspheres reinforced by o-nitrobenzyl–vinyl coupling for 3D cell culture and high-fidelity extrusion printing
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朱伟超|任春玲|陈巧琳|张宇辰|朱丽斌|陈亮|蒋莉|刘团|林秋宁|朱林勇|鲍炳坤宁波大学第一附属医院儿科外科，中国宁波315000摘要微流控技术能够制备出高度均匀的明胶甲基丙烯酸酯（GelMA）水凝胶微球，这些微球在生物医学应用中具有广泛潜力。然而，这些GelMA微球依赖于自由基
朱伟超|任春玲|陈巧琳|张宇辰|朱丽斌|陈亮|蒋莉|刘团|林秋宁|朱林勇|鲍炳坤
宁波大学第一附属医院儿科外科，中国宁波315000
摘要
微流控技术能够制备出高度均匀的明胶甲基丙烯酸酯（GelMA）水凝胶微球，这些微球在生物医学应用中具有广泛潜力。然而，这些GelMA微球依赖于自由基聚合形成的单网络结构，这种结构本质上存在缺陷且不均匀，导致其在剪切和压缩下的机械强度较差，从而限制了实际应用。现有的增强策略需要非同源添加剂或多步骤交联方案，但这些方法会损害生物相容性或干扰微流控加工过程。在这里，我们通过在GelMA微球中部分替换为邻硝基苄基修饰的明胶（GelNB）来在微观结构层面进行增强。这种NB-乙烯基偶联反应在不改变原始明胶配方、不引入辅助试剂或不干扰基于液滴的微流控加工的情况下，增强了水凝胶网络。与GelMA微球相比，GelNB微球的压缩强度提高了3.13倍，并且能够承受高达50%的剪切变形而不发生结构损坏。重要的是，它们保留了天然的细胞粘附特性、细胞相容性和可降解性。这些微球可用作可降解的微载体，用于3D细胞培养，并实现复杂结构的高保真挤出打印。这一策略拓宽了明胶微球在生物制造、再生工程和治疗递送中的应用范围。
引言
将明胶水凝胶与先进的制造技术（包括3D生物打印（如挤出、数字光处理）、冰模板法、电纺和微流控）相结合，已经能够构建出具有显著生物医学潜力的多种功能性结构[1]、[2]、[3]、[4]。这些方法在定义结构分辨率、空间组织和加工性方面存在根本差异，从而为明胶基材料的工程化提供了互补的途径。其中，微流控制造特别具有吸引力，因为它能够精确生成高度均匀的微米级GelMA水凝胶微球（HMPs）[5]、[6]、[7]。温和且可控的制造过程允许实现可编程的尺寸和狭窄的尺寸分布，从而产生可预测的流动行为、可控的堆积和可重复的组装[8]、[9]。此外，这些微球的内在模块化特性使得可以整合不同的成分，构建具有空间可编程功能的异质系统。因此，GelMA HMPs已被广泛应用于细胞和生长因子的注射递送[10]、[11]、灌注生物反应器中的微载体培养[12]、模块化组织组装[13]以及生物制造中的生物墨水[14]、[15]、[16]。
尽管有这些优势，但通过微流控方法制备的GelMA HMPs仍然脆弱且机械强度低[8]、[17]。在注射过程中的瞬态剪切、灌注过程中的持续剪切以及体内的循环压缩载荷下，它们容易变形或破裂，从而影响细胞活力、机械稳态和可控释放性能[9]、[18]、[19]。这一限制源于自由基聚合形成的单网络结构，该结构本质上存在缺陷且不均匀[20]、[21]。在微流控液滴中，由于聚二甲基硅氧烷微通道的氧气渗透性和富含氧气的氟化油，液滴-油界面的氧气抑制作用进一步加剧了这些问题[22]、[23]。此外，微球的高表面积与体积比放大了界面效应，导致明显的交联梯度（硬核/软壳结构）和残余应力，使得颗粒特别容易开裂和变形[24]。
通过增加前体浓度、甲基丙烯酸化程度或光照强度来增强GelMA HMPs的努力已被证明是无效的[25]、[26]。尽管这些方法可以增加网络密度，但它们限制了链的移动性，使微球变得脆弱并降低了能量耗散。固体含量的增加还会提高前体的粘度，干扰微通道流动、液滴稳定性和固化均匀性。此外，细胞封装进一步将实际的GelMA配方限制在5-10%的重量百分比以内，超过这个范围后，交联密度的增加会损害细胞活力[27]、[28]。因此，大多数提高GelMA微球机械性能的努力依赖于复合增强策略，如双网络结构或无机填料（如二氧化硅、拉普诺石和羟基磷灰石）[29]、[30]、[31]、[32]。虽然这些方法有效，但它们通常会改变明胶的固有性质，减缓降解速度，降低细胞粘附性，并引发生物安全问题[33]、[34]、[35]。正交或二次交联机制（如基于酶反应、EDC/NHS偶联或金属-配体配位）受到交联动力学缓慢或多步骤处理的限制。这些限制阻碍了在受限微流控环境中实现时空控制和液滴均匀性的目标[36]、[37]、[38]、[39]。此外，它们还引入了与使用额外试剂相关的额外生物安全风险。
通过硫醇-烯或硫醇-诺尔伯烯逐步聚合机制进行机械靶向处理，可以在不添加额外添加剂的情况下改善网络均匀性[40]。然而，硫醇容易氧化或发生过早反应，导致储存稳定性差和在液滴形成前发生预凝胶化，这进一步限制了连续的微流控生产[41]。
受到硫醇-烯化学无添加剂机制的启发，我们提出了一种机械靶向且高度可控的策略，通过部分替换GelMA为稳定的邻硝基苄基修饰明胶（GelNB）来增强GelMA HMPs。我们没有试图完全抑制氧气抑制（这在技术上具有挑战性且往往不可靠），而是通过NB-乙烯基化学诱导微观结构相分离来优化网络结构本身。该反应将乙烯基聚合与NB介导的界面增强结合起来，实现了快速凝胶化和微观结构的重组，形成了一个相分离但共价整合的网络。该策略保持了一步快速光交联的工作流程，不需要外源性或非明胶填料，并且可以与标准的基于GelMA的微流控加工完全兼容，同时保持了生物安全性、可降解性和天然的细胞粘附特性（图1A）。通过基于挤出的3D打印，我们进一步证明了GelNB HMPs作为颗粒构建块时可以增强构建体的稳定性和保真度，突显了它们在生物制造中的即时实用性（图1B）。因此，这些增强的微球非常适合从细胞培养和扩增到生物制造和基于颗粒的递送系统，包括药物递送和增强型油回收等各种应用。
章节片段
明胶HMPs的加工性和可调尺寸控制
我们没有引入添加剂来增强GelMA HMPs，而是专注于优化网络结构本身，作为一种更直接和有效的途径来提高微球的机械强度。我们的最新研究发现了一种邻硝基苄基（NB）和乙烯基团之间的偶联反应，该反应能够在自由基聚合过程中实现选择性的界面交联[42]、[43]、[44]、[45]。在这种机制中，虽然甲基丙烯酰胺聚合主要生成聚合物链
结论
总之，我们的策略通过用GelNB替换部分GelMA来增强网络微观结构，从而提高了微流控制备的明胶微球的机械性能。这种改性对原始GelMA配方的影响很小，完全兼容标准的微流控加工，并避免了可能引发安全问题的辅助试剂。由此产生的微球表现出显著改善的剪切耐受性，能够通过比
材料
2.5-二氧吡咯烷-1-基-4-(4-(羟甲基)-2-甲氧基-5-硝基苯氧基)-丁酸酯（NB-NHS）、邻硝基苄基醇修饰明胶和GelMA购自Lingeltech Medical Technology（上海，中国），邻硝基苄基醇修饰明胶（NB取代度7.9%，类型A，Bloom 250），GelMA（甲基丙烯酸酯取代度100%、80%和10%，类型A，Bloom 250）。PEGOH（Mn = 5 K）、罗丹明B 5-异硫氰酸酯、酒石黄、地塞米松、L-脯氨酸、ITS+和抗坏血酸
CRediT作者贡献声明
朱伟超：验证、方法学、数据管理。任春玲：撰写——原始草稿、方法学、数据管理、概念化。陈巧琳：验证、方法学、数据管理。张宇辰：验证、方法学、数据管理。朱丽斌：验证、方法学、数据管理。陈亮：验证、方法学、数据管理。蒋莉：资金获取、概念化。刘团：资金获取、概念化。林秋宁：撰写——审稿与编辑、资金
W.Z.和C.R.对这项工作做出了同等贡献，B.B.、LY.Z.、Q.L.和L.J.提出了想法。B.B.、C.R.、LY.Z.和Q.L.撰写了手稿。C.R.准备了材料，进行了机械测试，进行了3D打印并分析了数据。W.Z.、Q.C.、Y.Z.和LB.Z.参与了细胞实验的设计和数据分析。Y.Z.、L.C.和LB.Z.评估了在大鼠体内的材料生物安全性。B.B.、Q.L.和L.J.为这项工作提供了财务支持。所有作者
作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能会影响本文所述的工作。
本工作得到了中国国家重点科技项目（2025ZD1406104）、中国国家重点研发计划（2024YFA1107600、2023YFA1802000）、国家自然科学基金（52503187）、上海市自然科学基金（24ZR1432500、25ZR1402194）、上海市科学技术委员会（24CL2900700）以及上海交通大学的跨学科计划（YG2024QNA19）的支持。
