定量实时PCR在免疫功能低下患者机会性感染诊断中的应用：诊断性能、临床价值及未来发展方向

《Infectious Diseases in Clinical Practice》：Quantitative real-time PCR in the diagnosis of opportunistic infections in immunocompromised patients: Diagnostic performance, clinical utility, and future directions

　　**摘要（通俗语言总结）**
机会性感染（OI）仍然是免疫功能低下者发病和死亡的主要原因，而诊断延误或不准确可能会导致不良的临床后果。这篇叙述性综述批判性地评估了定量实时聚合酶链反应（qPCR）在检测易感患者群体中机会性病原体的诊断性能、临床应用及其不断发展。针对细菌、真菌、病毒和寄生虫感染的实验证据表明，qPCR在敏感性、特异性和检测时间方面始终优于传统的培养和血清学方法，特别是在病原体负荷较低或患者之前接受过抗菌治疗的情况下。其定量功能能够实现动态病原体负荷监测，并有助于及时采取针对性的治疗干预措施。然而，仍存在一些限制，如检测结果的变异性、标准化程度不足以及在多微生物环境中区分定植和活动性感染的挑战。多重检测技术、数字PCR和基于数据的诊断方法的持续进步有望进一步完善其在临床中的应用。总体而言，qPCR已经从辅助检测手段发展成为免疫功能低下患者机会性感染精准诊断的核心技术。

**qPCR在机会性感染诊断中的应用**
这篇叙述性综述探讨了定量实时聚合酶链反应（qPCR）如何用于诊断免疫功能低下患者中的机会性感染。在细菌、真菌、病毒和寄生虫感染中，qPCR在敏感性、特异性和检测速度方面通常优于传统的培养和血清学检测方法，尤其是在病原体水平较低或患者已接受抗菌治疗的情况下。由于qPCR具有定量功能，它可以跟踪病原体负荷的变化，从而指导更精确的治疗决策。然而，检测结果的变异性、缺乏全面标准化以及难以区分定植和真实感染仍然是存在的挑战。随着多重检测平台、数字PCR和基于数据的诊断方法的进展，qPCR正成为机会性感染精准诊断中的关键工具。

**常见问题解答**
1. **什么是机会性感染（OI）？**
机会性感染是由细菌、真菌、病毒或寄生虫引起的疾病，这些病原体在免疫系统正常的人体内通常不会引发疾病。但在免疫系统因其他疾病而受损的人身上，它们可能导致严重甚至致命的后果。[1] 当病原体利用宿主因疾病或药物导致的免疫系统虚弱时，就会发生机会性感染，这类感染在免疫功能低下者中占比较高比例的发病率和死亡率，尤其是在晚期HIV感染患者中，机会性感染导致的死亡率可达到30%–50%[2]。历史上，机会性感染的流行与人类免疫缺陷病毒（HIV）和获得性免疫缺陷综合征（AIDS）的全球疫情密切相关[3]。许多机构已经开发出识别、预防和治疗机会性感染的方法。不同类型的病原体（如分枝杆菌、真菌和寄生虫）的分布和疾病谱因环境因素、病原体毒力和宿主易感性而存在显著差异[4]。宿主的基因组成以及药物引起的免疫抑制类型、强度和时机也会影响感染的风险和严重程度[5]。因药物或疾病导致免疫系统受损的人更容易发生严重的机会性感染并因此死亡[6]。高风险人群包括接受化疗的患者、接受实体器官或骨髓移植的患者，以及使用抑制免疫系统的药物（如免疫抑制剂或生物制剂）治疗的自身免疫性疾病或炎症性疾病患者[7]。在移植受者的长期随访研究中，机会性感染和可预防疫苗感染的比率远高于普通人群[8]。此外，糖尿病、肥胖和高血压等共病会加重疾病的严重程度，增加住院和重症监护的需求[9]。然而，由于传统诊断方法的局限，这些疾病的及时诊断较为困难[10]。

2. **为什么qPCR成为重要的诊断工具？**
传统的微生物学技术（如培养、血清学和显微镜检查）虽然是临床实践的重要组成部分，但它们往往存在检测时间较长、对低浓度病原体的敏感性较低以及在对免疫功能低下患者中可靠性较差的问题[11]。这通常会导致靶向治疗的延误和不良的临床结果。定量实时聚合酶链反应（qPCR）是一种有效的分子诊断技术，可用于检测和定量临床样本中的病原体核酸[12]。与传统诊断方法相比，qPCR具有更高的敏感性、特异性和更快的检测时间[13]。在免疫功能低下的宿主体内，qPCR在早期检测病原体、监测病原体负荷以及识别传统方法无法检测到的微量或混合感染方面发挥着关键作用[14]。本综述批判性地评估了qPCR在诊断免疫功能低下者机会性感染中的作用，比较了其与传统微生物学和血清学方法的诊断性能，评估了其对患者管理和结果的临床影响，并讨论了可能提升机会性病原体快速、多重和低成本检测的技术发展[15]。

3. **qPCR在机会性感染诊断中的优势**
qPCR能快速准确地检测病原体核酸[15]。实时检测通过荧光染料标记后的荧光信号实现，因此需要凝胶电泳进行分析[16]。在qPCR等封闭系统中，处理时间较短且交叉污染风险较低，使其非常适合在高通量临床实验室中使用[17]。qPCR检测使用非特异性荧光染料或序列特异性荧光探针来检测目标分子[18]。基于探针的检测方法相比非特异性染料方法具有更高的特异性，从而减少因样本中引物二聚体非特异性扩增导致的假阳性或假阴性结果[19]。qPCR的成功取决于检测设计，包括选择的引物和探针以扩增特定病原体片段、目标基因类型以及扩增效率[20]。优化设计的qPCR能可靠地扩增和检测临床样本中微量或易降解的病原体[21]。对于免疫系统受损的患者，早期识别感染尤为重要[22]。qPCR能够测量病原体负荷，这对于监测疾病进展、评估治疗反应和比其他诊断方法更早识别耐药性病原体至关重要[23]。这些技术和分析优势推动了qPCR在免疫功能低下者机会性感染诊断中的广泛应用[24]。

4. **qPCR与传统诊断方法的比较**
- **与传统培养方法的比较**：传统培养方法用于识别细菌、真菌和病毒病原体，但结果获取时间较长，且在免疫系统受损的患者中敏感性较低[25]。对于曾接受抗菌治疗、病原体负荷低或病原体生长缓慢的患者，培养方法可能导致假阴性结果[26]。对于侵袭性真菌感染，培养方法的敏感性极低，生长缓慢常常导致患者无法及时获得正确的抗真菌治疗[26]。相比之下，qPCR的检测时间大大缩短，通常可在24小时内提供结果，同时保持高敏感性[28]。
- **与组织病理学检查的比较**：组织活检的组织病理学检查对诊断侵袭性感染必不可少，但其敏感性较低，且某些形态相似的病原体难以区分[29]。在某些侵袭性真菌感染病例中，采样差异和人为因素可能影响结果解读的可靠性[30]。对于移植、化疗或HIV/AIDS导致的免疫抑制患者，使用分子检测方法（如固定石蜡包埋组织）更具诊断价值[31]。
- **与血清学检测的比较**：血清学检测是健康免疫系统个体中弓形虫感染的主要诊断方法[34]，但对于免疫系统受损的患者，血清学检测的价值较低[35]。qPCR能够更准确地在这些患者中检测弓形虫感染[36]。结合分子和血清学检测可提高诊断准确性，及时启动治疗[33]。

5. **qPCR的未来前景**
人工智能（AI）和数字技术的发展将进一步优化qPCR在机会性感染诊断中的应用，实现快速、多病原体和成本效益高的检测[37]。

**结论**
总之，定量实时聚合酶链反应（qPCR）已成为免疫功能低下患者机会性感染精准诊断的核心技术，其在提高诊断效率、缩短检测时间和增强诊断准确性方面取得了显著进展[1]。需要可行的样本；受生长条件限制；需要进行活检；具有侵入性；血清/血浆样本；临床应用包括早期诊断、监测治疗反应、对CMV（巨细胞病毒）、弓形虫和真菌病原体具有高敏感性；是物种确认的金标准，但检测速度慢且灵敏度较低；有助于评估组织损伤，但在物种鉴定方面效果不佳；适用于筛查和免疫状态评估；对于免疫缺陷患者的急性感染作用有限；限制包括需要专用设备、成本较高、耗时较长、灵敏度较低、样本存活度依赖性强、可能存在假阴性结果（尤其是在感染早期或免疫缺陷患者中）；理想应用场景包括在免疫缺陷患者中快速检测、在福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织中诊断CMV、在血清学阴性患者中检测弓形虫等。

**4. 在易感人群中的病原体特异性检测方法应用**

**4.1. 真菌感染**
侵袭性曲霉病（IA）几乎完全发生在免疫系统受损的人群中，通常伴随着较高的死亡率（40%-90%）。[38] 近年来，尤其是欧洲和亚洲部分地区，耐唑类药物的曲霉菌（Aspergillus fumigatus）的发病率有所增加，这主要是由于农业中广泛使用唑类杀菌剂所致，这种情况给治疗带来了重大挑战，进一步恶化了临床结果。[39] 延迟提供合适的抗真菌治疗与死亡风险增加密切相关；研究表明，延迟10天开始抗真菌治疗会使死亡风险增加23%。[40] 多重qPCR检测方法（如AsperGenius）可以同时检测曲霉菌、其他曲霉菌种类以及与唑类药物耐药性相关的CYP51A基因突变。[41] 快速检测病原体及其耐药性标记物有助于早期优化治疗方案，从而改善高风险患者的临床结果。[42] 重要的是，这些检测方法可以完全整合到标准的分子诊疗流程中，因此无需专门的微生物学知识即可操作。

**4.2. 细菌感染**
社区获得性肺炎（CAP）仍然是全球发病率和死亡率的主要原因之一。在许多情况下，尽管进行了广泛的检测，仍无法确定致病菌。因此，抗生素常常是根据经验而非基于确凿的微生物学结果来使用的。这种做法加剧了抗菌药物耐药性的问题，并增加了难辨梭菌感染等并发症的风险。CAP仍然是住院患者使用抗生素的主要原因之一。[43] 应用于非侵入性呼吸道样本的多重qPCR检测方法能够快速识别细菌病原体。当与传统的微生物学检测结合使用时，这些分子方法可以减少不必要的广谱抗生素使用。[44] 在样本采集后几小时内快速识别病原体，使临床医生能够更精确地制定治疗方案。这有助于合理使用抗菌药物，降低医疗成本，并保持抗生素的有效性。

**4.3. 病毒感染**
人巨细胞病毒（HCMV）属于疱疹病毒科，是一种在人体内持续存在但处于非活跃（潜伏）状态的常见病原体。在免疫缺陷者中，HCMV可能导致严重疾病或死亡。[45] 在包括发达国家在内的许多地区，HCMV是先天性病毒感染最常见的原因。在发展中国家，许多人携带HCMV抗体。在免疫抑制宿主体内，HCMV可能重新激活或引发初次感染，无论哪种情况都可能导致严重疾病（全身性或器官特异性）。因此，由于其高灵敏度和特异性以及能够准确检测血液中的HCMV数量，qPCR成为诊断HCMV的重要工具。[46] 由于qPCR能够快速判断患者是否感染HCMV，它可以帮助医生评估免疫抑制的严重程度并决定何时开始抗病毒治疗。[47] 因此，qPCR已成为诊断HCMV和有效管理HCMV疾病的关键方法（见表2）。

**表2 - 易感患者群体中qPCR的病原体特异性应用**

| 感染类型 | 原因 | 传统方法的限制 | qPCR的用途 |
| --- | --- | --- | --- |
| 真菌感染 | 高死亡率；唑类药物耐药性；培养速度慢且灵敏度低；延误治疗会显著增加死亡率 | 快速检测耐药性；基因鉴定 |
| 细菌感染 | 主要的发病率/死亡率原因；病原体常无法鉴定；抗生素过度使用 | 快速识别病原体；减少不必要的抗生素使用 |
| 病毒感染 | 主要的先天性感染原因 | 血清学和抗原检测灵敏度有限；病毒培养速度慢；免疫逃逸影响诊断 | 金标准方法；高灵敏度；病毒载量监测 |

**5. 在免疫缺陷人群中的机会性感染（OI）检测**

**5.1. HIV阳性个体中的OI特征**
随着HIV/AIDS患者CD4+ T细胞数量的减少，他们发生OI的风险增加，必须监测其免疫功能以评估持续感染的风险。[48] 常见的OI发生在免疫抑制程度中等时，如结核病和肺孢子虫肺炎，而严重的感染（如隐球菌病和巨细胞病毒病）通常在HIV病情进展后期出现。频繁使用qPCR可以通过早期检测病原体来加强CD4细胞监测，使医生能够更快地采取预防和治疗措施。HIV/AIDS患者的神经系统机会性感染较为常见，涉及多种机会性病原体（如弓形虫、CMV、隐球菌、约翰·坎宁安病毒和结核分枝杆菌）。[49] 分子诊断研究证明，这些机会性病原体常存在于HIV/AIDS患者的脑脊液中，并确定了哪些基于核酸的检测方法最能准确诊断这些感染。[50] 特别是，用于脑脊液中的病原体检测的qPCR方法具有高灵敏度和成本效益，有助于根据患者的抗逆转录病毒治疗状况做出更好的临床决策。[51]

**5.2. 移植后免疫缺陷宿主体内的病原体检测**
实体器官和造血干细胞移植后的免疫抑制治疗会增加OI的风险，尤其是病毒感染。[52] 发生病毒感染的类型和时间取决于免疫抑制治疗的持续时间和强度。[53] CMV是最常见的移植后病毒性感染；然而，其他病毒（如BK多瘤病毒、疱疹病毒、多瘤病毒和腺病毒）也会导致显著的发病率。[54] qPCR已成为监测移植患者病毒活动的重要工具。通过qPCR早期检测和监测BK病毒感染，医生可以及时开始治疗。[55] 尿液通常比血液更敏感地检测病毒排泄，尿液中BK病毒水平高的患者未来可能发展为病毒血症。[56] 移植患者中存在共感染的情况很常见，尤其是CMV和BK病毒，这些共感染往往会导致不良后果。[57] qPCR能够快速、定量地监测成人和儿童移植患者的病毒活动，便于及时调整治疗方案。

**5.3. 化疗引起的免疫抑制及相关感染**
侵袭性念珠菌病是一种严重的感染，主要见于接受化疗、患有血液系统恶性肿瘤、严重中性粒细胞减少症或进行骨髓或器官移植的患者。[59] 化疗和免疫抑制治疗常导致并发症，从而延迟诊断并增加死亡风险。[60] 传统的诊断方法往往无法早期检测侵袭性念珠菌病。针对保守核糖体DNA的PCR检测方法是检测低水平真菌的有效方法。[62] 随着快速识别和定量真菌DNA技术的发展，这些分子方法将使医生能够更早地诊断念珠菌血症，确定疾病进展的位置和速度，并在开始抗真菌治疗前区分不同种类的念珠菌。[63] 通过提供这些信息，医生可以选择最合适的治疗方法，降低高风险患者的药物毒性。

**6. qPCR在临床实践中的临床应用和影响**
耳念珠菌（Candida auris）是一种新型多重耐药真菌病原体，2009年首次在日本被发现，随后在全球范围内被报道，尤其是在医疗环境和重症及免疫缺陷患者中。这促使医院采取有效的感染预防和控制措施。因此，需要快速筛查策略，尤其是在临床微生物学实验室中大规模应用。虽然传统的基于培养的方法也可用于筛查C. auris，但检测周期可能长达1-5天，从而延误患者转诊和感染控制措施的实施。[64] 快速分子检测系统因检测效率高、分布广泛和诊断价值高而更适合大规模筛查。[65] 尽管分子检测的初始成本可能高于传统方法，但缩短检测到结果的时间可以缩短住院时间，从而降低医疗成本。全球肺孢子虫和曲霉菌发病率的增加凸显了在免疫缺陷患者中快速、准确识别病原体的必要性。[66] RF2多重qPCR检测方法能够同时检测肺孢子虫和曲霉菌的共感染，在体外和临床检测中均表现出出色的性能。[67] 这类检测方法的应用有助于及时识别感染病原体，从而支持及时开始适当的治疗，更好地利用医院资源，缩短住院时间。

**7. qPCR在机会性感染诊断中的挑战**

**7.1. 由于假阴性结果导致的错误**
假阴性结果是qPCR诊断的局限性，尤其是在临床表现复杂的免疫缺陷患者中。研究表明，针对曲霉菌和其他真菌病原体的qPCR检测方法在检测侵袭性真菌感染时灵敏度存在差异，这主要是由于提取协议的差异和检测标准化不足。[68] 在某些情况下，假阴性结果可能会延误适当的抗真菌治疗，从而增加患者风险。相反，真正的阴性PCR结果可以通过避免对低感染概率患者不必要的抗真菌治疗来支持合理使用抗生素。[69]

**7.2. 假阳性结果的影响**
假阳性结果是一个诊断问题，特别是在能够同时检测多种病原体的多重qPCR平台上。例如，肺炎病原体检测可以在一次测试中识别多种病原体，包括b型流感嗜血杆菌、百日咳博德特氏菌、脑膜炎奈瑟菌和嗜麦芽单胞菌（一种常导致医院内感染的病原体），从而有助于肺炎的诊断。[70] 然而，由于多重qPCR可以检测多种呼吸道病原体，它们无法区分携带病原体与实际感染的情况，也无法区分活菌与坏死或失活组织中的残留DNA。[71] 多重qPCR无法区分携带状态和实际感染的情况可能还受到环境污染、交叉反应（抗体或互补DNA之间的反应）以及实验间微量核酸残留的影响。[72] 因此，必须将多重qPCR的结果与临床、影像学和其他微生物学信息结合起来，以确保准确诊断并避免不必要的治疗。

**7.3. 携带状态与实际感染：qPCR结果的临床解读**
在机会性感染的临床应用中，区分微生物携带状态和实际感染是最大的挑战之一。[73] 高灵敏度的分子检测方法可能检测到低水平的微生物DNA或RNA，这可能反映了携带状态、短暂携带或非活性微生物，而不是实际感染。在免疫缺陷患者中，这种区分尤为重要，因为他们的呼吸道或胃肠道经常出现微生物携带现象。因此，准确解读qPCR结果需要结合更广泛的临床背景信息。临床表现、影像学检查结果（例如，疑似侵袭性真菌疾病的CT成像）、病原体载量的连续定量变化以及炎症生物标志物（如C反应蛋白、前降钙素或真菌标志物（如半乳甘露聚糖、β-D-葡聚糖）应综合考虑。[74] 与其仅依赖二元的阳性/阴性结果，不如通过监测循环阈值（Ct）值的动态变化来更深入地了解疾病进展或治疗反应。使用感染概率评分系统，并由传染病专家、微生物学家、放射科医生和治疗医生组成的多学科团队（MDT）进行讨论，可以进一步提高诊断准确性和治疗决策。这种综合方法可以减少因菌群定植而导致过度治疗的风险，并确保对真正侵袭性感染患者进行及时治疗。

7.4 标准化和实验室间差异
尽管定量PCR（qPCR）在感染性疾病（OI）诊断中得到了广泛应用，但缺乏检测标准仍然是其主要局限性。[75] 核酸提取方案、引物/探针设计、扩增平台、参考基因和定量校准标准的差异可能导致实验室间结果出现显著差异。尽管国际组织和专业协会已致力于协调分子诊断工作流程和外部质量评估项目，但统一实施仍不完善。由于缺乏普遍认可的定量标准和Ct值临界值，跨研究和机构的比较变得复杂。建立标准化方案、经过验证的参考材料和共识报告框架对于提高基于qPCR的诊断的可重复性和临床可靠性至关重要。

8. 下一代诊断技术：qPCR在免疫功能低下患者中的应用
多重qPCR检测技术在免疫功能低下患者的下呼吸道感染诊断和管理方面显示出巨大潜力。[76] 最近开发的多重qPCR平台结合熔解曲线检测技术，能够直接从临床样本中快速定量识别多种病原体和抗菌素耐药基因。[77] 这些技术无需依赖培养即可实现病原体的及时检测，从而支持针对性抗菌治疗和实时监测治疗反应。[78]
在当代临床实践中，多重qPCR越来越多地与更广泛的分子诊断策略相结合，包括宏基因组下一代测序（mNGS）。在这种工作流程中，mNGS可以作为检测未知或非典型病原体的初步无偏方法，而针对性qPCR检测则提供快速确认、病原体定量和长期监测治疗反应的功能。尽管这些检测方法具有快速周转时间和有希望的临床应用前景，但仍需要进一步验证研究来评估它们对抗生素使用管理、患者预后和成本效益的影响。[79] 将多重PCR平台整合到即时检测和数字健康系统中，可能进一步增强高风险人群的快速诊断能力。新兴证据还强调了病毒共感染在HIV晚期患者中的临床重要性，尤其是那些患有HIV相关性新型隐球菌脑膜炎的患者。qPCR检测技术的广泛应用使得能够敏感地检测和量化共感染的病毒，包括CMV和Epstein-Barr病毒，这可能具有重要的预后意义。[80] 病毒载量定量有助于临床医生识别高风险患者，并支持及时的治疗干预。[81]
同时，在免疫功能低下人群中，mNGS已成为一种补充性诊断方法，尤其是在临床表现不典型或针对性检测结果为阴性时。[82] 与需要预定义靶标的qPCR不同，mNGS能够无偏地检测广泛的病原体。在当代临床实践中，mNGS常用于初步病原体发现，而qPCR则用于确认性检测、快速周转和长期监测病原体负担。因此，qPCR和mNGS在综合分子诊断框架内协同发挥作用，而不是相互竞争的技术。后COVID-19时代进一步强调了应对新兴或未知病原体的准备必要性，这些病原体常被称为“疾病X”。[83] 虽然qPCR在确定特定病原体基因序列后能够提供快速、可扩展且高度敏感的检测，但在新出现且尚无验证引物的病原体暴发初期，针对性PCR检测方法存在局限性。在这种情况下，更广泛的基因组监测和发现导向的方法对于初步病原体识别至关重要，之后qPCR可以迅速适应大规模筛查和定量监测。[84] 因此，qPCR应被视为分层诊断策略的核心组成部分，该策略整合了针对性和无偏检测技术以应对新发传染病。展望未来，人工智能（AI）和机器学习方法可能会进一步增强基于qPCR的诊断的临床效果。[85] 将分子结果（如Ct值）、临床参数、炎症生物标志物和影像学检查结果整合到预测算法中，可以支持感染概率建模、风险分层和免疫功能低下患者的预后评估。[86] 随着多模态和多组学数据集的扩展，AI辅助的临床决策支持系统可能将qPCR从独立的分子检测工具转变为精准传染病诊断的关键要素。然而，这些先进分析和分子技术的实施可能因实验室基础设施、技术能力和成本考虑而异。尽管对免疫抑制患者进行常规多重病毒共感染筛查仍需进一步评估，但未来的比较研究应探讨将先进分子诊断技术整合到常规护理中的临床效果、成本效益和治疗影响，尤其是在资源有限的环境中（图3）。

图3：定量实时聚合酶链反应（qPCR）与传统方法的比较诊断性能

9. 结论
作为诊断工具，qPCR的发展显著提高了免疫功能低下患者中OI的检测能力，优于传统的培养或血清学方法，后者无法提供同样快速的定量或定性结果。qPCR为医生提供了更快捷的定量结果，有助于早期诊断和针对高风险患者的针对性治疗。然而，实验室间的差异、对标准化检测的需求以及结果解释中的问题（尤其是在区分菌群定植和活动性感染方面）仍是qPCR作为诊断方法面临的重大挑战。此外，多重PCR和数字PCR技术的进步将通过开发新的成本效益高的即时检测解决方案和集成数据驱动的解释系统，进一步提高准确性和临床实用性。总体而言，qPCR是精准医学的重要组成部分，有助于改善免疫功能低下患者的OI治疗和管理。

致谢
作者感谢Chettinad研究与教育学院提供的实验室设施和技术支持，使本文得以顺利完成。

资金
无

作者贡献
Meganathan Karthikeyan和Praveen Kumar Chandra Sekar参与了手稿的构思和起草，以及图表编辑工作。Ramakrishnan Veerabathiran参与了研究设计，并对文稿的学术内容进行了严格审阅。所有作者均阅读并批准了最终稿件。

利益冲突
无