Properdin缺失或抗Properdin治疗可改善C3功能获得性小鼠模型中非典型溶血尿毒症综合征的疾病

《Frontiers in Immunology》：Properdin deficiency or anti-properdin treatment ameliorates disease in the C3 gain-of-function mouse model of atypical haemolytic uraemic syndrome

　　

摘要 引言： 研究人员先前已证实，围绕与人类非典型溶血尿毒症综合征（aHUS）相关的C3单点突变构建的C3D1115N小鼠完全重现了临床疾病。本研究旨在探讨Properdin在aHUS中的作用。 方法： 将C3D1115N小鼠与Properdin缺陷小鼠杂交，或对C3D1115N小鼠进行抗Properdin单克隆抗体治疗，并追踪其生存率。在设定终点仔细评估肾功能、血清生物标志物和肾脏病理学。采用免疫荧光法评估C3和纤维蛋白的沉积。 结果： 研究发现，去除Properdin可改善疾病，尽管在约6个月的研究期内，有两只小鼠出现肾脏疾病的迹象。在出现临床疾病证据后，使用抗Properdin单克隆抗体（14E1）进行治疗足以阻断疾病的进展，这表明降低补体替代途径C3和C5转化酶的稳定性有助于预防血栓性微血管病（TMA）/aHUS。 讨论： 研究数据表明，在C3功能获得性模型中，疾病进展与消退之间存在精细的平衡。数据也提示，正如在另一个TMA小鼠模型中所指出的，抗Properdin治疗可能为维持补体介导的aHUS缓解提供可行的治疗选择。

一、 研究背景、问题与目的

补体系统是先天免疫的重要组成部分，包括经典途径、凝集素途径和替代途径（Alternative Pathway, AP）。这些途径最终汇集于共同的终末途径，产生C5a并形成膜攻击复合物（Membrane Attack Complex, MAC）。正常的补体功能对宿主防御病原体至关重要，而关键补体调节蛋白的突变或缺失与多种疾病相关。非典型溶血尿毒症综合征（atypical haemolytic uraemic syndrome, aHUS）是一种典型的补体介导疾病，其特征是由于肾脏内皮细胞上AP的激活失控，导致血栓性微血管病（thrombotic microangiopathy, TMA）和急性肾衰竭。针对C5的单克隆抗体eculizumab（及随后的ravalizumab）的问世革命性地改变了aHUS的治疗，但完全阻断终末途径存在增加脑膜炎等严重感染的风险，且该药物并非全球普及。这促使人们寻找针对AP等其他靶点的替代性抗补体疗法。

Properdin是AP的正向调节因子，可稳定AP C3转化酶（形成C3bBbP）和C5转化酶（C3bBbC3bP），在AP的扩增环路（amplification loop, AL）中扮演关键角色。AP/AL贡献了约80%的终末途径激活，这在aHUS的临床疾病发展中起驱动作用。与之相对，补体因子H（Factor H, FH）是AP/AL的主要液相负调节因子，并与Properdin竞争结合C3bBb和C3bBbC3b。因此，在补体介导的aHUS患者中，限制Properdin的可用性可能足以维持低水平或降低的补体激活，同时保留较强的免疫防御能力。先前Song等人课题组的研究表明，在aHUS样小鼠模型中完全阻断Properdin具有高度保护作用。然而，在C3肾小球病（C3G）模型中，Properdin的缺失反而加剧了疾病，这引发了对使用抗Properdin药物治疗某些携带C3或FH罕见变异患者的潜在安全性的担忧。

为验证Properdin在aHUS发病机制中的作用，并评估其作为治疗靶点的潜力，研究人员利用先前开发的C3功能获得性（GOF）小鼠模型（C3^N/N，又称C3^{D1115N/D1115N}）开展了本研究。该模型携带与人类aHUS相关的C3 D1115N点突变，能够完美再现人类aHUS的临床特征，包括自发性TMA、微血管病性溶血性贫血（MAHA）和显著的肾脏C3沉积，超过50%的动物在出生后10周内死亡，且该表型可被C5或C7缺陷所挽救，是验证抗补体药物的理想模型。因此，本研究旨在进一步证明，在C3功能获得性突变的背景下，消除Properdin可能是治疗补体介导的aHUS的一个有效选择。

二、 主要技术方法

本研究运用了遗传学、药理学、病理学和分子生物学相结合的多学科技术手段。首先，通过杂交育种，研究人员成功构建了C3^N/N小鼠与Properdin敲除（P^-/-）小鼠的杂交品系，即C3^N/N.P^-/-小鼠，用以评估Properdin基因缺失对疾病的影响。其次，在治疗性研究中，对已出现临床疾病迹象（连续两天血尿）的C3^N/N小鼠，给予两种不同的抗Properdin单克隆抗体（H4和14E1）或对照抗体进行治疗，并追踪其生存和疾病进展。动物的临床监测包括日常称重、尿液分析（检测蛋白尿和血尿）以及终末血液学分析（如使用i-STAT分析仪检测血尿素氮和血红蛋白）。通过流式细胞术检测网织红细胞和血小板计数，评估溶血状态。利用酶联免疫吸附试验（ELISA）定量分析血浆中总C3、活化C3、总C5和C5a的水平，以评估补体消耗情况。在组织病理学层面，对肾脏组织进行石蜡包埋、切片，并进行PAS和MSB染色，通过半定量评分系统评估肾小球损伤程度。此外，采用免疫荧光技术检测并定量分析肾脏中C3和纤维蛋白的沉积情况。所有实验均获得英国纽卡斯尔大学当地动物伦理委员会和英国内政部的批准，并严格按照相关项目许可证进行操作。

三、 研究结果

1. Properdin缺失显著提高肾脏无病生存率并改善临床指标

生存分析显示，与C3^N/N.P^+/+对照组相比，C3^N/N.P^-/-小鼠的生存率显著提高。在长达约6个月的观察期内，仅有一只C3^N/N.P^-/-小鼠因疑似TMA被处死，另一只在后期出现轻度蛋白尿。而C3^N/N对照组中绝大多数动物在观察期内发生了TMA。临床指标方面，存活的C3^N/N.P^-/-小鼠的血尿素氮水平更低，血红蛋白、血小板计数和网织红细胞百分比等反映MAHA的关键血液学参数也恢复至接近正常水平，表明Properdin缺失可有效预防aHUS典型的临床疾病发生。

2. Properdin缺失显著减轻肾脏TMA的组织病理学证据

组织学分析证实，C3^N/N.P^+/+小鼠肾脏存在明显的TMA特征，包括肾小球毛细血管内微血栓（MSB染色显示纤维蛋白沉积）、基底膜增厚和双轨征等。相比之下，C3^N/N.P^-/-小鼠直至6月龄时，其肾脏均未出现明确的TMA证据，肾小球纤维蛋白沉积显著减少至背景水平。然而，部分老龄C3^N/N.P^-/-小鼠的肾脏出现了一些与C3G（C3肾小球病）更相符的改变，如系膜扩张和细胞增多，提示在长期缺乏Properdin的情况下，可能向C3G样表型缓慢发展。免疫荧光定量分析进一步证实，肾小球纤维蛋白沉积在Properdin缺失小鼠中显著降低，而C3沉积在3月龄时反而略有增加，但并未导致严重的蛋白尿或组织学评分升高。

3. Properdin缺失减少C3和C5的消耗

ELISA检测结果显示，C3^N/N.P^+/+小鼠血浆中总C3、活化C3、总C5和C5a水平显著降低，表明存在显著的补体消耗。而在C3^N/N.P^-/-小鼠中，这种消耗被明显减弱，其C3和C5水平恢复至接近野生型小鼠的水平，其中对C5消耗/C5a生成的改善效应尤为显著。这表明Properdin缺失可能主要通过影响C5转化酶的稳定性，而非C3转化酶，来发挥保护作用。

4. 治疗性清除Properdin可阻断疾病进展

在出现早期临床疾病迹象后，对C3^N/N小鼠进行抗Properdin单克隆抗体治疗。结果发现，使用鼠源抗体14E1进行治疗，能够100%地防止小鼠在8天研究期内发展为终末期疾病，而生理盐水组和同型对照抗体组的生存率则低得多。14E1治疗显著改善了小鼠的肾功能（血尿素氮降低），并使血小板计数恢复至野生型水平，尽管网织红细胞百分比仍略高于正常。同时，治疗组肾脏的纤维蛋白沉积显著减少，C3和C5的消耗也得到部分缓解。这些数据证明，即使在疾病启动后，通过抗体清除Properdin仍能有效阻断aHUS/TMA的快速进展。

四、 讨论与结论总结

本研究证实，在C3功能获得性aHUS小鼠模型中，消除Properdin（无论是通过基因敲除还是抗体治疗）具有明确的疾病改善作用。研究人员认为，其保护机制可能在于：在C3^N/N突变背景下，FH与突变C3b的结合力减弱，导致其在肾内皮细胞表面与Properdin竞争调节C3/C5转化酶的能力失衡，促使过度激活和TMA发生。当去除Properdin后，尽管FH的调节功能仍然受损，但竞争消失使得剩余的FH足以抑制内皮表面的AP过度激活，从而阻止了急性TMA的发生条件。然而，缓慢的、慢性的补体激活（“文火慢炖”式）可能持续存在，导致部分老龄小鼠出现C3G样病理改变，这提示长期使用抗Properdin疗法需谨慎评估其潜在风险。

研究结果强调了Properdin，特别是其稳定AP C5转化酶的功能，在补体介导的aHUS发病中的关键作用。数据支持了在另一个aHUS模型（FH^R/R小鼠）中的发现，共同表明靶向Properdin可能是治疗aHUS的一种有前景的策略。与完全阻断终末途径（如抗C5疗法）相比，抗Properdin疗法可能提供一种更“精细”的调节方式，在抑制致病性AP/AL过度激活的同时，保留更多的基础免疫防御功能。然而，鉴于Properdin在其他疾病模型（如C3G、动脉粥样硬化）中显示出保护作用，其长期、全身性应用的安全性仍需在更广泛的临床前和临床研究中仔细评估。

结论翻译：

总体而言，我们的数据证实Properdin在补体介导的aHUS中起关键作用，可能是通过其稳定AP C5转化酶和/或阻止FH接触AP C3和C5转化酶的功能来实现的。抗Properdin疗法在短期治疗中是有效的，因此在AP和AL过度活跃的急性或局部情况下，可能具有明确的治疗效用。