从野外采集到实验室分析之间的热历史过程，对冬季休眠期间葡萄芽和韧皮部组织的耐寒性评估具有关键性影响

《Journal of Plant Growth Regulation》：Thermal History Between Field Collection and Laboratory Analysis Critically Impacts Cold Hardiness Assessment in Grapevine Bud and Phloem Tissues During Mid-Winter Dormancy

　　摘要
尽管在理解葡萄藤的耐寒机制方面已经取得了相当大的进展，但采样后的处理条件对冻害耐受性测量结果可靠性的影响却相对较少受到关注。在这项研究中，我们比较了三种葡萄品种（‘Narince’、‘Alphonse Lavallée’和‘Trakya ?lkeren’）在经过两种处理方案后进行受控冷冻测试（-16至-24°C）时的芽和韧皮部组织的存活率、水分含量、电导率和碳水化合物状态：一种是在+4°C下进行为期一周的受控冷藏处理，另一种是直接在田间处理而不进行受控储存。通过切片和电解质泄漏检测，评估了初级、次级和三级芽以及韧皮部组织的活力。处理方案和冷冻温度显著影响了所有活力参数。受控储存的样本表现始终优于田间处理的样本，所有组织类型的存活率大约为60%对比40%。临界损伤阈值出现在-20至-22°C之间，而死亡率在-24°C时达到峰值，无论采用哪种处理方案。田间处理的样本保持了较高的组织水分含量，并显示出升高的电导率，这表明运输过程中的加热-冷却循环引发了部分去适应过程，并改变了测试前的生理基线。碳水化合物分析揭示了品种特异性的模式；‘Narince’积累了最高的总碳水化合物量，并在所有组织类型中表现出更强的耐寒性。这些发现表明，从田间采集到实验室分析之间的热历史引入了显著且系统性的偏差，因此采样后立即稳定温度对于获得准确和可重复的冻害耐受性数据至关重要。这种偏差在品种、组织类型和年份间的一致性强调了在耐寒性研究和实际霜冻风险评估中采用标准化样本处理方案的必要性。

引言
耐寒性是葡萄藤组织在休眠期间能够存活于冷冻温度下的关键适应机制，对温带地区的品种选择和葡萄栽培成功具有根本性影响（Ferguson等人，2014年；Karimi，2020年）。休眠中的葡萄藤芽和组织承受低温的能力通常通过致死温度（LT50）来量化，该温度定义为导致50%芽死亡的温度（Mills等人，2006年；Kaya等人，2024年）。在休眠期间，葡萄藤经历复杂的生理变化，包括组织水分含量减少、抗冻溶质的积累以及代谢重组，这些变化共同增强了耐寒性（Wolpert和Howell，1986年）。这些适应过程是动态的，并且依赖于品种，会响应光照周期缩短和逐渐暴露于低温等环境信号（Fennell，2004年）。已经开发了多种方法来评估耐寒性，包括通过检测芽中的低温放热（LTE）进行差热分析（DTA）、反映膜完整性丧失的电解质泄漏（EL）测量以及组织变色的视觉评估（Jun等人，2021年，2024年）。葡萄藤的复合芽结构由初级、次级和三级分生组织组成，这些组织被保护性鳞片包裹，并具有不同的耐寒水平，这进一步复杂化了评估策略（Mills等人，2006年）。此外，韧皮部组织的耐寒性是葡萄藤存活潜力的关键指标，因为冬季对形成层和次级韧皮部的损伤会显著影响后续的发芽、形成层重新激活和产量形成（Gonzalez Antivilo等人，2020年；Kose等人，2024年）。因此，了解不同组织类型中的品种特异性耐寒模式对于制定有效的冬季保护策略和旨在将葡萄栽培扩展到边缘气候区的育种计划至关重要。葡萄藤耐寒性的生化基础涉及碳水化合物代谢和水分关系的协调变化，这些变化在休眠期间作为基本的抗冻机制。非结构性碳水化合物，特别是可溶性糖和淀粉储备，同时具有能量来源和渗透调节的作用（Hamman等人，1996年；Wample和Bary，1992年）。在冷适应过程中，淀粉通过酶促水解生成可溶性糖，包括蔗糖、葡萄糖、果糖和棉子糖家族寡糖，这些糖作为抗冻剂，增加细胞渗透势，降低冰点，并稳定膜结构（Kaya，2020a，2020b）。季节性监测显示，随着冬季中期最大耐寒性的发展，可溶性糖浓度显著增加，然后在春季去适应过程中下降（Bennett等人，2005年）。与碳水化合物动态同时发生的是，组织水分含量大幅减少，通常减少50-80%，这是通过调节脱水过程实现的，该过程减少了可冻结水分并最小化了冰晶的形成（Wolpert和Howell，1986年）。这种主动调节的水分损失涉及细胞壁通透性的变化和细胞外液的重分布，减少的水分含量与提高的耐寒性之间的相关性在多个品种中得到了一致证明（Chalfant和Dami，2021年）。尽管有大量研究阐明了这些生理机制，但在耐寒性评估之前的样本处理和储存条件方面的方法学考虑仍然不完全清楚。标准协议规定，茎样本应立即分析或在受控冷藏（1-4°C）下短期保存（Mills等人，2006年；Kaya和K?se，2017年）。虽然在+4°C下储存长达24小时不会显著改变LTE值（Londo等人，2023年），但长时间的储存可能会通过部分去适应影响测得的耐寒性（Kaya和K?se，2020年）。储存期间的水分含量变化是一个关键问题，因为切下的芽会迅速失去大量水分，显著影响LTE值（Kovács等人，2002年；Kaya和K?se，2017年）。此外，储存引起的生理变化可能因品种和组织类型而异，反映了膜稳定性、碳水化合物动员和脱水耐受性的差异，这在比较耐寒性数据或预测田间冻害时引入了很大的不确定性。因此，本研究旨在系统地评估在耐寒性评估之前对葡萄藤茎进行短期冷藏（+4°C一周）是否会影响与组织水分含量相关的LT50值，以及不同品种、芽和韧皮部组织之间的差异。另一方面，在冷冻测试之前，确定了所有品种的芽和韧皮部组织中的可溶性糖、淀粉和总碳水化合物浓度。这些分析旨在描述采样时葡萄藤茎的碳水化合物状态，并量化芽和木质组织中的糖、淀粉和总碳水化合物储备。尽管准确的耐寒性预测对葡萄园管理决策具有重要的农业和经济意义，但直接比较现场新鲜样本分析与标准化冷藏方案的研究仍然非常有限，而且之前没有研究系统地量化了不同样本处理程序在多种组织类型和品种中引入的偏差程度，特别是对于包括Vitis vinifera和种间杂交品种在内的多样化种质。这项为期两年的研究（2024-2025年）的具体目标是：（1）确定在+4°C下冷藏一周是否改变了‘Alphonse Lavallée’、‘Trakya ?lkeren’和‘Narince’葡萄品种的初级、次级和三级芽及韧皮部组织的LT50值，通过芽切片和电解质泄漏进行评估；（2）量化储存引起的组织水分含量变化；（3）描述采样时芽和木质组织的非结构性碳水化合物状态。了解短期冷藏如何与组织水分状态和碳水化合物储备相互作用以影响测得的耐寒性，将有助于提高在研究和田间条件下的耐寒性评估方案的可靠性。

材料与方法
植物材料和实验地点
本研究在连续两年（2024年和2025年）进行，以评估葡萄藤的耐寒性及其与组织水分状态的关系。实验在土耳其萨姆松市Ondokuz May?s大学农业学院的研究葡萄园进行（41.364295° N，36.191687° E），使用了三种Vitis vinifera L.品种，即‘Trakya ?lkeren’、‘Narince’和‘Alphonse Lavallée’（图1）。为了评估葡萄藤芽和韧皮部组织的耐寒性，采用了两种不同的实验方法进行冷冻测试。在第一种方法中，使用从葡萄园采集的休眠一年生茎立即进行耐寒性评估。在第二种方法中，从葡萄园采集的茎在冷藏室中以+4°C储存一周后进行冷冻测试，以减少组织水分含量。水分含量仅在冷冻处理前测定，因此没有在不同温度水平上进行评估。这种实验设计能够评估短期冷藏对芽和韧皮部组织耐寒性的潜在生理变化。休眠一年生茎在冬季休眠期采集，具体是在萨姆松地区最冷的二月。采集的茎立即运输到实验室并用作实验材料。对于田间处理方案，茎样本在环境温度（2-8°C）下运输，运输时间不超过45分钟，并在田间采集后2-3小时内开始冷冻测试。使用切片和电解质泄漏方法评估了初级、次级和三级芽以及韧皮部组织的冷冻诱导损伤。为了确定采样时葡萄藤组织的碳水化合物状态，仅在直接从葡萄园采集的新鲜茎上进行了生化分析。准备了茎子样本，以量化所有品种的芽和韧皮部组织中的可溶性糖、淀粉和总非结构性碳水化合物。这些分析旨在描述采样时期的碳水化合物储备，并为解释耐寒性反应提供生化框架。

图1
这张图像的替代文本可能是使用AI生成的。
全尺寸图像
在受控冷冻胁迫后，对葡萄藤芽和韧皮部组织的存活能力进行了立体显微镜评估。代表性的立体显微镜切片图像和示意图展示了葡萄藤初级芽（P）和韧皮部组织在受控冷冻处理后的不同存活状态。上图显示了从田间种植的葡萄藤中收集的组织样本的实际显微镜观察结果。组织存活能力基于颜色差异和结构完整性进行评估，其中绿色组织表示具有完整膜和代谢活性的存活细胞，而棕色至深棕色变色表示冷冻引起的细胞坏死和组织死亡。下图展示了健康（左）与受损（右）组织状态的标准化示意图，包括初级芽和韧皮部组织。通过检查中央分生组织区域的颜色变化和结构破坏来评估初级芽。韧皮部组织的评估侧重于维管传导元素的完整性和存活组织中的特征性绿色，以及受损样本中的棕色变色。这些评估标准系统地应用于所有样本，以确定致死温度阈值（LT50）并量化不同环境和处理条件下的耐寒性反应。

实验设计和冷藏处理
在冷冻测试之前，将茎分成单芽段并用铝箔包裹，以防止组织和芽的水分损失（Quamme，1983年；Gonzalez Antivilo等人，2020年）。采样后，茎被分成两组实验组。第一组直接进行人工冷冻测试。第二组样本在-4°C的冷藏室中储存了一周，以便在冷冻测试前减少组织内的自由水含量。冷藏室保持恒定的温度为+4±0.5°C，相对湿度约为85-90%。对于每个品种、处理方法和温度组合，每个重复实验至少准备了10个单芽段，每个处理有三次重复，因此每个处理组合共评估了30个芽。整个实验在连续两年（2024年和2025年）内进行。

**人工冷冻测试**
人工冷冻测试使用了一个可编程的冷冻和解冻装置（UTEST UTD-1440，土耳其）。该装置被设定为从环境温度开始，然后温度以每小时+4°C的速度逐渐降低，在1小时内降至+4°C。样本在该温度下稳定9小时。随后，温度依次降至0°C、-4°C、-8°C、-12°C、-14°C、-16°C、-18°C、-20°C、-22°C和-24°C，直到达到最终温度-24°C，遵循之前建立的协议（Karimi 2020；Kaya和K?se 2020）。单芽切割样本在每个目标温度下保持60分钟。在-16°C、-18°C、-20°C和-24°C时，样本在达到目标温度后立即从装置中取出。对照样本在整个实验过程中保持在+4°C（Sarikhani等人，2014；Ershadi等人，2016）。

**芽和韧皮部损伤评估（横截面分析）**
每个芽在立体显微镜（Olympus SZ30，Olympus，日本）下使用剃刀片水平切割。通过视觉评估了初级芽、次级芽和三级芽以及韧皮部组织的活力（图1）。呈现绿色的芽被归类为有活力的，而呈现深棕色或黑色的芽则被认为是死亡的。芽的死亡率以百分比表示，计算方法为死亡芽的数量与检查的芽总数的比率（K?se和Güleryüz，2009；Karimi 2020；Uray和K?se，2024）。重要的是，活力评估并不是在从冷冻室取出后立即进行的。按照既定协议，冷冻样本首先在+4°C下逐渐解冻12小时，然后在室温（20-22°C）下再保持24小时，以便在横截面视觉评估之前让受损组织发生氧化褐变。韧皮部损伤使用Mills等人（2006）描述的四点评分标准进行评估：
1 = 无损伤，
2 = 轻微韧皮部损伤，
3 = 50%韧皮部损伤，
4 = 100%韧皮部损伤。

导致50%损伤的温度（LT50）是根据Mancuso和Fiorino（2000）的方法使用插值曲线计算得出的。

**芽和组织水分含量的测定**
取样后立即记录芽和枝条组织的新鲜重量（FW）。芽和枝条组织分别称重。然后将样本在65°C下烘干48小时，直至重量恒定，以获得干重（DW）。组织水分含量使用以下公式计算并表示为百分比：
$$\text{水分含量} (\%) = \frac{\text{FW} - \text{DW}}{FW} \times 100$$

**电解质泄漏（EL）分析**
分别对冬芽和枝条组织进行了电解质泄漏分析。对于每个重复实验，从节间取三个长度为1厘米的枝条段放入含有40毫升蒸馏水的试管中。此外，将0.5克的芽样本放入含有10毫升蒸馏水的塑料管中。所有样本在室温下孵育24小时。孵育后，使用电导率计测量初始电导率（EC1）。然后将样本在121°C下高压灭菌20分钟以释放总电解质。冷却至室温后，测量最终电导率（EC2）。电解质泄漏使用以下公式计算为百分比：
$$ \text{EL}(\%) = \frac{\text{EC}_1}{\text{EC}_2} \times 100 $$
（根据Saltveit（2002）的方法）。

**总可溶性糖和淀粉的测定**
样本在60°C下烘干48小时，然后使用配备40目筛网的实验室研磨机磨成细粉（IKA，Staufen，德国）。每次分析使用0.2克粉末材料。使用8毫升80%（v/v）乙醇在60°C下提取可溶性糖，每次提取30分钟，遵循Candolfi-Vasconcelos和Koblet（1990）描述的程序。可溶性糖的定量使用Leyva等人（2008）描述的花酮比色法进行。淀粉的提取通过将剩余的颗粒与8毫升1摩尔过氯酸在60°C下孵育1次来进行两次。随后使用相同的花酮基方法测定淀粉含量。在620纳米处使用分光光度计测量吸光度，并使用葡萄糖生成可溶性糖和淀粉测定的标准校准曲线。

**数据分析**
LT（致死温度）值的测定是通过对暴露于不同温度的样本的损伤率和温度步骤的数据集应用回归模型来进行的。根据这些值生成插值曲线，并使用回归模型获得的插值系数和R2值计算LT50值。通过方差分析（ANOVA）评估不同因素（品种、应用方法和年份）对初级芽存活率的影响及其潜在的交互作用。统计分析使用R Studio中的集成统计软件包进行。当通过ANOVA确定统计显著性时，使用Tukey的HSD测试进行事后比较，以探索各组之间的全面差异。为了可视化不同分类变量下初级芽、次级芽和韧皮部存活率的分布，使用ggplot2在R Studio中创建了多层次甜甜圈图。这些可视化展示了总体存活率（内圈：是/否）及其按特定类别的细分（外圈）：温度处理（图a）、品种类型（图b）、应用方法（图c）和实验年份（图d）。

**结果**
电导率和水分含量的测量显示，不同年份、应用方法、品种和温度之间存在显著差异。年份对芽和枝条的电导率都有明显影响，2024年的值显著高于2025年（芽为55.38 vs 36.72；枝条为48.37 vs 26.88，p < 0.01）。相反，2024年的芽水分含量（38.25%）显著低于2025年（46.67%，p < 0.01），而枝条的水分含量在两年间没有显著差异。应用方法显著影响了大多数参数，除了枝条的电导率。田间采集的样本显示出更高的芽电导率（47.78 vs 44.32）、芽水分含量（45.50% vs 39.42%）和枝条水分含量（49.88% vs 46.92%），与控制储存条件相比（p < 0.01）。在品种中，只有芽电导率显示出显著差异，‘Alphonse Lavallée’（48.84）的值高于‘Narince’（42.03，p < 0.01），而‘Trakya ?lkeren’（47.26）处于中间水平。暴露温度对两种组织类型的电导率都有显著影响，从-16°C到-24°C逐渐增加。芽电导率在-16°C时为39.31，在-24°C时为53.46，而枝条的值在同一温度范围内从30.26增加到46.31（p < 0.01）。在品种（‘Alphonse Lavallée’、‘Narince’和‘Trakya ?lkeren’）和应用方法（控制和处理）之间没有芽电导率的差异（图2）。在品种（‘Alphonse Lavallée’、‘Narince’和‘Trakya ?lkeren’）和应用方法（控制和处理）之间，除了‘Trakya ?lkeren’在田间条件下外，也没有枝条电导率的差异。-24°C下的电导率高于-16°C（图3）。在应用方法（控制和处理）和年份（2024年和2025年）之间，除了2024年的田间条件外，没有芽水分含量的差异。在2024年的田间条件下，‘Trakya ?lkeren’的芽水分含量高于‘Alphonse Lavallée’（图4）。在应用方法（控制和处理）和年份（2024年和2025年）之间，除了2024年的控制条件外，没有枝条水分含量的差异。在2024年的田间条件下，‘Trakya ?lkeren’的枝条水分含量高于‘Alphonse Lavallée’（图5）。

**碳水化合物组成**
在碳水化合物组成方面观察到显著的品种差异。对于芽组织，‘Narince’显示出最高的总糖含量（39.06 mg g?1），显著高于‘Alphonse Lavallée’（20.27 mg g?1）和‘Trakya ?lkeren’（36.12 mg g?1）。相反，‘Alphonse Lavallée’显示出最高的淀粉浓度（51.02 ± 1.33 mg g?1），而‘Trakya ?lkeren’记录的最低（31.36 mg g?1）。‘Narince’的总碳水化合物含量最高（83.97 mg g?1），‘Alphonse Lavallée’和‘Trakya ?lkeren’显示出较低的类似值。在枝条组织中也出现了类似的模式，‘Alphonse Lavallée’的总糖含量显著高于‘Narince’和‘Trakya ?lkeren’（35.41 mg g?1 vs 39.03 mg g?1和24.11 ± 2.03 mg g?1）。‘Narince’积累了最高的枝条淀粉含量（39.03 mg g?1），而‘Trakya ?lkeren’的淀粉含量显著降低（24.11 ± 2.03 mg g?1）。与其它品种相比，‘Trakya ?lkeren’的总碳水化合物含量显著较低（50.67 mg g?1）。年度间的变化也很显著。2025年的芽和枝条组织总糖含量均高于2024年，而淀粉水平则呈现相反趋势。芽的总碳水化合物含量在两年间保持稳定，但在2025年显著增加（图6）。

**芽和韧皮部组织的活力**
跨芽类型的活力评估显示了明显的温度依赖性死亡模式。初级芽的整体存活率为38%，其活力从-16°C的42.67%急剧下降到-22°C以下的最低存活率。死亡率在-24°C时达到峰值（32.13%），表明在-20°C和-22°C之间存在一个关键的损伤阈值（图7a）。品种比较显示，Narince（37.01%）和Alphonse Lavallée（35.85%）的初级芽存活率优于Trakya ?lkeren（27.14%），后者显示出最高的死亡率（37.17%）（图7b）。与田间条件相比，控制条件显著提高了存活率（61.8% vs 38.2%），相应的死亡率也降低了（图7c）。2024年的初级芽存活率明显高于2025年（64.6% vs 35.4%）（图7d）。次级芽的分析显示，总体存活率略有提高（42%），各处理间的死亡率为58%。温度依赖性的响应与初级芽的模式密切相关，最佳存活率在-16°C（39.36%），随后在-18°C（33.38%）、-20°C（17.95%）和-22°C（8.91%）下降，到-24°C时存活率最低（34.06%）。-24°C时的最大死亡率为34.06%，而-16°C时的死亡率最低（6.11%）（图8a）。次级芽这种略微提高的耐寒性可能反映了赋予适度保护优势的发育或结构差异。品种排名与初级组织中观察到的趋势一致，Narince显示出最高的存活率（37.77%），其次是Alphonse Lavallée（33.91%）和Trakya ?lkeren（28.32%）。在死亡的次级芽中，Trakya ?lkeren再次显示出最高的敏感性（36.93%），而Alphonse Lavallée（32.92%）和Narince（30.15%）显示出改善的耐受性（图8b）。环境效应仍然明显，控制条件下有60.4%的次级芽存活，而田间条件下的存活率为39.6%（图8c）。年份效应与初级芽的观察结果一致，2024年的次级芽存活率显著高于2025年（67.2% vs 32.8%），相应的死亡率在2025年（62.3% vs 2024年）也有所增加（图8d）。

**结论**
这些结果提供了关于不同因素对芽和枝条组织在冷冻过程中的影响以及不同品种间差异的详细信息，有助于进一步理解植物的耐寒性和生理机制。品种表现排名在不同芽位上保持稳定，其中Narince的次级芽存活率最高（37.76%），其次是Alphonse Lavallée（32.99%）和Trakya ?lkeren（29.25%）。死亡率分布与这些模式相反，Trakya ?lkeren的损失最大（36.43%），其次是Alphonse Lavallée（33.59%）和Narince（29.98%）（图9b）。环境条件继续产生显著影响，在控制条件下，59.4%的次级芽存活，而在田间条件下为40.6%；同时，田间的死亡率（57.1%）超过了控制条件下的损失（42.9%）（图9c）。时间模式与其他芽类型观察到的情况一致，2024年的次级芽存活率（66.1%）高于2025年（33.9%），2025年的死亡率（62.2%）也高于2024年（37.8%）（图9d）。韧皮部组织表现出明显的耐寒性，总体存活率为63%，仅有37%的死亡。温度依赖性损伤虽然存在，但相对于其他芽类型有所减弱，存活的韧皮部在各种温度处理下的分布更为均匀：-16°C（29.81%）、-18°C（26.64%）、-20°C（20.22%）、-22°C（16.09%），其余在-24°C。尽管在-24°C时死亡率最高（41.93%），但温度依赖性损失的程度明显低于其他芽类型（图10a）。品种效应在韧皮部组织中也有所体现，Narince的存活率最高（37.29%），其次是Alphonse Lavallée（31.66%）和Trakya ?lkeren（31.04%）。死亡率模式进一步证实了品种的耐寒性排名，Trakya ?lkeren的韧皮部死亡最多（37.25%），紧随其后的是Alphonse Lavallée（36.19%），而Narince的耐寒性更强（死亡率为26.54%）（图10b）。环境因素仍然具有影响力，在控制条件下，58.2%的韧皮部存活，而在田间条件下为41.8%。田间条件导致了64.1%的韧皮部死亡，而在控制条件下为35.9%（图10c）。年份效应保持了既定的模式，2024年的韧皮部存活率（59.9%）高于2025年（40.1%），而2025年的死亡率（67.0%）显著高于2024年（图10d）。

**图9**
**图10**

**讨论**
**田间与控制储存对耐寒性参数的影响**
田间采集的样本与控制储存样本之间的显著差异为了解葡萄藤组织的冷适应动态提供了重要见解。田间样本的芽电导率（47.78 vs 44.32）、芽含水量（45.50% vs 39.42%）和枝条含水量（49.88% vs 46.92%）明显高于在控制条件下储存一周的样本。这些差异表明，储存期间的后收获生理变化会显著改变与耐寒性评估相关的组织特性。田间样本的电导率升高可能反映了在原位持续进行的冷适应过程，而控制储存可能会中断这些适应机制。电导率已被验证为多种水果物种冻伤的可靠指标。Nesbitt等人（2002年）和Lee等人（2013年）证明了电解质泄漏与耐寒性之间的强相关性，指出该方法适用于连续、无损的监测。在葡萄藤中，Sternios和Howell（1973年）记录了‘Concord’品种茎部电导率随温度下降的对数增长，而Ahmedullah和Kawakami（1986年）在-5°C以下的根组织中也观察到了类似的模式。这些温度依赖性反应与我们的发现一致，即芽的电导率在-16°C时为39.31，在-24°C时为53.46，枝条的电导率在同一温度范围内从30.26增加到46.31。田间样本在极端温度下的电导率增幅更大，表明这些组织对冻伤的敏感性更高，可能是由于更活跃的代谢状态增加了膜的脆弱性（表1）。

表1 不同年份、处理方式、品种和温度下的电导率（在芽和枝条中）及含水量（在芽和枝条中）

田间样本与储存样本之间的含水量差异是另一个关键区别，这与电导率反应相关。田间采集的组织含有更高的水分可能表明其保持了活跃的代谢过程或减少了脱水应力。水分关系从根本上影响耐寒性，因为在适应过程中细胞脱水会减少细胞内冰晶的形成（Reynolds等人2014年；Zhang等人2025年）。控制储存可能促进了部分脱水，无意中通过减少细胞水分可用性改变了表观耐寒性。需要注意的是，这种储存引起的脱水是一种被动物理过程（从切除的组织中蒸发水分），可能偶然类似于主动适应过程中的脱水。因此，应谨慎解释控制储存样本中降低的含水量，因为它可能并不反映真正的生理改善，而是储存条件的结果。这种储存引起的脱水可以解释储存样本中较低的电导率值，因为降低的含水量通常与冻伤后的电解质泄漏减少相关。Guo等人（1989年）对多种葡萄属物种的研究表明，虽然温度依赖性的电导率反应遵循一致的对数模式，但绝对值会随组织生理状态而变化，这支持了储存条件显著改变这些关系的观察。芽电导率的年份×处理方式交互作用进一步强调了这种复杂性。储存引起的变化幅度在不同实验年份之间有所不同，可能反映了采集时初始组织生理状态的差异。自然适应期间的环境条件显著影响了随后对储存和冻伤的反应。2024年的电导率值显著高于2025年（55.38 vs 36.72），而芽的含水量却较低（38.25% vs 46.67%），这种反向关系表明2024年的组织经历了更严重的脱水和解膜不稳定，可能反映了更严重的冬季前环境压力。Barranco等人（2005年）和Ebel等人（2004年）报告了橄榄和柑橘类在冻伤压力加剧时电解质泄漏的逐步增加，指出预处理环境因素影响了膜损伤的程度。

**碳水化合物组成与耐寒性**
不同品种之间的碳水化合物组成差异揭示了葡萄藤组织中糖代谢与耐寒性之间的基本关系。Narince的芽总糖含量最高（39.06 mg g^-1），显著高于Alphonse Lavallée（20.27 mg g^-1）和Trakya ?lkeren（36.12 mg g^-1），而Alphonse Lavallée的淀粉浓度最高（51.02 mg g^-1）。可溶性糖和淀粉储备之间的对比反映了不同的冷适应代谢策略，这与观察到的耐寒性差异直接相关。Narince中较高的可溶性糖含量与葡萄藤中的已知耐寒机制一致。可溶性碳水化合物在冻伤压力期间具有多种保护功能，作为渗透压调节剂降低细胞液的冰点，稳定膜结构，并保护蛋白质免受脱水损伤（Fennell 2004年；Kaya和K?se 2017年）。多项葡萄品种的研究表明，可溶性碳水化合物含量与芽死亡率之间存在强烈的负相关（Ershadi等人2016年；Rende等人2018年），这与本研究中Narince较高的芽存活率（37.01%）一致。值得注意的是，可溶性糖含量与存活率之间的正相关提供了直接证据，表明采样时的碳水化合物储备可以预测组织的耐寒性。像‘Bronx Seedless’和‘Cardinal’这样的耐寒品种表现出较高的可溶性碳水化合物水平，这与我们的观察结果一致，即Narince和Alphonse Lavallée的存活率优于Trakya ?lkeren。不同品种之间淀粉和可溶性糖含量的负相关反映了冷适应期间淀粉的动态动员过程。在低温暴露下，多糖通过β-淀粉酶的作用水解为可溶性糖，增加了细胞质的渗透势并降低了细胞冰点（Zhang等人2012年；Liang等人2020年）。在葡萄藤木质组织中的研究表明，冷适应期间淀粉的分解与蔗糖、葡萄糖、果糖和棉子糖家族寡糖的积累同时发生（Hamman等人1996年；Todaro和Dami 2017年）。Alphonse Lavallée的高淀粉含量（51.02 mg g^-1）表明其有大量的储备碳水化合物可供转化，而Trakya ?lkeren的低淀粉水平（31.36 mg g^-1）可能在冷压力下限制了可溶性糖的合成能力。这种代谢限制可能部分解释了Trakya ?lkeren较高的死亡率（37.17%）与其他品种相比的原因。

**年份间的碳水化合物代谢动态**
不同年份之间观察到的碳水化合物代谢动态进一步揭示了冷适应过程。2025年的芽和枝条组织总糖含量均高于2024年，而淀粉水平则呈现相反趋势。这种模式与在多种木质物种（包括杨树、Cornus sericea和柳树）中观察到的冷诱导淀粉降解一致（Sauter等人1998年）。2025年可溶性糖的积累增加表明淀粉动员更为活跃，可能是由促进冷适应的环境条件驱动的。研究表明，温度循环而非持续的低温暴露触发了更有效的冷适应反应，伴随着淀粉和糖代谢的变化（De Rosa等人2022年；Ren等人2023年）。年份特定的碳水化合物组成差异可能反映了冬季前温度模式的变化，这些变化影响了代谢冷适应的程度和时机。2024年的电导率值显著高于2025年（55.38 vs 36.72），而芽的含水量较低（38.25% vs 46.67%），这种反向关系表明2024年的组织经历了更严重的脱水和膜不稳定，可能反映了更严重的冬季前环境压力。Barranco等人（2005年）和Ebel等人（2004年）报告了橄榄和柑橘类在冻伤压力加剧时电解质泄漏的逐步增加，指出预处理环境因素影响了膜损伤的程度。

**样品处理协议对耐寒性评估的影响**
样品处理期间的环境条件显著影响了芽的存活率测量，在所有组织类型中，控制条件始终支持更高的存活率。在控制条件下，初级芽的存活率为61.8%，而在田间条件下为38.2%；次级芽为60.4% vs 39.6%，次级芽为59.4% vs 40.6%，韧皮部组织为58.2% vs 41.8%。这种系统性模式表明，从田间采集到实验室评估之间的温度管理对耐寒性评估至关重要。这些发现与先前的报告一致，表明植物组织在突然的温度波动后会发生显著的生理变化（Ashworth和Wisniewski 1991年；Knight等人1996年；Minorsky 1989年）。观察到的存活率差异表明，田间采集的样本在运输过程中经历了升温-降温循环，触发了脱适应过程，随后在控制冷冻测试中表现为死亡率升高。这一解释得到了葡萄藤休眠芽中已记录的机制的支持，即在部分冷却后升温会导致冰晶下的水分释放，从而迅速恢复组织水分（Ide等人1998年；Ishikawa等人1997年；R?is?nen等人2006年）。在初始冷冻过程中达到的脱水状态在组织暴露于升温时无法维持，因为补水速度超过了冷适应的恢复速度（Andrews和Proebsting 1987年；Ide等人1998年）。处理协议之间观察到的大约23%的差异幅度超过了通常归因于品种差异或测量误差的变化，表明温度历史是测量耐寒性的主要决定因素。

在控制条件下观察到的增强存活率反映了通过收集后立即稳定温度成功保存了组织的冷适应状态。控制样本直接转移到+4°C的稳定储存环境中，最小化了脱适应温度的影响，保持了田间冷适应期间达到的生理状态。这种方法防止了由于温度升高导致的适应能力下降，这种下降影响了在采集和运输过程中受到环境温度影响的野外样本。先前的研究表明，休眠的芽在温度升高时会迅速失去抗寒性，在5°C的温度下，抗寒性在第一个小时内就会显著下降（R?is?nen等人，2006年）。本研究通过量化样本处理过程中热暴露的实际后果，进一步证实了这一点，表明即使是很短的时间内的温度升高也会大幅降低测得的抗寒性。初级芽（提高23.6个百分点）、次级芽（提高20.8个百分点）和三级芽（提高18.8个百分点）的存活优势的一致性表明，热历史效应并不是特定于某种组织的，而是反映了植物对温度变化的根本生理反应。韧皮部组织也表现出类似的模式，在受控条件下存活率提高了16.4个百分点，尽管其总体存活率（63%）仍高于芽组织，这表明维管组织具有更强的抗寒性。这些观察结果与一些报告一致，即逐渐冷却至允许细胞外冰形成的温度的植物组织能够承受比经历快速温度变化的组织更大的冻害（Tyler等人，1988年）。然而，本研究的结果与Havis（1964年）的发现有所不同，Havis发现直接暴露在-18°C下的杜鹃花组织全部死亡，而逐渐冷却的组织能够在接近-40°C的温度下存活；而我们的野外样本尽管经历了温度升高，但其存活率虽然降低但并未完全消失。

不同处理方式之间的差异性死亡模式对于解释抗寒性数据和发展实际的霜冻管理策略具有关键意义。在受控条件和野外条件下，样本存活率之间的50-60%相对差异表明，当样本在处理过程中经历温度波动时，标准实验室协议可能会系统性地高估其野外存活潜力。这种系统性偏差可能导致基于实验室评估的不适当的品种推荐或不足的霜冻保护措施。采样条件与受控储存条件之间的温度差异（通常基于冬季采集时的环境温度为2-4°C）足以导致测得的抗寒性出现显著差异，这证实了先前的研究结果，即超过2°C的温度差异可以改变组织的抗冻能力（Ashworth和Wisniewski，1991年；Fl?istad和Kohmann，2001年）。这些发现表明，如果在采集和评估之间的时间间隔内没有保持样本的温度，就无法准确测定野外暴露组织的实际抗寒性。在野外样本处理过程中施加的升温-降温应力可能会增加细胞内冰晶的重新结晶潜力，从而导致在后续的冷冻测试中形成更大的冰晶并造成更大的细胞损伤。这一机制可以解释在野外处理的样本中所有组织类型都观察到的死亡率升高现象。此外，即使在相对较短的时间内，长时间暴露在非最佳温度下也会导致与在恒定低温下保持的组织相比产生显著不同的损伤结果（Pomeroy等人，1975年；Aroora，2018年）。多个品种和年份中的一致性模式进一步强化了这样一个结论：热历史效应是抗寒性研究中的基本考虑因素，而不是特定实验条件的产物。

结论

我们的研究结果表明，样本在葡萄园和实验室之间的处理方式对抗寒性测量有着直接且重大的影响。储存在+4°C下的葡萄组织保持了大约60%的活力，而野外处理的样本活力则降至约40%，无论芽的类型或韧皮部组织如何。这种差异很可能是由于在野外运输过程中不可避免的升温-降温循环所引起的部分适应能力下降所致。在所有处理方式中，关键的冻害发生在-20至-22°C之间；在品种中，Narince表现出最强的抗寒性，其次是Alphonse Lavallée和Trakya ?lkeren。野外处理样本中记录的较高组织水分含量和电导率值进一步证实，即使是短暂的温度波动也会改变样本组织的生理基线。综合这些发现，强烈建议在采集后立即稳定样本温度——如果不采取这一步骤，实验室测试可能会系统性地高估野外样本的存活能力，从而导致错误的品种推荐或不充分的霜冻保护措施。我们认识到，我们的研究依赖于最常用的抗寒性指标，要全面了解抗寒性的机制，未来的工作需要研究单个糖分谱、抗氧化代谢、活性氧动态以及抗寒相关基因的表达，以明确适应能力下降在样本处理过程中的具体机制。