骨细胞维生素K依赖性γ-羧化通过GAS6调控骨吸收的新机制

《Bone Research》：Vitamin K-dependent carboxylation in osteoblasts regulates bone resorption through GAS6 in male mice

维生素K在骨稳态中的作用备受关注但机制不明。为探究γ-羧化在骨重塑中的功能及其关键Gla蛋白，研究人员以骨细胞特异性Ggcx敲除雄性小鼠为模型展开研究。结果表明，骨细胞γ-羧化缺失导致骨量增加，源于破骨细胞数量减少。研究鉴定出GAS6是骨细胞分泌的γ-羧化因子，其通过激活前体破骨细胞的TAM受体促进破骨细胞融合。该工作揭示了GAS6是调控破骨细胞成熟的新型骨细胞来源维生素K依赖性蛋白。

　　

骨骼的健康依赖于成骨细胞主导的骨形成和破骨细胞主导的骨吸收之间的精密平衡，这一过程称为骨重塑。一旦平衡被打破，便可能导致骨质疏松等严重骨骼疾病。研究表明，多种微量营养素，包括维生素，在骨骼健康中扮演着角色。其中，维生素K（Vitamin K, VK）与骨骼健康的关联在人群中早有观察，例如较低的VK摄入或血清水平与骨密度降低或骨折风险增加相关。然而，关于VK补充剂是否对骨骼有益，临床研究结果却相互矛盾。其根本原因在于，VK影响骨密度和/或骨质量的分子与细胞机制至今仍未阐明。

在脊椎动物细胞中，VK唯一明确的功能是作为γ-谷氨酰羧化酶（γ-glutamyl carboxylase, GGCX）的辅因子，催化特定蛋白质中谷氨酸（Glu）残基转化为γ-羧化谷氨酸（Gla）残基。骨钙素（Osteocalcin, OCN）是一种由成骨细胞分泌的丰富Gla蛋白，但遗传学研究表明其并非骨量累积或周转的主要调节因子。那么，VK究竟通过何种机制、哪个（些）Gla蛋白来影响骨骼健康呢？为了解决这些问题，研究人员在雄性小鼠中进行了深入研究，相关成果发表在《Bone Research》上。

为了开展研究，作者运用了多种关键技术方法。在动物模型上，他们构建并使用了骨细胞特异性Ggcx敲除小鼠（Ggcx^flox/flox;OCN-Cre）和肝脏特异性过表达Gas6的转基因小鼠（ApoE-Gas6^Tg）。通过显微计算机断层扫描（μCT）和组织形态计量学对小鼠骨骼进行了全面的静态和动态分析。在细胞分子层面，研究采用了成骨细胞与骨髓细胞的共培养体系、原代破骨细胞诱导分化、以及基于Ctsk-Cre和tdTomato报告基因的细胞融合实时监测技术。此外，还利用定量PCR（qPCR）、蛋白质印迹（Western blot）和酶联免疫吸附测定（ELISA）进行了基因表达、蛋白检测和磷酸化信号通路分析。

研究结果

VK循环的酶主要在成骨细胞中表达

研究人员首先检测了GGCX及其还原酶VKORC1在骨细胞中的表达。qPCR和蛋白质印迹结果均显示，Ggcx和Vkorc1在增殖期前成骨细胞和矿化成骨细胞中的表达水平，比骨髓来源单核细胞或完全分化的破骨细胞高十倍至四十倍，表明VK依赖性羧化主要发生在成骨细胞谱系中。

成骨细胞中GGCX的失活导致小鼠骨密度增加

为了探究成骨细胞中γ-羧化的作用，研究人员构建了骨细胞特异性Ggcx敲除小鼠。在6月龄雄性小鼠中，组织学和μCT分析显示，与对照相比，Ggcx^fl/fl;OCN-Cre小鼠的椎骨和股骨远端骨小梁骨量增加，骨小梁间距减小，数量增多，连接密度升高，而骨小梁厚度未受影响。这些数据表明，成骨细胞中VK依赖性羧化的缺失与骨量增加相关。

Ggcx^fl/fl;OCN-Cre小鼠骨吸收减少

通过骨骼动态组织形态计量学分析发现，Ggcx^fl/fl;OCN-Cre小鼠的骨形成参数（如骨形成率、成骨细胞数量）基本正常，但破骨细胞数量（N.Oc/B.Pm）和表面（Oc.S/BS）均显著减少。血清I型胶原C端交联肽（CTX）水平的降低也独立证实了破骨细胞活性的下降。这表明，成骨细胞γ-羧化缺失导致的骨量增加，主要源于破骨性骨吸收的减少。

体外实验中，缺乏Ggcx的成骨细胞支持破骨细胞生成的能力下降

在成骨细胞与野生型骨髓细胞的共培养体系中，缺乏GGCX的成骨细胞支持破骨细胞形成的能力显著降低，产生的破骨细胞数量减少了约三倍。有趣的是，缺乏骨钙素（OCN）的成骨细胞则完全支持破骨细胞生成。此外，GGCX的缺失并不影响成骨细胞中关键破骨细胞生成因子RANKL、OPG和M-CSF的表达。这表明，γ-羧化通过一种独立于骨钙素和已知促破骨细胞生成因子的机制，正向调节破骨细胞形成。

γ-羧化蛋白GAS6由成骨细胞表达和分泌，并激活其在前体破骨细胞上的受体

研究人员在成骨细胞中筛查了所有已知γ-羧化蛋白的编码基因，发现生长停滞特异性蛋白6（Growth Arrest Specific 6, GAS6）在成骨细胞中表达并可被分泌。同时，前体破骨细胞和分化中的破骨细胞表达GAS6的受体——TAM家族酪氨酸激酶受体AXL和MerTK。用重组γ-羧化GAS6刺激前体破骨细胞，可快速诱导AXL、MerTK及其下游信号分子AKT的磷酸化，证明在成骨细胞和破骨细胞前体之间存在功能性的GAS6-TAM信号轴。

GAS6信号在体外促进破骨细胞形成

在共培养体系中，加入TAM受体抑制剂LDC1267（泛TAM抑制剂）或R428（bemcentinib，选择性AXL抑制剂）可剂量依赖性地抑制破骨细胞形成。相反，在原代破骨细胞分化体系中，外源添加重组γ-羧化GAS6能剂量依赖性地增加破骨细胞的面积、数量以及每个破骨细胞所含的细胞核数量，即促进了更大破骨细胞的形成。更重要的是，在GGCX缺陷的成骨细胞共培养体系中添加GAS6，可以完全恢复破骨细胞的数量。

GAS6增加体外前体破骨细胞的融合

GAS6对破骨细胞分化标志基因的表达影响甚微，但显著增加了每个破骨细胞的核数。通过一个巧妙的细胞融合报告系统（将Ctsk-Cre和Rosa26^{CAG-lox-stop-lox-tdTomato}骨髓细胞混合培养），研究人员实时监测了细胞融合事件。结果表明，在培养液中添加重组GAS6可显著增加荧光阳性融合细胞的数量，证明GAS6信号促进了前体破骨细胞的融合。

GAS6在体内促进破骨细胞形成和骨吸收

为了在体内验证GAS6的作用，研究人员使用了ApoE-Gas6^Tg转基因小鼠，该小鼠血清和骨髓中具有生物活性的γ-羧化GAS6水平显著升高。6月龄雄性转基因小鼠表现为骨小梁骨量减少、骨表面积密度降低、破骨细胞数量和表面积显著增加，而骨形成参数未受影响。这正好是Ggcx^fl/fl;OCN-Cre小鼠表型的镜像。该结果证明，增加骨髓中GAS6的水平足以刺激体内破骨细胞的形成，从而导致骨密度降低。

研究结论与意义

本研究揭示了维生素K依赖性羧化在骨重塑中一个先前未知的功能。研究人员发现，成骨细胞中VK依赖的γ-羧化对于正常骨形成并非必需，而是通过分泌γ-羧化的GAS6蛋白，作用于前体破骨细胞上的TAM受体（主要是AXL和MerTK），促进前体破骨细胞的融合，从而正向调控破骨细胞的成熟和骨吸收活性。这一定向的细胞间信号通路，将成骨细胞的羧化状态与破骨细胞的生成紧密耦合起来。

该研究具有多重重要意义。首先，它首次确定了GAS6是成骨细胞来源的、调控破骨细胞成熟的维生素K依赖性蛋白，为理解VK与骨骼健康之间长期存在争议的关联提供了关键的分子机制解释。其次，研究揭示了骨重塑中一种新的细胞间通讯方式，即由成骨细胞γ-羧化状态控制的GAS6-TAM信号轴，这为骨吸收的精细调控增添了新的维度。最后，这些发现为骨质疏松等骨代谢疾病的治疗提供了新的潜在靶点。例如，干预GAS6的γ-羧化过程或其与TAM受体的相互作用，可能成为调节骨吸收的新策略。同时，研究也部分解释了为什么长期使用华法林（VK拮抗剂）的患者骨折风险会增加，因为该药物可能通过抑制GAS6等蛋白的羧化，破坏了正常的骨重塑平衡。尽管研究存在仅使用雄性小鼠等局限性，但它无疑为维生素K生物学和骨代谢领域开辟了新的重要研究方向。