通过在线LC-ESI-QTOF-MS2引导的鉴定、分离以及HPLC定量分析，从泰国波罗蜜（Artocarpus thailandicus，Ma-Had-Thai）中快速发现了酪氨酸酶抑制剂和抗氧化剂

《Microchemical Journal》：Rapid discovery of tyrosinase inhibitor and antioxidant from Artocarpus thailandicus (Ma-Had-Thai) by using at-line LC-ESI-QTOF-MS2 guided identification, isolation and HPLC quantitative analysis

　　鲁塔纳蓬·钱塔库尔（Ruttanaporn Chantakul）|萨西普拉帕·马尔旺桑（Sasiprapa Martwangsang）|昆拉亚妮·彭贾乔姆（Kunlayanee Punjajom）|尼特拉·农查姆农（Nitra Neungchamnong）|帕特拉维·通昂（Pattravee Thong-on）|塔曼努恩·伦桑（Tammanoon Rungsang）|皮亚卡塞特·苏克萨坦（Piyakaseth Suksathan）|南塔卡·科拉纳（Nantaka Khorana）|贾鲁帕·维约奇（Jarupa Viyoch）|朱卡林·斯里维莱（Jukkarin Srivilai）

泰国帕尧大学药学院化妆品科学系，化妆品科学与天然产物研究创新中心，帕尧56000

摘要

泰国波罗蜜（Artocarpus thailandicus，当地称为Ma-Had-Thai）长期以来在泰国传统医学中被用于治疗皮肤疾病和寄生虫感染；然而，其化学标记物和生物活性成分的特性仍然知之甚少。在这项研究中，开发了一种快速的生物活性靶向策略，使用在线LC-ESI-QTOF-MS2平台结合双生物测定法来检测酪氨酸酶抑制作用和DPPH自由基清除能力。将生物活性导向的分馏与在线工作流程相结合，实现了潜在生物活性标记物的高效快速分离。首次鉴定出氧白藜芦醇（oxyresveratrol）是具有抗氧化和抗酪氨酸酶活性的主要化合物。定量HPLC分析显示，氧白藜芦醇是主要成分，在心材中的含量最高。心材提取物表现出最强的生物活性，其酪氨酸酶抑制活性约为曲古酸（kojic acid）的797倍，抗氧化活性约为抗坏血酸（ascorbic acid）的2到4倍。在细胞实验中，氧白藜芦醇显著减少了UVB刺激的B16F10黑色素瘤细胞的黑色素生成，显示出比曲古酸更强的效果。此外，氧白藜芦醇还显著抑制了人角质形成细胞中的活性氧（ROS）生成，其活性与Trolox相当。这些发现表明氧白藜芦醇是泰国波罗蜜的双重功能生物标记物，在区分泰国波罗蜜与其近缘且常被误鉴定的物种Artocarpus lacucha（Ma-Had）方面具有重要作用。总体而言，在线LC-ESI-QTOF-MS2和生物测定平台为复杂天然提取物中生物活性标记物的快速有效鉴定提供了方法，并支持早期药物发现。

引言

黑色素是人类体内的天然色素，由黑色素细胞合成，主要包括pheomelanin（红黄色）和eumelanin（棕黑色）。eumelanin是皮肤、头发和眼睛呈现黑色的主要色素，通过吸收有害的紫外线（UV）辐射发挥重要的光保护作用[1]。它在黑色素细胞内通过酶调控的黑色素生成过程合成，并随后转移到皮肤外层，形成肤色。过量的黑色素生成会导致色素沉着，表现为黄褐斑、老年斑、雀斑和炎症后色素改变[2][3]。这些状况通常会导致显著的心理社会压力和生活质量下降[4]。酪氨酸酶（E.C. 1.14.18.1）是黑色素生成过程中的关键限速酶，通过单酚酶和二酚酶活性调节色素沉着[5]。它还催化多巴胺氧化为活性多巴醌，从而在黑色素合成过程中产生氧化应激。特别是紫外线照射（尤其是UVB）会进一步增加活性氧（ROS）和一氧化氮（NO），从而增强酪氨酸酶活性并促进黑色素生成[1]。最新研究表明，烟酰胺核苷酸转氢酶（nicotinamide nucleotide transhydrogenase）通过UVB和黑色素细胞诱导的转录因子独立机制介导的氧化还原反应参与色素沉着[6]。因此，有效的黑色素生成抑制策略通常针对酪氨酸酶活性和氧化应激途径。目前治疗色素沉着的方法主要集中在酪氨酸酶抑制上[7]。然而，其他策略如阻断黑色素细胞向角质形成细胞的转移、加速表皮更新、应用抗氧化剂、抗炎剂或多组分靶向机制也在广泛探索中[7][8]。氢醌和曲古酸被临床用作脱色剂，但其长期使用受到副作用的限制，包括皮肤刺激、接触性白癜风和外源性褐黄病[7][8]。这些安全问题突显了寻找天然和合成来源的新颖高效黑色素生成抑制剂的持续研究需求。许多已知的酪氨酸酶抑制剂，包括α-阿尔布汀（α-arbutin）、氢醌和曲古酸，都来自天然来源[9][10]。尽管有许多机会从天然产物中发现新的抑制剂[9]，但缺乏快速有效的生物测定筛选平台常常阻碍了进展。

生物活性筛选平台在药物活性成分发现的早期阶段起着关键作用，尤其是在处理化学成分复杂的天然提取物时[11]。传统的生物测定导向分馏方法对于富含多种次生代谢物的植物样本仍然很有价值；然而，这种方法通常耗时且资源密集，需要反复进行分离、纯化、结构鉴定和生物活性评估[12][13]。为了克服这些限制，高分辨率筛选（HRS）作为一种集成策略出现，将色谱分离、高分辨率化学检测（如质谱）和生物活性评估结合到一个协调的工作流程中[12]。HRS平台通常分为在线和离线两种形式。在这两种方法中，都使用液相色谱（LC）分离复杂混合物，并将洗脱液分成两路分别进行质谱检测和生物活性测试。在线系统中，生物测定直接在流动路径中进行，通常与荧光检测器等检测器耦合；而在离线系统中，分馏后的洗脱液收集到微孔或纳米孔板上进行离线生物活性评估，从而减少酶或测定降解的风险[14]。HRS平台已成功应用于多种生物测定，能够快速鉴定生物活性化合物，包括类固醇5α-还原酶抑制剂[15]、抗氧化剂[14][16]、抗菌剂[17]、乙酰胆碱酯酶抑制剂[18]和磷酸二酯酶5抑制剂[19]。通过将色谱特征与生物反应相关联，HRS生成生物活性谱，有助于在复杂混合物中定位活性成分。除了基于一维LC的方法外，还开发了多维色谱技术，特别是二维液相色谱（2D-LC），以进一步提高分离能力和分辨率[20]。当与高分辨率生物活性分析结合使用时，这些先进系统可以提供更高的峰容量和更精确的生物活性成分鉴定[20]。然而，这类多维平台通常涉及更高的仪器复杂性、更长的分析时间和更高的运营成本。在本研究中，一维HRS方法被认为足以实现主要生物活性成分的有效筛选和鉴定。总体而言，HRS是一种强大且高效的方法，适用于化学性质异质的样品表征和新型生物活性分子的快速发现。

波罗蜜属（Artocarpus，桑科）是具有药用和美白效果的生物活性化合物的丰富来源[21]。该属包含约76种物种，分布于东南亚的热带和亚热带地区[22]。著名的成员包括面包果（Artocarpus altilis）、菠萝蜜（Artocarpus heterophyllus）和猴子杰克果（Artocarpus lacucha），广泛应用于食品、健康和传统医学[23]。它们的植物化学成分以黄酮类和茚三酮类为主，包括artocarpin、artocarpanone和氧白藜芦醇，这些成分具有多种药理活性[24]。目前泰国已报道了14种波罗蜜物种[25]。泰国波罗蜜（Artocarpus thailandicus C.C. Berg）是一种本地特有的物种，由荷兰植物学家Cornelis Christiaan Berg教授于2005年首次描述，该物种基于1990年在泰国北部清迈省Doi Chiang Dao采集的标本[26]。它经常与Artocarpus lacucha混淆，因为两者具有相似的形态和相同的俗名“Ma-Had”。区分这两种物种的主要特征是：果实外皮的颜色（泰国波罗蜜为白色，而Artocarpus lacucha为棕色）、雄花序的柄长（泰国波罗蜜最长0.3厘米，Artocarpus lacucha为0.6-1.5厘米）以及雌花序的柄长（泰国波罗蜜为0.3-0.7厘米，Artocarpus lacucha为1-4厘米）[25]。尽管《泰国植物志》中有分类更新，但由于它们在形态和系统发育上的相似性，误鉴仍然普遍[27]。这种混淆对制药、化妆品和食品行业的质量控制有重要影响。传统上，泰国波罗蜜被用于治疗寄生虫感染和皮肤疾病[27][28]，但其化学特征仍不明确。此前发现它含有α-阿尔布汀和β-阿尔布汀，这两种物质已知具有酪氨酸酶抑制作用[29]。然而，其全面的化学指纹图谱及其完整的酪氨酸酶抑制和抗氧化特性尚未确定。目前尚无该物种的标准提取物和验证的分析方法。

为解决这些知识空白并支持未来的制药和化妆品应用，本研究应用了在线LC-ESI-QTOF-MS2平台结合酪氨酸酶抑制和抗氧化生物测定法，快速鉴定泰国波罗蜜的生物标记物和整体化学特征。从MS2数据中初步鉴定的生物标记物随后通过光谱技术进行分离和结构确认，验证了在线工作流程的有效性。开发了一种稳健的HPLC方法，使用分离出的化合物作为参考标准，比较不同植物部位的生物活性标记物含量。此外，还评估了纯化的生物标记物和植物提取物抑制UVB诱导的黑色素生成的能力，进一步突显了泰国波罗蜜的皮肤学潜力。本工作的整体工作流程示意图见图1。

材料

乙腈、水、乙醇、盐酸、乙酸乙酯、二氯甲烷、己烷和甲醇（LC-MS级/HPLC级/分析级（AR级）购自RCI Labscan（泰国曼谷）。甲酸和茴香醛（AR级）购自Merck（德国达姆施塔特）。2,2-二苯基-1-吡啶基肼（DPPH）、二甲基亚砜（DMSO）、2,2'-偶氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐（ABTS）、Folin-Ciocalteu试剂、pH 6.8的磷酸盐缓冲液、L-DOPA等试剂均购自相应供应商。

植物提取和生物活性评估

泰国波罗蜜是一种本地特有的植物物种，在研究前由合格的植物学家进行了分类鉴定。将植物材料分为心材、树皮、枝条和叶子，分别提取各部分以评估其生物活性，包括通过DPPH和ABTS+自由基清除测定法评估的抗酪氨酸酶活性和抗氧化能力。提取产量分析显示，树皮提供的产量最高。

结论

本研究旨在寻找生物标记物，并全面鉴定植物不同部位的化学成分及其质量控制。泰国波罗蜜的心材提取物在所研究的植物部位中表现出最明显的抗酪氨酸酶和抗氧化活性。在线LC-ESI-QTOF-MS2平台有效地促进了生物标记物的快速定位、靶向分离和结构表征，首次实现了这一目标。

作者贡献声明

鲁塔纳蓬·钱塔库尔（Ruttanaporn Chantakul）：撰写——原始草稿、方法学、研究、概念化。萨西普拉帕·马尔旺桑（Sasiprapa Martwangsang）：撰写——审阅与编辑、方法学、研究、概念化。昆拉亚妮·彭贾乔姆（Kunlayanee Punjajom）：撰写——审阅与编辑、方法学、研究。尼特拉·农查姆农（Nitra Neungchamnong）：撰写——审阅与编辑、方法学、研究。帕特拉维·通昂（Pattravee Thong-on）：撰写——审阅与编辑、方法学、研究。

利益冲突声明

作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。

致谢

作者感谢泰国科学研究与创新基金、帕尧大学（基本基金2026（FF69），授权号2399/2568）以及帕尧大学在玛哈·查克里·西林霍恩公主（Her Royal Highness Princess Maha Chakri Sirindhorn）皇家倡议下的植物遗传保护项目的支持，授权号RSPG69002。此外，作者还感谢人工智能在语言编辑和手稿准备方面的帮助。