沈连（SL）方剂通过调节巨噬细胞的M1极化及肾小管上皮细胞的焦亡来治疗糖尿病肾病

《Journal of Diabetes Research》：Shenlian (SL) Decoction Treat Diabetic Nephropathy by Regulating M1 Polarization of Macrophages and Pyroptosis of Renal Tubular Epithelial Cells

　　摘要

目的
本研究旨在探讨沈连（SL） decoction在调节细胞焦亡和巨噬细胞M1极化方面的有效性，以及其在治疗糖尿病肾病（DN）中的作用机制，通过动物实验和细胞实验来阐明这一机制。

方法
使用TCMSP和Swiss Target数据库预测SL decoction的潜在靶点。通过GeneCards数据库获取与DN相关的差异基因，并通过富集分析探索SL decoction治疗DN的潜在机制。使用db/db小鼠在体内评估SL decoction治疗DN的有效性及其对巨噬细胞极化和焦亡的调节作用。在体外培养RAW264.7细胞系和TCMK-1细胞系，以研究SL decoction对M1巨噬细胞极化的抑制作用以及肾小管上皮细胞（TECs）的烧亡效应。

结果
富集分析结果表明，Toll样信号通路是SL decoction治疗DN的主要作用通路。动物实验和细胞实验结果显示，SL decoction具有改善DN患者肾功能的作用，同时可降低血清炎症因子浓度。此外，SL decoction还能抑制巨噬细胞的浸润及其向M1表型的极化。SL decoction还抑制了TLR4信号通路的激活和肾小管细胞的焦亡。

结论
本研究通过网络药理学及体内和体外实验证实，SL decoction能够改善DN患者的肾功能。其作用机制与调节DN肾脏中巨噬细胞的M1极化及抑制肾小管上皮细胞的焦亡有关。

1. 引言
糖尿病肾病（DN）是糖尿病的常见并发症之一，对微血管系统有严重影响，是全球慢性肾病（CKD）的主要原因。据统计，约30%-40%的糖尿病患者会发展成DN，其中5%-10%最终会进展为终末期肾病（ESRD）[1]。最新研究表明，肾小管上皮细胞（TECs）死亡和间质炎症促进了DN的发展，而焦亡是TECs死亡的重要机制。焦亡是一种由炎症诱导的细胞死亡途径，其特征是细胞肿胀和起泡、细胞膜形成孔洞、炎症小泡的激活以及促炎细胞因子的释放[2]。NLRP3炎症小泡的激活是诱导细胞焦亡的重要途径，当NLRP3被激活时，会招募接头分子ASC，激活蛋白酶caspase-1，触发Gasdermin D（GSDMD）形成膜孔洞，并介导IL-1β和IL-18的分泌，导致细胞质泄漏，最终使细胞扁平化[3]。炎症是诱导焦亡的主要原因，TLR4能够识别炎症因子并激活NF-κB，从而引发焦亡[4]。巨噬细胞在与DN相关的免疫反应中起着重要作用。肾脏内的巨噬细胞可分为两类：驻留巨噬细胞和浸润巨噬细胞。在DN初期，驻留巨噬细胞可以迅速被激活[5]。同时，升高的葡萄糖水平还会刺激TECs分泌趋化因子（CCL2和CCL5），进而诱导循环单核细胞在肾脏中形成浸润巨噬细胞。根据功能，巨噬细胞可分为两类：促炎型（M1）和抗炎型（M2），后者具有抑制炎症、促进纤维化和修复的作用[7]。研究表明，M1巨噬细胞能够激活TECs中的NLRP3炎症小泡，从而导致TECs的焦亡[8]。沈连（SL） decoction是一种由黄连根和人参组成的草药配方。先前的研究表明，SL decoction可以调节db/db小鼠的肠道菌群平衡，并提高血清LPS和IL-1β水平，表明SL decoction可能通过调节肠道菌群来减轻炎症[9]。黄连根中的活性成分小檗碱已被证明可以降低NF-κB活性[10]，并抑制NLRP3、caspase-1和GSDMD的表达，从而抑制细胞焦亡[11]。人参中的活性成分人参皂苷Rg1和Rg3已被证明可以降低DN大鼠的PI3K、NF-κB和TNF-α水平[12-14]。人参皂苷Rg5已被证明可以通过降低NLRP3、ASC、caspase-1和炎症因子（IL-1β和IL-18）的表达来抑制糖尿病肾病肾脏中的细胞焦亡[15]。这些研究结果共同表明，SL decoction可能通过抑制炎症过程来延缓DN的进展。本研究旨在确定SL decoction在DN管理中的疗效。为此，我们进行了一系列动物和细胞实验，发现SL decoction通过抑制TLR4信号通路、调节巨噬细胞M1极化和抑制肾小管上皮细胞的焦亡来发挥其肾脏保护作用。

2. 材料与方法
2.1 网络药理学
我们通过TCMSP（https://old.tcmsp-e.com/tcmsp.php）和Pubchem Server（https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）检索了SL decoction的活性成分和化学公式。药代动力学筛选标准为口服生物利用度（OB）≥30%和药物相似性指数（DL）≥0.18。使用Swiss Target Prediction（http://www.swisstargetprediction.ch/）预测活性成分的靶基因，筛选标准为概率>0。从GeneCards（https://www.genecards.org/）中检索与DN相关的靶基因，查询词为“Diabetic nephropathy”，并保留相关性评分>1的条目。通过STRING平台（https://cn.string-db.org/）探索SL decoction在DN管理中的治疗靶点。在控制参数下分析SL decoction成分与DN发病机制之间的交集靶点：生物体限制为Homo sapiens，交互作用置信度≥0.7（文本挖掘除外）。通过DAVID资源（https://david.ncifcrf.gov/）进行基因本体（GO）和京都基因组百科全书（KEGG）分析以进行生物学解释。分析结果通过生物信息学可视化门户（https://www.bioinformatics.com.cn/）以图形方式呈现，明确了关键的生物过程和信号通路。

2.2 药物
黄连根和人参购自北京康美制药有限公司。根据我们现有文献中的记录[9]，由北京中医药大学研究实验中心确定了代表性化学成分的含量。溶液通过双层棉纱过滤，收集滤液并浓缩至与原始草药相同的浓度（4.3 g/kg），然后储存在4°C以备后续使用。盐酸二甲双胍片（0.5 g/片，上海施韦普斯制药有限公司，国家药品代码H20023370）称重1.5 g并压碎。将盐酸二甲双胍溶解在蒸馏水中，配制成19.5 mg/mL的悬浮液，储存在4°C并在室温下使用，同时搅拌以确保均匀性。悬浮液每周制备一次。

2.3 动物实验
从常州Cavins实验动物公司购买了18只8周大的雄性db/db（C57BLKS）小鼠，这是一种自发的2型糖尿病小鼠品系，体重为35-40 g。此外，还购买了20-25 g的野生型db/m小鼠。这些小鼠被饲养在北京市中医药大学东直门医院（SYXK(Beijing)2020-0013）的SPF级环境屏障动物实验室中，采用12小时光照/黑暗周期。动物提供常规饮食和饮用水。基础饮食由65%的糖和水分化合物、24.2%的蛋白质和10.3%的脂肪组成，由北京华福康生物科技有限公司提供（编号1022）。动物实验方案获得了北京市中医药大学动物福利委员会的批准（编号21-19）。在10周龄时，通过尾静脉采集小鼠血液样本，测量其空腹血糖水平以确认是否存在自发性高血糖。血糖水平超过16.7 mM提示糖尿病。从第10周开始，db/db小鼠被随机分配到三个组：蒸馏水对照组（10 mL/kg）、二甲双胍治疗组（0.195 g/kg）和SL decoction治疗组（4.3 g/kg SL decoction）。正常组由6只db/m小鼠组成。所有治疗均通过灌胃给药9周。小鼠剂量（g/kg）= 9.1 × 人类临床剂量（g/kg）。每2周测量一次尾静脉血糖水平。此外，每3周使用代谢笼收集小鼠尿液样本，检测尿肌酐和尿白蛋白水平。在给药9周后，让小鼠禁食12小时，然后用3%（1.6 mL/kg）戊巴比妥钠溶液麻醉，最后收集样本。从Cavins实验动物公司购买了20只SD大鼠，随机分配到两个治疗组：10只接受SD补品灌胃，10只接受蒸馏水灌胃。所有治疗每天给药两次，持续7天。在最后一次给药前禁食12小时，通过无菌技术从腹主动脉采集血液，随后以3000 rpm离心15分钟2小时。分离血清后，通过0.22 μm微孔过滤膜进行过滤和去污，以获得空白血清和含药血清，然后冷冻在-20°C以备后续使用。

2.4 细胞培养
细胞系从北京协和医学院细胞资源中心（属于国家科学技术基础设施，国家生物医学细胞系资源NSTI-BMCR，http://cellresource.cn）获取，时间为2023年5月15日。小鼠肾小管上皮细胞系TCMK-1购自武汉Xavier（STCC20015P-1）。细胞培养在含有10%无内毒素胎牛血清（FBS）的DMEM培养基（DMEM；Pricella，中国）中进行，该血清已去除补体。所有细胞在37°C和5% CO2条件下培养，用于后续实验。

2.5 生化和氧化应激指标
麻醉后，从小鼠眼中取出眼球并收集血液。血液在室温下放置1小时，然后以3000 rpm离心15分钟。上清液提取后，使用南京建诚（南京，中国）的肌酐测定试剂盒（C011-1）、BUN测定试剂盒（C013-2，南京建健，南京，中国）、丙二醛（MDA）比色测定试剂盒（E-BC-K025-M，Elabscience，武汉，中国）、总超氧化物歧化酶（T-SOD）、过氧化氢酶（CAT）比色测定试剂盒（编号E-BC-K031-M，Elabscience，武汉，中国）、白细胞介素1β（IL-1β）ELISA试剂盒（E-MSEL-M0003，Elabscience，武汉，中国）、白细胞介素6（IL-6）ELISA试剂盒（E-MSEL-M0001，Elabscience，武汉，中国）和肿瘤坏死因子α（TNF-α）ELISA试剂盒（E-MSEL-M0002，Elabscience，武汉，中国）进行检测。

2.6 尿蛋白指数测定
在药物干预第九周，收集每组的6小时尿液样本，在4°C下以3000 rpm离心15分钟。计算尿液体积，然后转移上清液进行尿肌酐和微量白蛋白检测。使用上海Enzyme-Link生物科技有限公司的尿微量白蛋白试剂盒（项目编号ML063626-2）测定白蛋白/尿肌酐比率（ACR）和6小时尿总蛋白量（6hUTP）。

2.7 肾脏病理
小鼠肾脏组织固定在4%甲醛中。经过常规脱水和包埋后，制备4-μm切片，并进行一系列染色技术，包括苏木精-伊红（H–E）、Masson三色染色和过碘酸-希夫（PAS）染色。H–E染色液（D006）、Masson染色液（D026-1-2）和Aisin蓝-糖原染色液（D033-1-1）购自南京建诚生物工程研究所。染色工作按照制造商的说明在北京市中医药大学的关键学科实验室进行。后续分析使用bx51光学显微镜（OLYMPUS，日本）获取图像。

2.8免疫组化（IHC）和免疫荧光（IF）

对于IHC，组织切片首先进行常规抗原修复处理，然后用3%过氧化氢孵育以阻断内源性过氧化物酶的活性，接着用BSA封闭，随后与TLR4抗体（1:2000；Santa，ab92726）、p-NF-κB p65抗体（1:2000；sc-136548，Santa）、NF-κB p65抗体（1:2000；A2547，ABclonal）、GSDMD-N抗体（1:1000；CQA6563，cohesion）、caspase-1抗体（1:2000；CPA5426，cohesion）和NLRP3抗体（1:2000；bs-6655，Bioss）孵育过夜。之后用PBS冲洗三次，再与相应的二抗孵育，并用DAB处理以显色。在重新染色细胞核后，用中性香脂封闭切片，并使用Leica显微镜获取图像。对于IF，组织切片同样进行抗原修复处理，然后用3%过氧化氢在室温下封闭，再用BSA封闭，随后在4°C下与CD68抗体（1:200；28058-1-AP，ProteinTech）和NOS2抗体（1:500；SC-7271，Santa）孵育过夜。用PBS冲洗三次后，再与相应的二抗孵育，再次用PBS冲洗三次，并用CY3-Tyramine信号放大剂（TSA）和/或FITC-TSA处理。细胞核用DAPI重新染色，切片用抗荧光剂封闭，最后在Leica荧光显微镜下拍摄图像。

2.9. 西部印迹（Western Blots）

细胞在冰上使用含有蛋白酶抑制剂（GRF101，Yase）和磷酸酶抑制剂（GRF102，Yase）的RIPA裂解缓冲液（C1053，Applygen）裂解30分钟。裂解液转移到1.5毫升离心管中，以12,000 rpm的速度在4°C下离心10分钟，收集上清液。使用BCA蛋白浓度测定试剂盒（B5000，LabLead）测定蛋白浓度后，将30微克的组织裂解液与5x SDS-PAGE变性蛋白上样缓冲液（B1012，Applygen）混合。样品加载到10%聚丙烯酰胺凝胶上，通过SDS-PAGE分离后转移到NC膜（Millipore No. HATF00010）上。用含有1%吐温的5.0%牛奶封闭后，加入一抗TLR4抗体（1:2000；sc-293072，Santa）、p-NF-κB p65抗体（1:2000；sc-136548，Santa）、NF-κB p65抗体（1:2000；A2547，ABclonal）、GSDMD-N抗体（1:1000；CQA6563，cohesion）、caspase-1抗体（1:2000；CPA5426，cohesion）、NLRP3抗体（1:2000；bs-6655R，Bioss）和β-actin抗体（1:2500；ab9485，Abcam），并在4°C下孵育过夜。加入HRP羊抗兔IgG（H+L）（AS014，ABclonal）或HRP羊抗鼠IgG（H+L）（AS003，ABclonal）并在室温下孵育2小时后，逐滴加入ECL化学发光底物（extra-ultrasensitive）（biosharp BL520A）到膜上，然后放入Gel Doc成像系统（Bio-Rad）中进行拍照。使用ImageJ软件进行半定量分析。

2.10. RNA提取和实时定量聚合酶链反应（qRT-PCR）

根据制造商的说明，使用AFTSpin动物组织/细胞快速RNA提取试剂盒（RK30120，ABclonal）从动物组织和细胞中提取总RNA。使用ABScript III RT Master Mix for qPCR with gDNA Remover试剂盒（RK20429；ABclonal）进行逆转录反应。我们构建了特异性引物（表1，引物序列），并使用2x Universal SYBR Green Fast qPCR Mix（RK21203，ABclonal）进行实时荧光定量PCR。相对表达水平通过2-delta delta CT方法计算，每组实验重复三次以上。表1. qRT-PCR引物序列。

2.11. 统计分析

数据呈正态分布时，以平均值±标准差表示。使用单因素方差分析（one-way ANOVA）比较多组数据，并通过Fisher的最小显著差异检验进行多组间差异的比较。差异在p < 0.05时被认为是显著的。分析使用SPSS 23.0统计软件。

3. 结果

3.1. 网络药理学分析显示SL煎剂调节的靶点在TLR4通路中富集

通过分析TCMSP数据库和相关文献，从SL煎剂中确定了36种主要活性成分。去除重复项后，共发现了700个潜在的活性成分靶点（支持信息1：表S1）。在GeneCards平台上搜索与DN相关的基因，得到了4050个结果（支持信息2：表S2）。将SL煎剂活性成分的交叉靶点映射到NA的疾病靶点上，共识别出343个交叉靶点（图1A）。随后构建了PPI网络以识别关键基因（图1B）。通过DAVID数据库进行的GO富集分析（图1C，支持信息3：表S3）显示，BP主要参与蛋白质磷酸化、蛋白质自磷酸化以及对异生物质刺激的反应。CC主要集中于质膜、质膜本身和细胞质中。微管相关蛋白（MAPs）主要与丝氨酸/苏氨酸/酪氨酸激酶、蛋白激酶和ATP结合相关。此外，还进行了KEGG富集分析（图1D，支持信息4：表S4）。去除与DN无关的通路后，最显著的富集通路是PI3K-Akt信号通路、趋化因子信号通路和Toll样受体信号通路。对Toll样受体信号通路进行分析后，发现SL煎剂的靶点主要包含TLR4、NF-κB和其他基因（图1E）。

3.2. SL煎剂改善了db/db小鼠的肾功能和肾脏病理

我们使用db/db小鼠作为自发性2型糖尿病的模型进行研究。8周龄时，db/db小鼠的血糖水平显著高于正常对照组，同时尿蛋白排泄率（ACR）也显著升高（图2A,B）。通过每周一次灌胃给予二甲双胍和SL煎剂，持续9周。给予二甲双胍和SL煎剂后，小鼠的血糖和ACR水平低于DN组，但未观察到统计学上的显著差异（图2A,B）。9周给药期后，收集小鼠的血清样本进行检测。结果显示，给药组的Scr和BUN水平显著低于DN组（图2C,D）。此外，SL煎剂组的疗效与二甲双胍组相当（图2）。图2（A）显示了空腹血糖（n=6）（A）；ACR（n=6）（B）；血清肌酐（n=6）（C）；尿素氮（n=6）（D）；H-E染色（×200），PAS染色（×400），Masson染色（×200）（E）。图2（B）显示了空腹血糖（n=6）（A）；ACR（n=6）（B）；血清肌酐（n=6）（C）；尿素氮（n=6）（D）；H-E染色（×200），PAS染色（×400），Masson染色（×200）（E）。图2（C）显示了空腹血糖（n=6）（A）；ACR（n=6）（B）；血清肌酐（n=6）（C）；尿素氮（n=6）（D）；H-E染色（×200），PAS染色（×400），Masson染色（×200）（E）。图2（D）显示了空腹血糖（n=6）（A）；ACR（n=6）（B）；血清肌酐（n=6）（C）；尿素氮（n=6）（D）；H-E染色（×200），PAS染色（×400），Masson染色（×200）（E）。图2（E）显示了空腹血糖（n=6）（A）；ACR（n=6）（B）；血清肌酐（n=6）（C）；尿素氮（n=6）（D）；H-E染色（×200），PAS染色（×400），Masson染色（×200）（E）。同时，SL煎剂显示出显著减轻DN小鼠肾脏病理恶化的能力。本研究的目的是探讨SL煎剂对糖尿病肾脏组织病理损伤的影响。从每组小鼠中收集肾脏样本，并用H-E、PAS和Masson染色进行病理分析。结果显示，模型组小鼠的肾脏表现出肾小球肥大、毛细血管侧支扩张和充血、系膜细胞增生、系膜基质扩张、肾小管腔边缘模糊、肾间质充血和水肿以及炎症细胞浸润增加，与空白对照组相比（图2E；H-E染色）。PAS染色显示，模型组小鼠的肾脏毛细血管侧支扩张、系膜细胞增生和类囊体基质显著扩张（图2E；PAS染色）。Masson染色还显示，模型组小鼠的肾小球基底膜增厚和纤维化增加（图2E；Masson染色）。上述病理改变在二甲双胍和SL煎剂组中有所改善。

3.3. SL煎剂改善了db/db小鼠的巨噬细胞浸润和M1极化

为了进一步研究小鼠肾脏中巨噬细胞的M1极化，我们对小鼠肾脏的石蜡切片进行了F4/80和CD68/iNOS的免疫荧光共染色（IF），以检测浸润的巨噬细胞并确定其极化状态。DN组显示肾小球和肾小管区域有大量F4/80+巨噬细胞浸润（图3A,B），同时CD68/iNOS阳性的细胞数量显著增加（图3C,D）。SL煎剂和二甲双胍干预后，F4/80和CD68/iNOS的表达显著降低。这些结果表明SL煎剂可能在减少巨噬细胞向DN区域的浸润及其向M1表型的极化中起作用。图3（A）显示了F4/80的IHC图像（n=6）（A,B）；iNOS/CD68的IF共定位图像（n=6）（C,D）；血清IL-6、IL-1β、TNF-α水平（n=6）（E）；血清MDA水平（n=6）（F）；血清SOD水平（n=6）（G）；血清CAT水平（n=6）（H）。图3（B）显示了F4/80的IHC图像（n=6）（A,B）；iNOS/CD68的IF共定位图像（n=6）（C,D）；血清IL-6、IL-1β、TNF-α水平（n=6）（E）；血清MDA水平（n=6）（F）；血清SOD水平（n=6）（G）；血清CAT水平（n=6）（H）。图3（C）显示了F4/80的IHC图像（n=6）（A,B）；iNOS/CD68的IF共定位图像（n=6）（C,D）；血清IL-6、IL-1β、TNF-α水平（n=6）（E）；血清MDA水平（n=6）（F）；血清SOD水平（n=6）（G）；血清CAT水平（n=6）（H）。图3（D）显示了F4/80的IHC图像（n=6）（A,B）；iNOS/CD68的IF共定位图像（n=6）（C,D）；血清IL-6、IL-1β、TNF-α水平（n=6）（E）；血清MDA水平（n=6）（F）；血清SOD水平（n=6）（G）；血清CAT水平（n=6）（H）。图3（E）在PowerPoint图示器中打开

F4/80的IHC图像（n=6）（A，B）；iNOS/CD68的IF共定位图像（n=6）（C，D）；血清IL-6、IL-1β、TNF-α水平（n=6）（E）；血清MDA水平（n=6）（F）；血清SOD水平（n=6）（G）；血清CAT水平（n=6）（H）。图3（F）在PowerPoint图示器中打开

F4/80的IHC图像（n=6）（A，B）；iNOS/CD68的IF共定位图像（n=6）（C，D）；血清IL-6、IL-1β、TNF-α水平（n=6）（E）；血清MDA水平（n=6）（F）；血清SOD水平（n=6）（G）；血清CAT水平（n=6）（H）。图3（G）在PowerPoint图示器中打开

F4/80的IHC图像（n=6）（A，B）；iNOS/CD68的IF共定位图像（n=6）（C，D）；血清IL-6、IL-1β、TNF-α水平（n=6）（E）；血清MDA水平（n=6）（F）；血清SOD水平（n=6）（G）；血清CAT水平（n=6）（H）。图3（H）在PowerPoint图示器中打开

F4/80的IHC图像（n=6）（A，B）；iNOS/CD68的IF共定位图像（n=6）（C，D）；血清IL-6、IL-1β、TNF-α水平（n=6）（E）；血清MDA水平（n=6）（F）；血清SOD水平（n=6）（G）；血清CAT水平（n=6）（H）。为了进一步研究巨噬细胞浸润对肾组织炎症反应的影响，我们进行了酶联免疫吸附测定（ELISA）来检测小鼠血清中的炎症因子IL-6、IL-1β和TNF-α。与对照组相比，DN组中的炎症因子水平显著升高。经过SL煎剂处理后，血清中的炎症因子水平显著降低（图3E），其效果与二甲双胍相当。同时，我们检测了小鼠血清中的氧化应激指标SOD、CAT和MDA。与对照组相比，DN组的SOD和MDA水平升高，而CAT水平降低。经过SL煎剂处理后，血清中的SOD和MDA水平显著下降，同时CAT水平显著升高（图3F，G）。这些发现表明巨噬细胞浸润和M1极化可能促进DN中的肾炎症，并且SL煎剂处理可能改善肾炎症状态和氧化应激。

3.4. 已证明SL煎剂可以抑制db/db小鼠中的TLR4信号通路激活和细胞焦亡

对石蜡包埋的小鼠肾脏切片进行IHC染色显示，DN组中TLR4、NF-κB p65和p-NF-κB p65的水平显著升高。相反，SL煎剂处理导致肾组织中TLR4、NF-κB p65和p-NF-κB p65的水平显著降低（图4A–D）。这表明SL煎剂可能抑制db/db小鼠中TLR4信号通路的激活。对石蜡包埋的小鼠肾脏切片进行IHC染色显示，DN组中肾小管细胞中的caspase-1、IL-18和IL-1β水平显著升高（图4E–G）。此外，SL煎剂处理显著降低了肾组织中的caspase-1、IL-18和IL-1β水平。Western blot分析的结果显示，与糖尿病相关的焦亡蛋白GSDMD、GSDMD-NT、Caspase-1和NLRP3在糖尿病肾脏中表达并显著增加。经过SL煎剂处理后，肾组织中的焦亡相关蛋白水平显著降低（图4H–L）。

图4（A）在PowerPoint图示器中打开

TLR4、NF-κB p65、p-NF-κB p65、caspase-1、IL-1β和IL-18的IHC（A）；肾组织中TLR4、NF-κB p65、p-NF-κB p65、caspase-1、IL-1β和IL-18的相对强度（n=6）（B–G）；NLRP3、Caspase-1和GSDMD的Western blot（n=3）（H–L）。图4（B）在PowerPoint图示器中打开

TLR4、NF-κB p65、p-NF-κB p65、caspase-1、IL-1β和IL-18的IHC（A）；肾组织中TLR4、NF-κB p65、p-NF-κB p65、caspase-1、IL-1β和IL-18的相对强度（n=6）（B–G）；NLRP3、Caspase-1和GSDMD的Western blot（n=3）（H–L）。图4（C）在PowerPoint图示器中打开

TLR4、NF-κB p65、p-NF-κB p65、caspase-1、IL-1β和IL-18的IHC（A）；肾组织中TLR4、NF-κB p65、p-NF-κB p65、caspase-1、IL-1β和IL-18的相对强度（n=6）（B–G）；NLRP3、Caspase-1和GSDMD的Western blot（n=3）（H–L）。图4（D）在PowerPoint图示器中打开

TLR4、NF-κB p65、p-NF-κB p65、caspase-1、IL-1β和IL-18的IHC（A）；肾组织中TLR4、NF-κB p65、p-NF-κB p65、caspase-1、IL-1β和IL-18的相对强度（n=6）（B–G）；NLRP3、Caspase-1和GSDMD的Western blot（n=3）（H–L）。图4（E）在PowerPoint图示器中打开

TLR4、NF-κB p65、p-NF-κB p65、caspase-1、IL-1β和IL-18的IHC（A）；肾组织中TLR4、NF-κB p65、p-NF-κB p65、caspase-1、IL-1β和IL-18的相对强度（n=6）（B–G）；NLRP3、Caspase-1和GSDMD的Western blot（n=3）（H–L）。图4（F）在PowerPoint图示器中打开

TLR4、NF-κB p65、p-NF-κB p65、caspase-1、IL-1β和IL-18的IHC（A）；肾组织中TLR4、NF-κB p65、p-NF-κB p65、caspase-1、IL-1β和IL-18的相对强度（n=6）（B–G）；NLRP3、Caspase-1和GSDMD的Western blot（n=3）（H–L）。图4（G）在PowerPoint图示器中打开

TLR4、NF-κB p65、p-NF-κB p65、caspase-1、IL-1β和IL-18的IHC（A）；肾组织中TLR4、NF-κB p65、p-NF-κB p65、caspase-1、IL-1β和IL-18的相对强度（n=6）（B–G）；NLRP3、Caspase-1和GSDMD的Western blot（n=3）（H–L）。图4（H）在PowerPoint图示器中打开

TLR4、NF-κB p65、p-NF-κB p65、caspase-1、IL-1β和IL-18的IHC（A）；肾组织中TLR4、NF-κB p65、p-NF-κB p65、caspase-1、IL-1β和IL-18的相对强度（n=6）（B–G）；NLRP3、Caspase-1和GSDMD的Western blot（n=3）（H–L）。图4（I）在PowerPoint图示器中打开

TLR4、NF-κB p65、p-NF-κB p65、caspase-1、IL-1β和IL-18的IHC（A）；肾组织中TLR4、NF-κB p65、p-NF-κB p65、caspase-1、IL-1β和IL-18的相对强度（n=6）（B–G）；NLRP3、Caspase-1和GSDMD的Western blot（n=3）（H–L）。图4（J）在PowerPoint图示器中打开

TLR4、NF-κB p65、p-NF-κB p65、caspase-1、IL-1β和IL-18的IHC（A）；肾组织中TLR4、NF-κB p65、p-NF-κB p65、caspase-1、IL-1β和IL-18的相对强度（n=6）（B–G）；NLRP3、Caspase-1和GSDMD的Western blot（n=3）（H–L）。图4（K）在PowerPoint图示器中打开

TLR4、NF-κB p65、p-NF-κB p65、caspase-1、IL-1β和IL-18的IHC（A）；肾组织中TLR4、NF-κB p65、p-NF-κB p65、caspase-1、IL-1β和IL-18的相对强度（n=6）（B–G）；NLRP3、Caspase-1和GSDMD的Western blot（n=3）（H–L）。图4（L）在PowerPoint图示器中打开

3.5. 已证明SL煎剂通过调节TLR4通路抑制巨噬细胞的M1极化

TLR4信号通路在巨噬细胞表型的极化和维持中起着重要作用。为了进一步研究SL煎剂对DN肾巨噬细胞M1极化的调节是否与TLR4通路有关，我们使用小鼠巨噬细胞系RAW264.7进行了体外实验。在用LPS刺激TLR4通路后，TLR4表达和NF-κB p65核转移增加，而SL煎剂的干预抑制了这一过程（图5A–E）。SL煎剂的干预导致巨噬细胞从M1极化显著转变为M2极化，表现为iNOS表达显著下降，Arg-1表达增加，细胞上清液中的促炎因子IL-6显著减少，以及抗炎因子IL-10显著增加（图5F–J）。

图5（A）在PowerPoint图示器中打开

NF-κB p65在细胞核和细胞质中的Western blot图像（n=3）（A–C）。TLR4、NF-κB p65、iNOS、Arg-1的mRNA水平（n=3）（D–G）。细胞上清液中的IL-6和IL-10水平（n=3）（H，I）。图5（B）在PowerPoint图示器中打开

NF-κB p65在细胞核和细胞质中的Western blot图像（n=3）（A–C）。TLR4、NF-κB p65、iNOS、Arg-1的mRNA水平（n=3）（D–G）。细胞上清液中的IL-6和IL-10水平（n=3）（H，I）。图5（C）在PowerPoint图示器中打开

NF-κB p65在细胞核和细胞质中的Western blot图像（n=3）（A–C）。TLR4、NF-κB p65、iNOS、Arg-1的mRNA水平（n=3）（D–G）。细胞上清液中的IL-6和IL-10水平（n=3）（H，I）。图5（D）在PowerPoint图示器中打开

NF-κB p65在细胞核和细胞质中的Western blot图像（n=3）（A–C）。TLR4、NF-κB p65、iNOS、Arg-1的mRNA水平（n=3）（D–G）。细胞上清液中的IL-6和IL-10水平（n=3）（H，I）。图5（E）在PowerPoint图示器中打开

NF-κB p65在细胞核和细胞质中的Western blot图像（n=3）（A–C）。TLR4、NF-κB p65、iNOS、Arg-1的mRNA水平（n=3）（D–G）。细胞上清液中的IL-6和IL-10水平（n=3）（H，I）。图5（F）在PowerPoint图示器中打开

NF-κB p65在细胞核和细胞质中的Western blot图像（n=3）（A–C）。TLR4、NF-κB p65、iNOS、Arg-1的mRNA水平（n=3）（D–G）。细胞上清液中的IL-6和IL-10水平（n=3）（H，I）。图5（G）在PowerPoint图示器中打开

NF-κB p65在细胞核和细胞质中的Western blot图像（n=3）（A–C）。TLR4、NF-κB p65、iNOS、Arg-1的mRNA水平（n=3）（D–G）。细胞上清液中的IL-6和IL-10水平（n=3）（H，I）。图5（H）在PowerPoint图示器中打开

NF-κB p65在细胞核和细胞质中的Western blot图像（n=3）（A–C）。TLR4、NF-κB p65、iNOS、Arg-1的mRNA水平（n=3）（D–G）。细胞上清液中的IL-6和IL-10水平（n=3）（H，I）。图5（I）在PowerPoint图示器中打开

NF-κB p65在细胞核和细胞质中的Western blot图像（n=3）（A–C）。TLR4、NF-κB p65、iNOS、Arg-1的mRNA水平（n=3）（D–G）。细胞上清液中的IL-6和IL-10水平（n=3）（H，I）。图5（J）在PowerPoint图示器中打开

NF-κB p65在细胞核和细胞质中的Western blot图像（n=3）（A–C）。TLR4、NF-κB p65、p-NF-κB p65、caspase-1、IL-1β和IL-18的IHC（A）；肾组织中TLR4、NF-κB p65、p-NF-κB p65、caspase-1、IL-1β和IL-18的相对强度（n=6）（B–G）；NLRP3、Caspase-1和GSDMD的Western blot（n=3）（H–L）。图4（K）在PowerPoint图示器中打开

RAW264.7细胞和TCMK-1细胞在HG条件下共培养（图6A）。在共培养之前，RAW264.7巨噬细胞用LPS（1 μM）和含有SL煎剂的血清预处理24小时。之后，RAW264.7巨噬细胞与肾小管细胞共培养，以消除LPS和含有SL煎剂的血清对肾小管细胞的影响。随后，通过qRT-PCR检测TLR4、NF-κB p65、GSDMD、Caspase-1和NLRP3的水平。与巨噬细胞共培养后，肾小管细胞中的TLR4、NF-κB p65、GSDMD、Caspase-1和NLRP3水平显著升高（图6B–F）。通过给予SL煎剂后，TLR4、NF-κB、GSDMD和Caspase-1的表达水平显著降低，尽管NLRP3略有下降，但统计上不显著（图6B–F）。这些结果表明，TLR4通路是巨噬细胞和DN中肾小管损伤的关键介质。

4. 讨论

DN是糖尿病的一种严重并发症，对微血管系统有深远影响，并是全球慢性肾病（CKD）患病率的主要贡献因素。统计数据显示，约30%至40%的糖尿病患者会发展为糖尿病肾病（DN），其中5%至10%的病例最终会进展为终末期肾病（ESRD）[1]。本研究的目的是探讨蛇莲（SL）煎剂在治疗糖尿病肾病中的作用。研究结果表明，蛇莲煎剂能够抑制DN中M1型巨噬细胞的极化，从而抑制TLR4信号通路的激活和肾小管上皮细胞（TEC）的焦亡。这些发现为蛇莲煎剂在糖尿病肾病管理中的潜在临床应用提供了基础。在本研究中，使用db/db小鼠作为糖尿病肾病的动物模型。db/db小鼠具有瘦素受体的基因缺陷，这可能导致肥胖和胰岛素抵抗，目前广泛用于2型糖尿病的研究[16]。此外，与db/m小鼠相比，db/db小鼠的肾巨噬细胞浸润增加[17]。由于二甲双胍具有肾脏保护作用，并能调节TLR4/NF-κB通路在糖尿病肾病管理中的作用，因此被选为阳性对照药物[18, 19]。本研究检测了db/db小鼠的空腹血糖、血肌酐、尿素氮和ACR（血清白蛋白/肌酐比值）。结果显示，与空白对照组相比，糖尿病肾病组小鼠的血糖、尿素氮和ACR显著升高。同时，肾脏病理学检查显示出现肾小球肥大、系膜细胞增生、系膜基质扩张、肾包膜狭窄、肾小管管腔边缘模糊以及肾间质出血和水肿等病理变化。与对照组相比，炎症细胞浸润也有所增加，这与糖尿病肾病的病理特征一致。研究还表明，蛇莲煎剂可以降低db/db小鼠的血肌酐和尿素氮水平，并减轻肾脏病理表现，如肾小球肥大、系膜细胞增生和肾小管管腔边缘模糊。此外，该组合用药还能减少炎症细胞浸润。这些发现共同表明，蛇莲煎剂具有保护糖尿病肾病患者肾功能的潜力。越来越多的证据表明，肾脏炎症在糖尿病肾病的发病机制中起着重要作用，这体现在炎症信号通路的激活、炎症因子的释放以及免疫细胞的浸润上。研究表明，巨噬细胞是糖尿病肾病患者肾脏中最主要的浸润白细胞，并与肾功能下降相关。巨噬细胞主要分为两种表型：M1型和M2型[20]。M1型巨噬细胞具有促炎作用，可被病原体相关分子模式（PAMPs）、危险相关分子模式（DAMPs）、干扰素-γ（IFN-γ）、脂多糖（LPS）和促炎细胞因子激活，导致IL-6、IL-1β和TNF-α等炎症因子的分泌，从而加剧肾脏炎症和肾实质细胞的损伤[7]。临床研究显示，糖尿病肾病患者的肾小球和肾小管间质巨噬细胞数量高于无肾脏异常的糖尿病患者和无肾脏并发症的糖尿病患者[21]。在糖尿病肾病的早期阶段（病理学阶段I和IIa），驻留和募集的巨噬细胞大量分化为促炎型M1巨噬细胞[22]；而在晚期阶段（病理学阶段III），M2型巨噬细胞数量进一步增加[23]。巨噬细胞及其表型可通过特定标记物进行识别，如F4/80和CD68等表面分子标记物。iNOS标记物常用于识别M1型巨噬细胞，并在此研究中被广泛使用。TLR4信号通路可诱导巨噬细胞M1极化，TLR4的激活导致IKK2复合物磷酸化，进而磷酸化IκBα，释放NF-κB p65，后者迅速转移到细胞核并进一步磷酸化为p-p65，诱导M1型巨噬细胞极化，包括iNOS的高表达以及IL-6、IL-1β和TNF-α等炎症因子的释放[24]。研究表明，中医中药可能通过调节巨噬细胞来抑制糖尿病肾病的进展[25]。本研究结果表明，蛇莲煎剂显著降低了db/db小鼠肾组织中巨噬细胞标记物F4/80的表达和CD68/iNOS的共定位，并减少了血清中IL-6、IL-1β和TNF-α的水平。细胞实验显示，蛇莲煎剂能抑制LPS诱导的TLR4高表达和NF-κB p65的核转位，同时上调Arg-1并下调iNOS。ELISA检测细胞上清液发现，蛇莲煎剂减少了促炎因子IL-6的分泌，同时增强了抗炎因子IL-10的分泌。这些结果表明，蛇莲煎剂能抑制糖尿病肾病肾组织中M1型巨噬细胞的浸润并减少炎症因子的释放，这可能是通过抑制TLR4/NF-κB通路实现的。最新研究表明，肾小管上皮细胞的焦亡是糖尿病肾病发病机制的关键环节，肾小管上皮细胞的损伤是糖尿病肾病中微量白蛋白尿发生的重要机制[26]。糖尿病肾病的发病机制与巨噬细胞诱导的肾小管上皮细胞损伤有关[27]。高血糖环境可诱导巨噬细胞中NF-κB的激活和M1极化，进而导致肾小管上皮细胞的炎症、纤维化和坏死性凋亡[28]。研究表明，M1型巨噬细胞可通过激活TEC中的NLRP3炎症小泡诱导细胞焦亡[29]。焦亡是一种依赖于caspase-1的细胞死亡途径，其特征包括细胞肿胀、细胞膜孔形成、细胞膜破裂、DNA切割和炎症介质的释放，具有促进炎症反应的作用[2]。炎症小泡的激活是细胞焦亡的关键事件，其中NLRP3炎症小泡是最主要的例子。在微生物感染和细胞损伤的情况下，活化的caspase-1会切割IL-1β和IL-18的前体[3]。caspase-1还激活GSDMD，导致质膜上孔的形成，促进IL-1β和IL-18的分泌，并诱导细胞焦亡。TLR4在肾小管间质中高度表达[30]，TLR4/NF-κB通路是诱导细胞焦亡的上游通路之一[31]。本研究通过免疫组化（IHC）和Western blot（WB）证实，蛇莲煎剂干预后db/db小鼠的肾TLR4、NF-κB p65和p-NF-κB p65水平降低。此外，与焦亡相关的蛋白质（如NLRP3、caspase-1、GSDMD、GSDMD-NT、IL-18和IL-1β）的表达也降低，表明蛇莲煎剂能抑制糖尿病肾病中的细胞焦亡。进一步通过Transwell共培养巨噬细胞RAW264.7和肾小管上皮细胞（TEC）观察巨噬细胞M1极化对肾小管上皮细胞焦亡的影响，结果显示，与蛇莲煎剂干预后的RAW264.7巨噬细胞共培养后，肾小管上皮细胞的TLR4和NF-κB p65 mRNA水平显著下降，GSDMD、caspase-1、NLRP3 mRNA及GSDMD和GSDMD-NT蛋白水平也显著降低。这表明M1极化的巨噬细胞可能参与共培养肾小管上皮细胞的焦亡过程，而蛇莲煎剂干预可能有效抑制这一过程。然而，本研究仅限于巨噬细胞和肾小管上皮细胞的共培养实验，旨在初步探讨蛇莲煎剂抑制巨噬细胞M1极化以减轻肾小管上皮细胞焦亡的作用，但其具体机制尚不清楚。未来计划进一步研究巨噬细胞分泌的蛋白质或外泌体对肾小管上皮细胞的影响。

5. 结论
本研究利用网络药理学及体内和体外实验证实，蛇莲煎剂可以改善糖尿病肾病患者的肾功能。结果表明，蛇莲煎剂的作用机制与调节糖尿病肾病肾组织中巨噬细胞的M1极化及抑制肾小管上皮细胞的焦亡有关。

6hUTP：6小时尿液总蛋白量
ACR：白蛋白/尿肌酐比值
CKD：慢性肾脏病
DAMPs：危险相关分子模式
DN：糖尿病肾病
ESRD：终末期肾病
H-E：苏木精-伊红染色
IF：免疫荧光
IFN-γ：干扰素-γ
IHC：免疫组化
LPS：脂多糖
PAMPs：病原体相关分子模式
PAS：过碘酸-希夫染色
RT-qPCR：RNA提取和实时定量聚合酶链反应
SL：蛇莲
TEC：肾小管上皮细胞

作者贡献
傅小哲：方法学设计、实验实施、数据整理、初稿撰写
傅强：概念构思、实验设计、数据分析、结果可视化、资源提供、初稿撰写及审稿编辑
刘圆媛：实验实施
刘一帆：实验实施
王俊恒：实验实施
胡杰：实验实施
田楚晓：实验实施
于文倩：实验实施
任一轩：实验实施
黄伟军：实验实施
赵金熙：概念构思、资金争取、项目监督、项目管理、审稿编辑

致谢
本研究得到了国家自然科学基金（项目编号82004302和82074354）和第六批中医临床优秀人才培养计划的支持。

利益冲突
作者声明无利益冲突。

数据可用性声明
本研究的支持数据可向通讯作者索取。

更多支持信息请参见在线的“支持信息”部分。