紫珠膏通过抑制IgE–FcεRI信号介导的肥大细胞脱颗粒作用，促进糖尿病足溃疡的愈合

《Journal of Diabetes Research》：Zizhu Ointment Inhibits IgE–FcεRI Signaling-Mediated Mast Cell Degranulation to Promote the Healing of Diabetic Foot Ulcers

　　摘要

糖尿病溃疡是糖尿病的一种严重并发症，由于其反复发作的慢性炎症而给治疗带来了巨大挑战。导致这种持续炎症的一个关键因素是肥大细胞的脱颗粒作用。本研究探讨了传统中药制剂紫珠膏（ZZO）对糖尿病溃疡中肥大细胞脱颗粒作用的影响，以及其在促进伤口愈合中的潜在机制。临床样本分析显示，ZZO显著抑制了糖尿病溃疡伤口中的肥大细胞脱颗粒。在糖尿病小鼠伤口模型中，ZZO能够抑制肥大细胞脱颗粒，降低TNF-α和MMP-9的表达，并促进伤口愈合。细胞实验表明，ZZO抑制了IgE/DNP交联介导的脱颗粒作用、钙（Ca2+）内流以及β-己糖胺酶、组胺（HIS）和TNF-α的释放，这些作用发生在人类HMC-1和小鼠P815肥大细胞中。此外，ZZO还阻断了IgE/DNP交联介导的FcεRI近端信号通路（LYN/SYK/PLCγ）和炎症级联反应（IKK/NFκB和MAPKs）的激活。我们推测，ZZO通过稳定肥大细胞并抑制其脱颗粒作用，从而减少炎症介质的释放，促进伤口修复。

1. 引言

糖尿病足溃疡（DFU）是糖尿病患者中最常见且最严重的慢性并发症之一，对全球健康构成了重大挑战[1]。根据国际糖尿病联合会（IDF）的预测，到2045年，全球糖尿病患者人数预计将达到7.83亿。令人担忧的是，这一人群中DFU的终生发病率高达34%，这意味着平均每100名糖尿病患者中就有34人可能在一生中发生足部溃疡[2]。这种高发病率不仅给患者带来巨大的身体痛苦和经济负担，也给全球的医疗资源和公共卫生系统带来了巨大压力[3, 4]。因此，DFU已成为一个紧迫的公共卫生问题，需要医疗提供者、政策制定者和社会各界的立即关注和协调干预，以减轻其广泛的影响[5, 6]。最近的研究阐明了肥大细胞脱颗粒在DFU发病机制和进展中的复杂作用[7, 8]。肥大细胞广泛分布于皮肤、黏膜和血管周围区域，其细胞质颗粒中含有丰富的生物活性介质，如组胺（HIS）、蛋白酶（包括胰蛋白酶和糜蛋白酶）和肝素[9]。在正常生理条件下，这些细胞参与免疫防御、炎症调节和组织修复[10, 11]。然而，在DFU的病理微环境中，肥大细胞脱颗粒可能会失调[12]。在溃疡发展的初期阶段，高血糖引起的局部组织损伤和炎症反应会导致肥大细胞过度脱颗粒[13]。组胺的释放会导致局部血管扩张和血管通透性增加，从而加剧组织水肿和缺氧——这些都是有效愈合的主要障碍。同时，蛋白酶会降解细胞外基质（ECM）的成分，从而损害组织完整性并阻碍修复过程[14]。此外，脱颗粒还会通过招募更多的炎症细胞（如中性粒细胞和巨噬细胞）来增强局部免疫激活。这种病理级联反应不仅维持了促炎环境，还破坏了伤口愈合的时空协调性，使得DFU对标准疗法具有抗性。因此，针对肥大细胞介导的通路（如蛋白酶抑制和HIS受体阻断）可能提供一种有前景的治疗策略，以中断慢性炎症循环并恢复DFU的正常愈合过程[15]。在中国，用于外科外用的传统中药局部制剂在管理慢性伤口（特别是DFU）方面显示出显著疗效，通过改善局部微循环、减轻炎症和加速组织修复，从而缩短愈合时间和减少并发症[16, 17]。基于中医外科理论并结合临床经验，我们的团队开发了紫珠膏（ZZO），这是一种多组分制剂，能够协同调节DFU的免疫微环境[18]。临床前研究表明，其作用机制包括抑制促炎介质（如TNF-α和NLRP3）、稳定ECM以及促进炎症消退。这些作用有效解决了包括慢性炎症和修复过程受损在内的病理问题[19, 20]。通过整合中医原理和现代分子生物学知识，ZZO展示了传统制剂在基于证据的伤口护理中的潜力。它提供了一种标准化的治疗策略，旨在改善糖尿病伤口（DWs）的临床结果，从而突显了中医在现代医学实践中的持久相关性。本研究的主要目的是探讨ZZO对DWs中肥大细胞脱颗粒的具体影响，并通过分析相关信号通路的表达变化来阐明其在DFU治疗中的潜在机制。通过系统地探索这种中药制剂如何调节病理性肥大细胞活性和下游分子级联反应，我们旨在为其临床应用建立坚实的理论基础，最终推动基于中医的局部疗法融入现代基于证据的医疗实践，并扩大其在慢性伤口管理中的治疗潜力。

2. 材料与方法

2.1. 抗体和试剂

抗-SYK (#13198)、抗-p-SYK (#2710)、抗-LYN (#2796)、抗-p-LYN (#2731)、抗-PLCγ1 (#5690)、抗-p-PLCγ1 (#2821)、抗-PI3K (#4292)、抗-p-PI3K (#17366)、抗-AKT (#9272)、抗-p-AKT (#4060)、抗-IKKα (#61294)、抗-p-IKKα/β (#2078)、抗-NFκB (#8242)、抗-p-NFκB (#3033)、抗-JNK (#9252)、抗-p-JNK (#4668)、抗-ERK (#4695)、抗-p-ERK (#4370)、抗-P38 (#4695)、抗-p-P38 (#9212) 和山羊抗兔IgG辣根过氧化物酶（HRP）均购自Cell Signaling Technology。抗-GAPDH (10494-1-AP)、抗-MMP9 (10375-2-AP)、抗-GAPDH (17590-1-AP) 和HRP标记的抗小鼠抗体 (SA00001-1) 来自ProteinTech Group, Inc。抗-2,4-二硝基苯（DNP）-IgE (D8406)、DNP–HSA (A6661)、Tyrode’s buffer (T2397) 和β-己糖胺酶底物4-硝基苯N-乙酰-β-D-葡糖胺 (N9376) 购自Sigma–Aldrich。

2.2. ZZO及其提取物的制备

ZZO是一种药物制剂（批准编号130301），由上海中医药大学附属曙光医院开发。草药成分来自上海康桥中药片剂有限公司，并符合既定的质量控制标准。该药膏由武汉美英龙制药集团有限公司生产，包含六种活性成分：黄芪（1.5%）、朱砂（3.5%）、驴皮胶（2.5%）、马鞭草根（1.5%）和龙血树脂（3%），以及白凡士林和羊毛脂等辅料。对于涉及细胞的实验应用，ZZO的酒精提取物按以下方法制备：将150克马鞭草根、350克朱砂、300克龙血树脂、150克黄芪和50克龙脑与10体积的80%乙醇（v/w）混合，浸泡24小时，加热至沸腾，然后小火炖煮1小时，再进行真空过滤。残留物用10体积的80%乙醇浸泡过夜，重复加热和过滤步骤。合并的滤液通过旋转蒸发浓缩至无乙醇，得到最终的酒精提取物，储存在4°C并经过0.22微米微孔过滤器灭菌后使用。

2.3. 临床样本

本研究方案获得了上海中医药大学伦理委员会的批准（批准编号2024-1443-026-01），并遵守赫尔辛基宣言。参与者包括DFU患者和健康对照组。健康对照组（n=6）为无糖尿病或皮肤病的人，非可修复的伤口边缘皮肤组织是在创伤后清创过程中获得的。共有46名非缺血性DFU患者参与研究。所有参与者首先接受标准伤口护理，包括常规清创、感染控制和抗炎治疗。之后，根据中医临床实践中广泛使用的标准化方案，根据伤口愈合阶段局部应用ZZO。在炎症期，均匀涂抹一层厚约4毫米的ZZO，压实后覆盖无菌纱布，每天一次。当渗出减少并出现健康的肉芽组织时，表示进入肉芽期，涂抹一层中等厚度的ZZO（约2毫米），每2天更换一次敷料。在上皮化期，涂抹一层薄薄的ZZO（约1毫米），轻轻按压，每3天更换一次敷料。在基线和治疗8周后，在局部麻醉下进行清创时收集溃疡组织样本。所有参与者均签署了书面知情同意书。

2.4. 小鼠

本研究使用了36只8周大的雄性C57/BL6J小鼠，体重在23至28克之间，具有特定无病原体（SPF）状态，购自上海吉汇实验动物繁殖有限公司（中国上海）。小鼠饲养在上海中医药大学实验动物中心的SPF级设施中，环境条件严格控制：温度维持在23±2°C，相对湿度为55±5%，12小时光照/黑暗循环。在整个研究期间，小鼠可以自由进食标准饲料和水，每3天更换一次垫料以确保卫生条件[18]。在正式实验开始前，所有小鼠都经历了1周的适应期以减少压力并稳定生理参数。所有实验程序均严格遵循国家指南和上海中医药大学的动物护理规定。研究方案获得了上海中医药大学动物伦理委员会的批准（批准编号PZSHUTCM2212140011）。

2.5. 伤口模型和治疗

小鼠的DW模型基于先前建立的小鼠糖尿病模型[18]。首先，小鼠被喂食高脂肪饮食8周。随后，它们接受腹腔注射1.5%链脲佐菌素（STZ）溶液，该溶液用柠檬酸和柠檬酸钠配制，剂量为40 mg/kg，连续五天注射到腹部。STZ注射一周后，评估随机血糖水平。当血糖水平达到16.7 mmol/L并保持稳定一周时，认为模型稳定。之后，剃除小鼠背部的毛发，并使用异氟烷气体诱导麻醉。在背部皮肤上划出一个直径1.5厘米的圆形区域，并完全切除表皮层。对照组小鼠继续喂食标准饮食，不接受STZ治疗。同时，使用上述程序在小鼠中建立标准伤口模型。共有36只小鼠被随机分为三个实验组（每组12只）。对照组和DW组均接受生理盐水治疗。DW+ZZO组接受ZZO药膏的局部治疗，剂量为0.032 g/cm2，每天均匀涂抹在伤口表面。该剂量通过制备含有3.2克ZZO（相当于约3毫升体积）的敷料来实现，确保药物浓度和应用的均匀性。

2.6. 伤口愈合评估

在确定WHR时，首先在干预后第0天、第3天、第7天和第14天对小鼠伤口进行标准化摄影。随后，使用ImageJ软件分析捕获的伤口图像，以量化每个时间点的伤口面积（WA）。愈合率计算公式为：WHRx = ([WA0 ? WAx] / WA0) × 100%，其中WA0表示初始伤口面积，WAx表示特定时间点（第3天、第7天或第14天）的伤口面积，WHRx表示相应时间点的愈合率。

2.7. 苏木精和伊红（H&E）染色

收集的组织样本在4%甲醛（Beyotime，中国）中固定48小时。固定后的样本进行连续的组织学处理，包括包埋、脱水、透明化、石蜡浸透、切片（4微米厚度）、烘烤、脱蜡、重新水化、H&E染色（Beyotime，中国）、透明化和装片。组织学图像使用光学显微镜捕获，并使用ImageView图像分析系统进行定量分析。

2.8. 托卢定蓝（TB）染色

组织样本的TB染色试剂购自上海Gefan生物技术有限公司（中国上海）。石蜡包埋的组织切片通过分级乙醇系列进行脱蜡和重新水化。然后，将切片在室温下用TB染色溶液浸泡30分钟，再用蒸馏水冲洗三次，每次2分钟。使用95%乙醇进行分化，直到肥大细胞颗粒显示出明显的紫蓝色。切片在无水乙醇中脱水，用二甲苯透明化，然后用中性树脂装片。细胞的TB染色步骤如下：将细胞悬液涂在玻璃载玻片上并风干。载玻片在细胞特异性TB染色溶液（Solarbio，中国）中孵育5分钟。然后向涂片中小心地滴加了等体积的蒸馏水并轻轻混合，随后再进行15分钟的染色。载玻片用蒸馏水清洗两次（每次30秒），空气干燥，并用中性树脂覆盖后装片。在光学显微镜下观察染色细胞以进行形态学分析。

2.9. 免疫组化（IHC）染色

石蜡包埋的组织样本通过连续切片的过程制备，然后在60°C下过夜加热。样本用基于甲苯的酒精溶液清洗，进行梯度乙醇裂解，并进行抗原回收。接下来是与一抗和二抗孵育，DAB染色，用苏木精复染，然后进行连续乙醇脱水，最后用中性树脂包埋。这些准备工作完成后，使用光学显微镜进行观察和成像。使用ImageJ软件分析图像的光密度（OD），以评估不同样本之间的抗原表达差异。

2.10. 免疫细胞组成的生物信息学分析

基因表达数据集GSE134431来源于国家生物技术信息中心基因表达组学数据库（GEO）（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/），包含来自糖尿病足皮肤（DFS）的8个正常皮肤样本和13个DFU患者的溃疡样本的转录组谱型。原始数据使用稳健的多阵列平均（RMA）算法进行标准化，以生成用于后续分析的表达矩阵。使用R语言实现的CIBERSORT算法量化免疫细胞组成，该算法采用了LM22转录签名矩阵，其中包括22种免疫细胞亚型，如巨噬细胞亚群、T细胞、NK细胞、肥大细胞、B细胞、树突状细胞、单核细胞、浆细胞、中性粒细胞和嗜酸性粒细胞。为了确保结果的稳健性，进行了1000次蒙特卡洛置换。CIBERSORT p值小于0.05的样本被保留用于后续分析。使用Wilcoxon秩和检验评估DFS组和DFU组之间22种免疫细胞亚型的差异丰度（p < 0.05被认为具有统计学意义）。统计分析在R（版本4.3.1）中进行，结果使用“corrplot”、“vioplot”、“ggplot2”和“glmnet”包可视化，以生成相关性热图、小提琴图和回归模型[21]。模型小鼠的伤口组织转录组测序由上海OE Biotech有限公司完成。治疗后的第3天样本包括对照组（D3C1）、DW组（D3DW1、D3DW2和D3DW3）以及DW+ZZO组（D7DWZ1、D7DWZ2和D7DWZ3）。治疗后的第7天样本包括对照组（D7C1、D7C2和D7C3）、DW组（D7DW1和D7DW2）以及DW+ZZO组（D7DWZ1、D7DWZ2和D7DWZ3）。使用R中的CIBERSORT算法分析测序数据以量化免疫细胞组成。参考标记基因表达谱型矩阵基于广泛使用的小鼠免疫细胞签名矩阵[22]。

2.11. 细胞系和细胞培养

在本研究中，人肥大细胞系HMC-1购自雅吉生物技术有限公司（中国上海雅吉细胞中心），小鼠髓系肥大细胞瘤细胞系P815购自细胞生物学研究所（中国上海）。HMC-1和P815分别培养在IMDM（Gibco，美国）和DMEM（Gibco）中，补充了10%（v/v）胎牛血清（FBS）（Gibco）和1%青霉素/链霉素（Solarbio，中国），并在37°C、5% CO2环境中维持。

2.12. CCK8检测

当HMC-1和P815细胞达到对数生长阶段后，将它们以每孔5×10^3个细胞的密度接种到96孔板中，培养基中添加了10% FBS。培养24小时后，将培养基更换为含有ZZO的新鲜培养基，ZZO的浓度分别为0、50、100、200、400、800和3200 μg/mL，每个浓度六个重复孔。药物处理48小时后，向每个孔中加入10% CCK-8溶液（Beyotime，中国），充分混合，然后在37°C下孵育4小时。使用微孔板读数仪在490和630 nm的双波长下测量OD值。细胞增殖抑制率（%）根据以下公式计算：抑制率（%）=（1 - [实验组OD - 空白组OD] / [对照组OD - 空白组OD]）× 100%。

2.13. 肥大细胞脱颗粒的激活

当HMC-1和P815细胞达到对数生长阶段后，使用IgE/DNP交联协议诱导肥大细胞激活。首先，细胞用200 ng/mL的抗DNP IgE sensitized过夜，然后用PBS洗涤三次以去除未结合的IgE。为了评估ZZO的抑制效果，增加了一个实验组，在IgE sensitization后和DNP-HSA刺激前立即用200 μg/mL的ZZO预处理细胞2小时。随后，在37°C下用100 ng/mL的DNP-HSA刺激IgE-sensitized细胞（无论是否预先处理ZZO）4小时，以诱导FcεRI介导的肥大细胞激活和脱颗粒。因此，建立了三种平行条件：（i）未处理的对照组，（ii）IgE/DNP激活组，以及（iii）ZZO预处理+IgE/DNP组。所有下游检测——包括基于TB的脱颗粒评估、胞质Ca2+成像、β-六氨基己糖苷酶释放、HIS定量和TNF-α ELISA——都在这些条件下进行，以评估ZZO对IgE触发的肥大细胞激活的抑制效果。

2.14. 胞质钙（Ca2+）染色

使用Fluo-4 Ca2+ Assay Kit（Beyotime，中国）量化胞质Ca2+浓度。细胞收集后，用磷酸盐缓冲盐水（PBS）洗涤两次，然后在37°C的黑暗环境中与5 μM Fluo-4孵育30分钟。孵育后，用PBS洗涤一次，并将细胞重新悬浮在检测缓冲液中。制备的样本分成两份，分别用于后续的荧光显微镜和流式细胞术分析。荧光成像使用IX71荧光显微镜（Olympus Corporation，日本东京）进行。成像前，将细胞转移到96孔板上，并将明场图像与显微镜下捕获的绿色荧光图像（488 nm激发）合并。流式细胞术分析使用CytoFLEX Flow Cytometer（Beckman Coulter，美国加州布雷亚）进行，其中量化每个样本的绿色荧光（488 nm激发）的平均荧光强度（MFI）。

2.15. β-六氨基己糖苷酶的检测

完成肥大细胞脱颗粒激活实验后，离心分离细胞和上清液。细胞沉淀物在含有1% Triton X-100的Tyrode缓冲液中裂解30分钟，然后离心收集裂解液上清液。然后将细胞培养上清液和裂解液上清液与等体积的底物溶液（1 mM 4-硝基苯基N-乙酰-β-D-葡萄糖胺在0.1 M柠檬酸缓冲液中，pH 4.5）混合，并在37°C下孵育1小时。通过添加0.1 M Na2CO3/NaHCO3缓冲液（pH 10）终止反应，并使用微孔板读数仪（EXL-800，BioTek）在405 nm处测量吸光度。β-六氨基己糖苷酶释放率（%）根据以下公式计算：%释放 = （上清液OD / [上清液OD + 裂解液OD]）× 100%。

2.16. HIS和TNF-α的测量

使用市售的HIS ELISA Kit（商品编号E-EL-0032，Elabscience Biotechnology Co., Ltd.，武汉，中国）按照制造商的方案测量活化HMC-1和P815细胞培养上清液中的HIS含量。使用EasyGo! Human TNF-α One-Step ELISA Kit（商品编号EK182EGB，Multisciences，杭州，中国）和EasyGo! Mouse TNF-α One-Step ELISA Kit（商品编号EK282EGB，Multisciences，杭州，中国）分别测量活化HMC-1和P815细胞培养上清液中的TNF-α含量，同样按照制造商的方案进行。

2.17. 西部印迹分析

激活后，HMC-1和P815细胞使用细胞裂解缓冲液（Beyotime，中国）和蛋白酶抑制剂（Beyotime，中国）以及磷酸酶抑制剂（Beyotime，中国）在冰上孵育30分钟。裂解液在4°C下以12,000 × g离心15分钟，收集上清液用于蛋白质定量，使用BCA Protein Assay Kit（Beyotime，中国）。将等量的蛋白质（每条泳道20–30 μg）通过10% SDS–PAGE分离，并使用湿转移系统以200 mA转移到PVDF膜（Millipore，美国马利波拉）上，时间为2小时。膜在室温下用5%非脂肪牛奶在TBST（含有0.1% tween-20的Tris缓冲液）中封闭1小时，然后在4°C下过夜与一抗孵育。三次TBST洗涤后，用HRP结合的二抗（Cell Signaling Technology，美国丹弗斯）在室温下孵育1小时。使用增强化学发光（ECL）底物（Beyotime，中国）可视化蛋白质条带，并使用ECL西部印迹检测系统（Millipore，美国马利波拉）进行成像，并以GAPDH作为加载对照进行归一化。

2.18. 统计分析

所有数据使用SPSS 27.0软件（SPSS, Inc., Chicago, IL, USA）进行单因素方差分析（ANOVA）和Student’s t检验。结果表示为平均值±标准差（SD），统计显著性在p值<0.05的阈值下确定。

3. 结果

3.1. DFU部位的肥大细胞激活和脱颗粒增强

为了阐明免疫细胞在DFU进展中的作用，我们使用CIBERSORT算法量化每个样本中22种免疫细胞亚型的比例，如图1A所示。在DFS样本中，前五种免疫细胞群体是静息肥大细胞、M2巨噬细胞、静息记忆CD4+ T细胞、滤泡辅助T细胞（Tfh）和静息树突状细胞。相比之下，DFU样本中的前五种免疫细胞群体是静息记忆CD4+ T细胞、静息肥大细胞、M2巨噬细胞、M0巨噬细胞和活化肥大细胞。差异分析（图1B）显示DFU中活化肥大细胞（红色框，p < 0.01）和中性粒细胞（p < 0.05）的比例显著高于DFS，而活化NK细胞（p < 0.01）和CD8+ T细胞（p < 0.05）在DFU中显著减少。这些观察表明DFU病变的特点是中性粒细胞浸润和肥大细胞激活增加，同时NK细胞活性和CD8+ T细胞数量减少，这可能导致糖尿病溃疡的免疫调节受损和伤口愈合延迟。图1（A）在图查看器中打开

DFU组织中的肥大细胞激活及ZZO的抑制效果。(A) 使用CIBERSORT对GSE143341数据集中的每个样本中的22种免疫细胞类型进行生物信息学去卷积。刻度条：50 μm。(B) 盒状图显示DFS组和DFU组中22种免疫细胞的比例，使用Wilcoxon秩和检验测试统计显著性。p值小于0.05表示组间存在统计学显著差异。(C) 正常皮肤组织、DFU组织样本以及用ZZO处理的DFU组织的H&E染色和TB染色的代表性图像。黑色箭头表示肥大细胞，红色箭头表示肥大细胞脱颗粒过程中释放的胞质颗粒。刻度条：50 μm。(D) 条状图量化每组中脱颗粒的肥大细胞数量（n，正常=6，DFU=46，DFU+ZZO=46）。使用单因素ANOVA进行统计分析；?p < 0.05，***p < 0.01被认为具有统计学意义。图1（B）在图查看器中打开

DFU组织中的肥大细胞激活及ZZO的抑制效果。(A) 使用CIBERSORT对GSE143341数据集中的每个样本中的22种免疫细胞类型进行生物信息学去卷积。刻度条：50 μm。(B) 盒状图显示DFS组和DFU组中22种免疫细胞的比例，使用Wilcoxon秩和检验测试统计显著性。p值小于0.05表示组间存在统计学显著差异。(C) 正常皮肤组织、DFU组织样本以及用ZZO处理的DFU组织的H&E染色和TB染色的代表性图像。黑色箭头表示肥大细胞，红色箭头表示肥大细胞脱颗粒过程中释放的胞质颗粒。刻度条：50 μm。(D) 条状图量化每组中脱颗粒的肥大细胞数量（n，正常=6，DFU=46，DFU+ZZO=46）。使用单因素ANOVA进行统计分析；?p < 0.05，***p < 0.01被认为具有统计学意义。图1（C）在图查看器中打开

DFU组织中的肥大细胞激活及ZZO的抑制效果。(A) 使用CIBERSORT对GSE143341数据集中的每个样本中的22种免疫细胞类型进行生物信息学去卷积。刻度条：50 μm。(B) 盒状图显示DFS组和DFU组中22种免疫细胞的比例，使用Wilcoxon秩和检验测试统计显著性。p值小于0.05表示组间存在统计学显著差异。(C) 正常皮肤组织、DFU组织样本以及用ZZO处理的DFU组织的H&E染色和TB染色的代表性图像。黑色箭头表示肥大细胞，红色箭头表示肥大细胞脱颗粒过程中释放的胞质颗粒。刻度条：50 μm。(D) 条状图量化每组中脱颗粒的肥大细胞数量（n，正常=6，DFU=46，DFU+ZZO=46）。使用单因素ANOVA进行统计分析；?p < 0.05，***p < 0.01被认为具有统计学意义。图1（C）在图查看器中打开刻度尺：50 μm。 (D) 条形图量化了每组每个视野中脱颗粒的肥大细胞数量（n，正常组=6，DFU组=46，DFU+ZZO组=46）。统计分析使用单因素方差分析（one-way ANOVA）进行；?p < 0.05，??p < 0.01被认为具有统计学意义。图1 (D) 在图形查看器中打开 PowerPoint

DFU组织中的肥大细胞激活及ZZO的抑制作用。(A) 对GSE143341数据集中的每个样本中的22种免疫细胞类型进行生物信息学去卷积（CIBERSORT）分析。刻度尺：50 μm。(B) 盒形图显示了DFS组和DFU组中22种免疫细胞的比例，使用Wilcoxon秩和检验测试统计显著性。p值小于0.05表示组间存在统计学差异。(C) 正常皮肤组织、DFU组织样本以及用ZZO处理的DFU组织的H&E染色和TB染色的代表性图像。黑色箭头表示肥大细胞，红色箭头表示肥大细胞脱颗粒过程中释放的细胞质颗粒。刻度尺：50 μm。(D) 条形图量化了每组每个视野中脱颗粒的肥大细胞数量（n，正常组=6，DFU组=46，DFU+ZZO组=46）。统计分析使用单因素方差分析（one-way ANOVA）进行；?p < 0.05，??p < 0.01被认为具有统计学意义。为了评估DFU组织中的肥大细胞激活情况，所有临床样本均进行了H&E染色和TB染色（图1C）。H&E染色显示DFU病变中的炎症细胞显著浸润，而ZZO处理显著减少了这些炎症细胞的积聚。TB染色显示DFU组织中的肥大细胞脱颗粒现象明显，其特征是细胞外出现异染颗粒。ZZO治疗后，这种脱颗粒现象显著减轻。

3.2. ZZO促进糖尿病小鼠的伤口愈合

伤口愈合实验的结果（图2A,B）表明，与对照组相比，DW组在第7天（d7，p < 0.01）和第14天（d14，p < 0.01）的伤口愈合率（WHR）显著降低。相比之下，DW+ZZO组在第7天（p < 0.01）和第14天（p < 0.01）的伤口愈合率显著改善（图2B）。图2 (A) 在图形查看器中打开 PowerPoint

ZZO促进糖尿病小鼠的伤口愈合。(A) 每个实验组（每组3只小鼠）在处理后0天、3天、7天和14天的代表性伤口图像。(B) 在干预后3天、7天和14天对每组的伤口愈合率（WHR）进行定量分析。数据以平均值±标准差（mean ± SD）呈现。统计分析使用单因素方差分析（one-way ANOVA）进行，随后使用Tukey的事后检验（post hoc test）比较组间差异。??p < 0.01被认为具有统计学意义。图2 (B) 在图形查看器中打开 PowerPoint

ZZO促进糖尿病小鼠的伤口愈合。(A) 每个实验组（每组3只小鼠）在处理后0天、3天、7天和14天的代表性伤口图像。(B) 在干预后3天、7天和14天对每组的伤口愈合率（WHR）进行定量分析。数据以平均值±标准差（mean ± SD）呈现。统计分析使用单因素方差分析（one-way ANOVA）进行，随后使用Tukey的事后检验（post hoc test）比较组间差异。??p < 0.01被认为具有统计学意义。

3.3. ZZO抑制糖尿病小鼠伤口中的肥大细胞脱颗粒

通过对糖尿病模型小鼠伤口组织的转录组分析，利用基于CIBERSORT的23种免疫细胞亚群的分析，揭示了不同的免疫细胞组成模式。在干预后第3天（图3A,B），对照组表现出M0巨噬细胞（21.24%）、M2巨噬细胞（19.65%）、M1巨噬细胞（11.07%）、单核细胞（6.89%）和活化树突状细胞（6.34%）的显著浸润。DW组（DW组）显示M2巨噬细胞（29.66%）、单核细胞（18.11%）、M1巨噬细胞（11.69%）、中性粒细胞（7.33%）和幼稚B细胞（6.46%）的比例升高。DW+ZZO干预组表现出以M2巨噬细胞（15.59%）、幼稚B细胞（11.34%）、幼稚CD4+ T细胞（10.26%）、M0巨噬细胞（8.92%）和M1巨噬细胞（8.69%）为主的改变。图3 (A) 在图形查看器中打开 PowerPoint

ZZO对糖尿病小鼠伤口中免疫细胞组成的影响。(A) 使用转录组测序数据、CIBERSORT算法和小鼠免疫细胞特征矩阵，在干预后3天分析小鼠伤口组织中的免疫细胞组成。(B) 条形图显示干预后3天对照组（D3C1）、DW组（D3DW1, D3DW2, D3DW3）和DW+ZZO组（D3DWZ1, D3DWZ2, D3DWZ3）之间免疫细胞组成的差异。(C) 在干预后7天分析小鼠伤口组织中的免疫细胞组成。(D) 条形图显示干预后7天对照组（D7C1, D7C2, D7C3）、DW组（D7DW1 and D7DW2）和DW+ZZO组（D7DWZ1, D7DWZ2, D7DWZ3）之间免疫细胞组成的差异。图3 (B) 在图形查看器中打开 PowerPoint

ZZO对糖尿病小鼠伤口中免疫细胞组成的影响。(A) 使用转录组测序数据、CIBERSORT算法和小鼠免疫细胞特征矩阵，在干预后3天分析小鼠伤口组织中的免疫细胞组成。(B) 条形图显示干预后3天对照组（D3C1）、DW组（D3DW1, D3DW2, D3DW3）和DW+ZZO组（D3DWZ1, D3DWZ2, D3DWZ3）之间免疫细胞组成的差异。(C) 在干预后7天分析小鼠伤口组织中的免疫细胞组成。(D) 条形图显示干预后7天对照组（D7C1, D7C2, D7C3）、DW组（D7DW1 and D7DW2）和DW+ZZO组（D7DWZ1, D7DWZ2, D7DWZ3）之间免疫细胞组成的差异。图3 (C) 在图形查看器中打开 PowerPoint

ZZO对糖尿病小鼠伤口中免疫细胞组成的影响。(A) 使用转录组测序数据、CIBERSORT算法和小鼠免疫细胞特征矩阵，在干预后3天分析小鼠伤口组织中的免疫细胞组成。(B) 条形图显示干预后3天对照组（D3C1）、DW组（D3DW1, D3DW2, D3DW3）和DW+ZZO组（D3DWZ1, D3DWZ2, D3DWZ3）之间免疫细胞组成的差异。(C) 在干预后7天分析小鼠伤口组织中的免疫细胞组成。(D) 条形图显示干预后7天对照组（D7C1, D7C2, D7C3）、DW组（D7DW1 and D7DW2）和DW+ZZO组（D7DWZ1, D7DWZ2, D7DWZ3）之间免疫细胞组成的差异。图3 (D) 在图形查看器中打开 PowerPoint

ZZO对糖尿病小鼠伤口中免疫细胞组成的影响。(A) 使用转录组测序数据、CIBERSORT算法和小鼠免疫细胞特征矩阵，在干预后3天分析小鼠伤口组织中的免疫细胞组成。(B) 条形图显示干预后3天对照组（D3C1）、DW组（D3DW1, D3DW2, D3DW3）和DW+ZZO组（D3DWZ1, D3DWZ2, D3DWZ3）之间免疫细胞组成的差异。(C) 在干预后7天分析小鼠伤口组织中的免疫细胞组成。(D) 条形图显示干预后7天对照组（D7C1, D7C2, D7C3）、DW组（D7DW1 and D7DW2）和DW+ZZO组（D7DWZ1, D7DWZ2, D7DWZ3）之间免疫细胞组成的差异。图3 (D) 在图形查看器中打开 PowerPoint

ZZO对糖尿病小鼠伤口中免疫细胞组成的影响。(A) 使用转录组测序数据、CIBERSORT算法和小鼠免疫细胞特征矩阵，在干预后3天分析小鼠伤口组织中的免疫细胞组成。(B) 条形图显示干预后3天对照组（D3C1）、DW组（D3DW1, D3DW2, D3DW3）和DW+ZZO组（D3DWZ1, D3DWZ2, D3DWZ3）之间免疫细胞组成的差异。(C) 在干预后7天分析小鼠伤口组织中的免疫细胞组成。(D) 条形图显示干预后7天对照组（D7C1, D7C2, D7C3）、DW组（D7DW1 and D7DW2）和DW+ZZO组（D7DWZ1, D7DWZ2, D7DWZ3）之间免疫细胞组成的差异。图3 (C) 在图形查看器中打开 PowerPoint

ZZO对糖尿病小鼠伤口中免疫细胞组成的影响。(A) 使用转录组测序数据、CIBERSORT算法和小鼠免疫细胞特征矩阵，在干预后3天分析小鼠伤口组织中的免疫细胞组成。(B) 条形图显示干预后3天对照组（D3C1）、DW组（D3DW1, D3DW2, D3DW3）和DW+ZZO组（D3DWZ1, D3DWZ2, D3DWZ3）之间免疫细胞组成的差异。(C) 在干预后7天分析小鼠伤口组织中的免疫细胞组成。(D) 条形图显示干预后7天对照组（D7C1, D7C2, D7C3）、DW组（D7DW1 and D7DW2）和DW+ZZO组（D7DWZ1, D7DWZ2, D7DWZ3）之间免疫细胞组成的差异。图3 (D) 在图形查看器中打开 PowerPoint

ZZO对糖尿病小鼠伤口中免疫细胞组成的影响。(A) 使用转录组测序数据、CIBERSORT算法和小鼠免疫细胞特征矩阵，在干预后3天分析小鼠伤口组织中的免疫细胞组成。(B) 条形图显示干预后3天对照组（D3C1）、DW组（D3DW1, D3DW2, D3DW3）和DW+ZZO组（D3DWZ1, D3DWZ2, D3DWZ3）之间免疫细胞组成的差异。(C) 在干预后7天分析小鼠伤口组织中的免疫细胞组成。(D) 条形图显示干预后7天对照组（D7C1, D7C2, D7C3）、DW组（D7DW1 and D7DW2）和DW+ZZO组（D7DWZ1, D7DWZ2, D7DWZ3）之间免疫细胞组成的差异。图3 (D) 在图形查看器中打开 PowerPoint

ZZO对糖尿病小鼠伤口中免疫细胞组成的影响。(A) 使用转录组测序数据、CIBERSORT算法和小鼠免疫细胞特征矩阵，在干预后3天分析小鼠伤口组织中的免疫细胞组成。(B) 条形图显示干预后3天对照组（D3C1）、DW组（D3DW1, D3DW2, D3DW3）和DW+ZZO组（D3DWZ1, D3DWZ2, D3DWZ3）之间免疫细胞组成的差异。(C) 在干预后7天分析小鼠伤口组织中的免疫细胞组成。(D) 条形图显示干预后7天对照组（D7C1, D7C2, D7C3）、DW组（D7DW1 and D7DW2）和DW+ZZO组（D7DWZ1, D7DWZ2, D7DWZ3）之间免疫细胞组成的差异。图3 (C) 在图形查看器中打开 PowerPoint

ZZO对糖尿病小鼠伤口中免疫细胞组成的影响。(A) 使用转录组测序数据、CIBERSORT算法和小鼠免疫细胞特征矩阵，在干预后3天分析小鼠伤口组织中的免疫细胞组成。(B) 条形图显示干预后3天对照组（D3C1）、DW组（D3DW1, D3DW2, D3DW3）和DW+ZZO组（D3DWZ1, D3DWZ2, D3DWZ3）之间免疫细胞组成的差异。(C) 在干预后7天分析小鼠伤口组织中的免疫细胞组成。(D) 条形图显示干预后7天对照组（D7C1, D7C2, D7C3）、DW组（D7DW1 and D7DW2）和DW+ZZO组（D7DWZ1, D7DWZ2, D7DWZ3）之间免疫细胞组成的差异。图3 (D) 在图形查看器中打开 PowerPoint

ZZO对糖尿病小鼠伤口中免疫细胞组成的影响。(A) 使用转录组测序数据、CIBERSORT算法和小鼠免疫细胞特征矩阵，在干预后3天分析小鼠伤口组织中的免疫细胞组成。(B) 条形图显示干预后3天对照组（D3C1）、DW组（D3DW1, D3DW2, D3DW3）和DW+ZZO组（D3DWZ1, D3DWZ2, D3DWZ3）之间免疫细胞组成的差异。图3 (C) 在图形查看器中打开 PowerPoint

ZZO对糖尿病小鼠伤口中免疫细胞组成的影响。(A) 使用转录组测序数据、CIBERSORT算法和小鼠免疫细胞特征矩阵，在干预后3天分析小鼠伤口组织中的免疫细胞组成。(B) 条形图显示干预后3天对照组（D3C1）、DW组（D3DW1, D3DW2, D3DW3）和DW+ZZO组（D3DWZ1, D3DWZ2, D3DWZ3）之间免疫细胞组成的差异。(C) 在干预后7天分析小鼠伤口组织中的免疫细胞组成。(D) 条形图显示干预后7天对照组（D7C1, D7C2, D7C3）、DW组（D7DW1 and D7DW2）和DW+ZZO组（D7DWZ1, D7DWZ2, D7DWZ3）之间免疫细胞组成的差异。图3 (D) 在图形查看器中打开 PowerPoint

ZZO对糖尿病小鼠伤口中免疫细胞组成的影响。(A) 使用转录组测序数据、CIBERSORT算法和小鼠免疫细胞特征矩阵，在干预后3天分析小鼠伤口组织中的免疫细胞组成。(B) 条形图显示干预后3天对照组（D3C1）、DW组（D3DW1, D3DW2, D3DW3）和DW+ZZO组（D3DWZ1, D3DWZ2, D3DWZ3）之间免疫细胞组成的差异。图3 (D) 在图形查看器中打开 PowerPoint

ZZO对糖尿病小鼠伤口中免疫细胞组成的影响。(A) 使用转录组测序数据、CIBERSORT算法和小鼠免疫细胞特征矩阵，在干预后3天分析小鼠伤口组织中的免疫细胞组成。(B) 条形图显示干预后3天对照组（D3C1）、DW组（D3DW1, D3DW2, D3DW3）和DW+ZZO组（D3DWZ1, D3DWZ2, D3DWZ3）之间免疫细胞组成的差异。(C) 在干预后7天分析小鼠伤口组织中的免疫细胞组成。(D) 条形图显示干预后7天对照组（D7C1, D7C2, D7C3）、DW组（D7DW1 and D7DW2）和DW+ZZO组（D7DWZ1, D7DWZ2, D7DWZ3）之间免疫细胞组成的差异。图3 (D) 在图形查看器中打开 PowerPoint

ZZO对糖尿病小鼠伤口中免疫细胞组成的影响。(A) 使用转录组测序数据、CIBERSORT算法和小鼠免疫细胞特征矩阵，在干预后3天分析小鼠伤口组织中的免疫细胞组成。(B) 条形图显示干预后3天对照组（D3C1）、DW组（D3DW1, D3DW2, D3DW3）和DW+ZZO组（D3DWZ1, D3DWZ2, D3DWZ3）之间免疫细胞组成的差异。(C) 在干预后7天分析小鼠伤口组织中的免疫细胞组成。(D) 条形图显示干预后7天对照组（D7C1, D7C2, D7C3）、DW组（D7DW1 and D7DW2）和DW+ZZO组（D7DWZ1, D7DWZ2, D7DWZ3）之间免疫细胞组成的差异。图3 (D) 在图形查看器中打开 PowerPoint

ZZO对糖尿病小鼠伤口中免疫细胞组成的影响。(A) 使用转录组测序数据、CIBERSORT算法和小鼠免疫细胞特征矩阵，在干预后3天分析小鼠伤口组织中的免疫细胞组成。(B) 条形图显示干预后3天对照组（D3C1）、DW组（D3DW1, D3DW2, D3DW3）和DW+ZZO组（D3DWZ1, D3DWZ2, D3DWZ3）之间免疫细胞组成的差异图5（B）在图形查看器中打开（PowerPoint）

ZZO抑制糖尿病小鼠伤口中MMP-9和TNF-α的表达。(A) 代表性的免疫组化（IHC）图像显示了治疗后第3天和第7天糖尿病小鼠伤口组织中的MMP-9表达情况。刻度尺：50 μm。(B) 基于平均光密度（MOD）值对相对MMP-9表达水平进行定量分析，并与对照组进行标准化。(C) 代表性的IHC图像显示了治疗后第3天和第7天糖尿病小鼠伤口组织中的TNF-α表达情况。刻度尺：50 μm。(D) 基于MOD值对相对TNF-α表达水平进行定量分析，并与对照组进行标准化。数据以每组三只小鼠的平均值±标准差表示（n=3）。使用单因素ANOVA后进行Tukey事后检验来确定统计显著性；***p < 0.01被认为具有统计显著性。图5（C）在图形查看器中打开（PowerPoint）

ZZO抑制糖尿病小鼠伤口中MMP-9和TNF-α的表达。(A) 代表性的免疫组化（IHC）图像显示了治疗后第3天和第7天糖尿病小鼠伤口组织中的MMP-9表达情况。刻度尺：50 μm。(B) 基于平均光密度（MOD）值对相对MMP-9表达水平进行定量分析，并与对照组进行标准化。(C) 代表性的IHC图像显示了治疗后第3天和第7天糖尿病小鼠伤口组织中的TNF-α表达情况。刻度尺：50 μm。(D) 基于MOD值对相对TNF-α表达水平进行定量分析，并与对照组进行标准化。数据以每组三只小鼠的平均值±标准差表示（n=3）。使用单因素ANOVA后进行Tukey事后检验；***p < 0.01被认为具有统计显著性。图5（D）在图形查看器中打开（PowerPoint）

ZZO抑制糖尿病小鼠伤口中MMP-9和TNF-α的表达。(A) 代表性的免疫组化（IHC）图像显示了治疗后第3天和第7天糖尿病小鼠伤口组织中的MMP-9表达情况。刻度尺：50 μm。(B) 基于平均光密度（MOD）值对相对MMP-9表达水平进行定量分析，并与对照组进行标准化。(C) 代表性的IHC图像显示了治疗后第3天和第7天糖尿病小鼠伤口组织中的TNF-α表达情况。刻度尺：50 μm。(D) 基于MOD值对相对TNF-α表达水平进行定量分析，并与对照组进行标准化。数据以每组三只小鼠的平均值±标准差表示（n=3）。使用单因素ANOVA后进行Tukey事后检验；***p < 0.01被认为具有统计显著性。图5（D）在图形查看器中打开（PowerPoint）

ZZO抑制糖尿病小鼠伤口中MMP-9和TNF-α的表达。(A) 代表性的免疫组化（IHC）图像显示了治疗后第3天和第7天糖尿病小鼠伤口组织中的MMP-9表达情况。刻度尺：50 μm。(B) 基于平均光密度（MOD）值对相对MMP-9表达水平进行定量分析，并与对照组进行标准化。(C) 代表性的IHC图像显示了治疗后第3天和第7天糖尿病小鼠伤口组织中的TNF-α表达情况。刻度尺：50 μm。(D) 基于MOD值对相对TNF-α表达水平进行定量分析，并与对照组进行标准化。数据以每组三只小鼠的平均值±标准差表示（n=3）。使用单因素ANOVA后进行Tukey事后检验；***p < 0.01被认为具有统计显著性。

3.5. ZZO抑制HMC-1人类和P815小鼠肥大细胞的IgE诱导的激活和脱颗粒作用

为了直接评估ZZO对肥大细胞的影响，首先确定了最佳工作浓度。HMC-1和P815细胞分别暴露于50、100、200、400、800、1600和3200 μg/mL的ZZO中，并使用CCK-8测定法量化细胞存活率抑制率。如图6A所示，ZZO的10%抑制浓度（IC10）分别为HMC-1细胞的325.7 μg/mL和P815细胞的295.2 μg/mL。基于这些结果，选择了200 μg/mL作为工作浓度——该浓度低于两种细胞系的IC10，确保了最小的细胞毒性同时保持足够的生物活性。在所有后续评估肥大细胞激活和脱颗粒的实验中，HMC-1和P815细胞在IgE/DNP刺激前用200 μg/mL ZZO预处理1小时。图6（A）在图形查看器中打开（PowerPoint）

ZZO抑制IgE介导的肥大细胞激活和脱颗粒作用。(A) 通过CCK-8测定法测量的HMC-1和P815细胞中ZZO的剂量-反应曲线（n=6）。虚线表示IC10值。(B) 在有或没有200 μg/mL ZZO的情况下，IgE/DNP交联后肥大细胞颗粒的典型甲苯蓝染色。刻度尺：50 μm。(C) 通过Fluo-4 AM荧光可视化细胞内Ca2+流动。刻度尺：50 μm。(D) 流式细胞术直方图显示有或没有200 μg/mL ZZO预处理的IgE激活细胞中的Ca2+强度。(E) β-六糖胺酶释放的定量（***p < 0.01）。(F) 上清液中的组胺浓度（***p < 0.01）。(G) 上清液中的TNF-α水平（***p < 0.01）。图6（B）在图形查看器中打开（PowerPoint）

ZZO抑制IgE介导的肥大细胞激活和脱颗粒作用。(A) 通过CCK-8测定法测量的HMC-1和P815细胞中ZZO的剂量-反应曲线（n=6）。虚线表示IC10值。(B) 在有或没有200 μg/mL ZZO的情况下，IgE/DNP交联后肥大细胞颗粒的典型甲苯蓝染色。刻度尺：50 μm。(C) 通过Fluo-4 AM荧光可视化细胞内Ca2+流动。刻度尺：50 μm。(D) 流式细胞术直方图显示有或没有200 μg/mL ZZO预处理的IgE激活细胞中的Ca2+强度。(E) β-六糖胺酶释放的定量（***p < 0.01）。(F) 上清液中的组胺浓度（***p < 0.01）。(G) 上清液中的TNF-α水平（***p < 0.01）。图6（C）在图形查看器中打开（PowerPoint）

ZZO抑制IgE介导的肥大细胞激活和脱颗粒作用。(A) 通过CCK-8测定法测量的HMC-1和P815细胞中ZZO的剂量-反应曲线（n=6）。虚线表示IC10值。(B) 在有或没有200 μg/mL ZZO的情况下，IgE/DNP交联后肥大细胞颗粒的典型甲苯蓝染色。刻度尺：50 μm。(C) 通过Fluo-4 AM荧光可视化细胞内Ca2+流动。刻度尺：50 μm。(D) 流式细胞术直方图显示有或没有200 μg/mL ZZO预处理的IgE激活细胞中的Ca2+强度。(E) β-六糖胺酶释放的定量（***p < 0.01）。(F) 上清液中的组胺浓度（***p < 0.01）。(G) 上清液中的TNF-α水平（***p < 0.01）。图6（D）在图形查看器中打开（PowerPoint）

ZZO抑制IgE介导的肥大细胞激活和脱颗粒作用。(A) 通过CCK-8测定法测量的HMC-1和P815细胞中ZZO的剂量-反应曲线（n=6）。虚线表示IC10值。(B) 在有或没有200 μg/mL ZZO的情况下，IgE/DNP交联后肥大细胞颗粒的典型甲苯蓝染色。刻度尺：50 μm。(C) 通过Fluo-4 AM荧光可视化细胞内Ca2+流动。刻度尺：50 μm。(D) 流式细胞术直方图显示有或没有200 μg/mL ZZO预处理的IgE激活细胞中的Ca2+强度。(E) β-六糖胺酶释放的定量（***p < 0.01）。(F) 上清液中的组胺浓度（***p < 0.01）。(G) 上清液中的TNF-α水平（***p < 0.01）。图6（E）在图形查看器中打开（PowerPoint）

ZZO抑制IgE介导的肥大细胞激活和脱颗粒作用。(A) 通过CCK-8测定法测量的HMC-1和P815细胞中ZZO的剂量-反应曲线（n=6）。虚线表示IC10值。(B) 在有或没有200 μg/mL ZZO的情况下，IgE/DNP交联后肥大细胞颗粒的典型甲苯蓝染色。刻度尺：50 μm。(C) 通过Fluo-4 AM荧光可视化细胞内Ca2+流动。刻度尺：50 μm。(D) 流式细胞术直方图显示有或没有200 μg/mL ZZO预处理的IgE激活细胞中的Ca2+强度。(E) β-六糖胺酶释放的定量（***p < 0.01）。(F) 上清液中的组胺浓度（***p < 0.01）。(G) 上清液中的TNF-α水平（***p < 0.01）。图6（F）在图形查看器中打开（PowerPoint）

ZZO抑制IgE介导的肥大细胞激活和脱颗粒作用。(A) 通过CCK-8测定法测量的HMC-1和P815细胞中ZZO的剂量-反应曲线（n=6）。虚线表示IC10值。(B) 在有或没有200 μg/mL ZZO的情况下，IgE/DNP交联后肥大细胞颗粒的典型甲苯蓝染色。刻度尺：50 μm。(C) 通过Fluo-4 AM荧光可视化细胞内Ca2+流动。刻度尺：50 μm。(D) 流式细胞术直方图显示有或没有200 μg/mL ZZO预处理的IgE激活细胞中的Ca2+强度。(E) β-六糖胺酶释放的定量（***p < 0.01）。(F) 上清液中的组胺浓度（***p < 0.01）。(G) 上清液中的TNF-α水平（***p < 0.01）。图6（G）在图形查看器中打开（PowerPoint）

ZZO抑制IgE介导的肥大细胞激活和脱颗粒作用。(A) 通过CCK-8测定法测量的HMC-1和P815细胞中ZZO的剂量-反应曲线（n=6）。虚线表示IC10值。(B) 在有或没有200 μg/mL ZZO的情况下，IgE/DNP交联后肥大细胞颗粒的典型甲苯蓝染色。刻度尺：50 μm。(C) 通过Fluo-4 AM荧光可视化细胞内Ca2+流动。刻度尺：50 μm。(D) 流式细胞术直方图显示有或没有200 μg/mL ZZO预处理的IgE激活细胞中的Ca2+强度。(E) β-六糖胺酶释放的定量（***p < 0.01）。(F) 上清液中的组胺浓度（***p < 0.01）。(G) 上清液中的TNF-α水平（***p < 0.01）。图6（F）在图形查看器中打开（PowerPoint）

ZZO抑制IgE介导的肥大细胞激活和脱颗粒作用。(A) 通过CCK-8测定法测量的HMC-1和P815细胞中ZZO的剂量-反应曲线（n=6）。虚线表示IC10值。(B) 在有或没有200 μg/mL ZZO的情况下，IgE/DNP交联后肥大细胞颗粒的典型甲苯蓝染色。刻度尺：50 μm。(C) 通过Fluo-4 AM荧光可视化细胞内Ca2+流动。刻度尺：50 μm。(D) 流式细胞术直方图显示有或没有200 μg/mL ZZO预处理的IgE激活细胞中的Ca2+强度。(E) β-六糖胺酶释放的定量（***p < 0.01）。(F) 上清液中的组胺浓度（***p < 0.01）。(G) 上清液中的TNF-α水平（***p < 0.01）。图6（G）在图形查看器中打开（PowerPoint）

ZZO抑制IgE介导的肥大细胞激活和脱颗粒作用。(A) 通过CCK-8测定法测量的HMC-1和P815细胞中ZZO的剂量-反应曲线（n=6）。虚线表示IC10值。(B) 在有或没有200 μg/mL ZZO的情况下，IgE/DNP交联后肥大细胞颗粒的典型甲苯蓝染色。刻度尺：50 μm。(C) 通过Fluo-4 AM荧光可视化细胞内Ca2+流动。刻度尺：50 μm。(D) 流式细胞术直方图显示有或没有200 μg/mL ZZO预处理的IgE激活细胞中的Ca2+强度。(E) β-六糖胺酶释放的定量（***p < 0.01）。(F) 上清液中的组胺浓度（***p < 0.01）。(G) 上清液中的TNF-α水平（***p < 0.01）。图6（E）在图形查看器中打开（PowerPoint）

ZZO抑制IgE介导的肥大细胞激活和脱颗粒作用。(A) 通过CCK-8测定法测量的HMC-1和P815细胞中ZZO的剂量-反应曲线（n=6）。虚线表示IC10值。(B) 在有或没有200 μg/mL ZZO的情况下，IgE/DNP交联后肥大细胞颗粒的典型甲苯蓝染色。刻度尺：50 μm。(C) 通过Fluo-4 AM荧光可视化细胞内Ca2+流动。刻度尺：50 μm。(D) 流式细胞术直方图显示有或没有200 μg/mL ZZO预处理的IgE激活细胞中的Ca2+强度。(E) β-六糖胺酶释放的定量（***p < 0.01）。(F) 上清液中的组胺浓度（***p < 0.01）。(G) 上清液中的TNF-α水平（***p < 0.01）。图6（F）在图形查看器中打开（PowerPoint）

ZZO抑制IgE介导的肥大细胞激活和脱颗粒作用。(A) 通过CCK-8测定法测量的HMC-1和P815细胞中ZZO的剂量-反应曲线（n=6）。虚线表示IC10值。(B) 在有或没有200 μg/mL ZZO的情况下，IgE/DNP交联后肥大细胞颗粒的典型甲苯蓝染色。刻度尺：50 μm。(C) 通过Fluo-4 AM荧光可视化细胞内Ca2+流动。刻度尺：50 μm。(D) 流式细胞术直方图显示有或没有200 μg/mL ZZO预处理的IgE激活细胞中的Ca2+强度。(E) β-六糖胺酶释放的定量（***p < 0.01）。(F) 上清液中的组胺浓度（***p < 0.01）。(G) 上清液中的TNF-α水平（***p < 0.01）。图6（G）在图形查看器中打开（PowerPoint）

ZZO抑制IgE介导的肥大细胞激活和脱颗粒作用。(A) 通过CCK-8测定法测量的HMC-1和P815细胞中ZZO的剂量-反应曲线（n=6）。虚线表示IC10值。(B) 在有或没有200 μg/mL ZZO的情况下，IgE/DNP交联后肥大细胞颗粒的典型甲苯蓝染色。刻度尺：50 μm。(C) 通过Fluo-4 AM荧光可视化细胞内Ca2+流动。刻度尺：50 μm。(D) 流式细胞术直方图显示有或没有200 μg/mL ZZO预处理的IgE激活细胞中的Ca2+强度。(E) β-六糖胺酶释放的定量（***p < 0.01）。(F) 上清液中的组胺浓度（***p < 0.01）。(G) 上清液中的TNF-α水平（***p < 0.01）。图6（E）在图形查看器中打开（PowerPoint）

ZZO抑制IgE介导的肥大细胞激活和脱颗粒作用。(A) 通过CCK-8测定法测量的HMC-1和P815细胞中ZZO的剂量-反应曲线先前的临床证据表明，ZZO可以加速糖尿病足（DFU）的愈合，减少炎症细胞的浸润以及溃疡组织中的炎症因子水平[18, 28, 29]。在我们的验证研究中，TB染色显示DFU患者的溃疡组织中有大量的肥大细胞脱颗粒现象，而ZZO治疗显著减弱了这一现象。这项研究不仅证实了DFU组织中肥大细胞功能的异常变化，还揭示了ZZO在调节肥大细胞行为方面的潜力。这些发现具有重要意义，因为它们为开发专门针对肥大细胞的新型DFU治疗策略奠定了基础。新兴证据表明，肥大细胞稳定剂（如色甘酸钠（DSCG）[8]和MCS-01 [30]）可以促进糖尿病小鼠模型的伤口愈合。在我们的研究中，利用STZ诱导的糖尿病小鼠伤口模型，我们观察到ZZO的应用有助于伤口愈合。尽管样本量相对较小，组间差异未达到统计学显著性，但免疫细胞组成分析表明ZZO可能抑制糖尿病溃疡模型中的肥大细胞活化。与临床样本一致，糖尿病溃疡组织中存在明显的肥大细胞脱颗粒现象；然而，ZZO治疗减少了这种脱颗粒。此外，糖尿病溃疡组织中的MMP-9和TNF-α水平升高，但在ZZO处理组中降低。考虑到这些炎症因子是肥大细胞活化后释放的主要介质，可以推断ZZO可能通过抑制肥大细胞活化从而减少炎症因子的分泌，从而促进伤口愈合。这些发现对于未来探索ZZO在糖尿病足治疗中的潜力以及开发针对肥大细胞的创新疗法具有重大意义。在DFU的局部微环境中，许多因素导致肥大细胞持续活化，包括IgE和过敏原、高血糖、胰蛋白酶、炎症细胞因子（如IL-1β和IL-6）、趋化因子以及补体成分[15, 25]。IgE/DNP交联模型是研究肥大细胞活化常用的实验模型之一[31–33]。在我们的研究中，我们观察到IgE/DNP交联激活了HMC-1和P815细胞，导致显著的肥大细胞脱颗粒。然而，ZZO治疗有效抑制了这一脱颗粒过程。此外，Ca2+离子染色、β-六糖胺酶释放测定以及HIS和TNF-α水平的定量共同证实了ZZO有效抑制了肥大细胞活化。这表明其在调节肥大细胞功能方面的潜力，并提示其在治疗炎症性疾病中的潜在应用。当IgE与肥大细胞上的FcεRI受体结合时，过敏原的进入会促使IgE结合的FcεRI发生交联，从而激活受体。FcεRI受体由一个结合IgE的α亚基以及含有免疫受体酪氨酸基活化基序（ITAMs）的β和γ亚基组成。随后，Lyn激酶磷酸化这些ITAMs，导致Syk激酶的活化。Syk再磷酸化PLCγ1，将PIP2分解为IP3和DAG。IP3增加细胞质中的Ca2+水平，导致Ca2+内流。同时，PI3K将PIP2转化为PIP3，激活Akt。此外，FcεRI的活化还启动了IKK/NFκB和MAPK（p38、JNK和ERK）通路。NFκB激活炎症基因的转录，而MAPKs调节炎症和应激反应。这些通路共同调控肥大细胞脱颗粒，导致HIS和细胞因子的释放[34–36]。在本研究中，我们发现ZZO抑制了IgE/DNP交联介导的PI3K/AKT、SYK/LYN/PLCγ1和IKK/NFκB信号通路以及P38/JNK/ERK通路的活化。根据通路层次结构，Lyn/Syk的磷酸化是FcεRI活化后的上游事件，而PI3K/Akt和NF-κB是整合多个受体驱动信号以调节基因转录和脱颗粒的下游效应器。因此，我们的数据表明ZZO主要干扰早期的Lyn/Syk–PLCγ1轴，进而抑制下游的PI3K/Akt和NF-κB信号通路。这种层次化的抑制机制解释了ZZO如何通过同时抑制上游受体磷酸化和下游炎症放大来减弱肥大细胞活化和脱颗粒。ZZO是一种从中药提取的局部制剂，包含六种草药成分：朱砂、Arnebia euchroma、黄芪、龙血树树脂、驴胶和薄荷脑。本研究的临床结果以及之前的临床试验表明，局部使用ZZO对DFU患者具有显著的治疗效果。ZZO不仅加速伤口闭合，还减少了溃疡面积和深度，缓解疼痛，并改善了局部微循环灌注。这些结果与早期证据一致，表明ZZO对各种类型的慢性下肢溃疡有效，提示其在慢性炎症性伤口中的广泛临床适用性[37–39]。在我们之前的研究中，进行了UPLC-HRMS分析以化学表征和标准化ZZO提取物，确保批次间的一致性和分析结果的可靠性。共鉴定出21种主要生物活性成分，其中四种关键成分——桉叶油醇、pinocembrin、异戊烯基shikonin和daidzein——已被报道具有稳定肥大细胞或抗炎作用[18, 40–43]。具体来说，桉叶油醇抑制SYK和LYN[40]，pinocembrin和异戊烯基shikonin阻断NFκB信号[41]，daidzein抑制PI3K/AKT信号[43]和TNF-α/IL-6的分泌[44]。这种多组分系统协同作用，减弱FcεRI近端信号（LYN/SYK/PLCγ），下调炎症级联反应（IKK/NFκB和MAPKs），并抑制脱颗粒和介质释放。因此，这为ZZO通过稳定肥大细胞和缓解炎症在DFU治疗中的临床疗效提供了机制基础。总之，我们的综合研究表明，ZZO通过破坏由肥大细胞驱动的炎症级联反应来解决DFU的核心病理生理机制。通过多模式抑制FcεRI近端信号（LYN/SYK/PLCγ/PI3K-Akt）和下游效应器（IKK/NFκB和MAPKs），ZZO显著抑制了肥大细胞脱颗粒。这些发现为开发针对肥大细胞的DFU疗法提供了强有力的依据，并突显了ZZO作为有前景的治疗候选物的潜力。