《Molecular & Cellular Proteomics》：N-glycosylation of AXL receptor tyrosine kinase regulates its stability, phosphorylation and oncogenic function
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本研究针对AXL受体酪氨酸激酶在肿瘤进展中的作用机制，探究了其关键的翻译后修饰——N-糖基化的功能。研究人员通过糖蛋白组学等技术，系统解析了AXL的糖基化位点与糖型，并揭示糖基化成熟对其膜转运、磷酸化激活、蛋白稳定性及促增殖功能至关重要，尤其发现保守位点N43和N339是调控其活性的关键。该工作为理解受体酪氨酸激酶的糖基化调控提供了新见解，并为针对AXL的癌症治疗策略提供了潜在新靶点。
在癌症的复杂演进过程中，受体酪氨酸激酶(RTK)扮演着驱动细胞生长、存活和转移的关键角色。其中，AXL作为TAM (TYRO3, AXL, MER)受体酪氨酸激酶家族的重要成员，其在多种癌症（如肺癌、乳腺癌、胰腺癌）中高表达，与上皮-间质转化(EMT)、肿瘤侵袭转移、治疗耐药及免疫逃逸密切相关。因此，AXL已成为一个有潜力的癌症治疗靶点。然而，像许多膜蛋白一样，AXL的功能不仅取决于其基因表达水平，更受到一系列精密的翻译后修饰的调控。其中，糖基化——一种将糖链共价连接到蛋白质上的修饰——是影响蛋白质结构、稳定性、细胞内定位及功能的关键因素。尽管已知AXL是一种糖蛋白，但其N-连接糖基化（N-glycosylation）的具体特征、功能位点以及对AXL致癌活性的调控机制，此前仍不甚明晰。这阻碍了我们对AXL功能的全面理解，也限制了针对其糖基化环节开发新型治疗策略的可能性。为此，研究人员开展了一项系统性研究，旨在揭示AXL N-糖基化的全景图谱，并阐明其在AXL稳定性、激活及致癌信号传导中的核心作用。相关成果发表在《Molecular & Cellular Proteomics》上。
为开展本研究，作者团队运用了多项关键实验技术。在细胞模型方面，研究使用了包括乳腺癌细胞系（MDA-MB-231, HCC1395等）、卵巢癌细胞系（OVCAR8, HeyA8等）以及正常乳腺上皮细胞MCF10A在内的多种细胞。在分子与细胞生物学技术层面，核心方法包括：利用小分子抑制剂kifunensine抑制糖基化成熟；使用内切糖苷酶（Endo H和PNGase F）进行酶解脱糖基化分析；通过位点定向诱变构建AXL糖基化位点突变体（如N43Q）；利用免疫印迹(Western blot)检测AXL蛋白表达、磷酸化（如pY702）及下游信号通路（如p-AKT, p-ERK）；通过免疫荧光染色观察AXL的亚细胞定位；以及利用细胞增殖实验评估AXL突变体的功能。在组学与生物信息学分析方面，研究采用了基于质谱的糖蛋白组学(glycoproteomics)技术，对免疫沉淀富集的AXL进行酶解和LC-MS/MS分析，以鉴定其糖基化位点和糖链结构；并利用生物信息学工具（如pGlyco软件）进行数据分析，同时进行了蛋白质序列比对和进化保守性分析。
AXL在乳腺癌和卵巢癌细胞中被糖基化
研究人员首先在多种细胞系中观察到AXL蛋白以约120 kDa和110 kDa两条主条带形式存在，而非其理论分子量98 kDa。通过siRNA敲低、诱导过表达以及内切糖苷酶处理实验，证实这两条带均代表糖基化的AXL。其中，110 kDa条带对Endo H和PNGase F都敏感，代表携带高甘露糖型N-糖链的AXL；而120 kDa条带仅对PNGase F敏感，代表携带复杂型N-糖链的AXL。使用甘露糖苷酶I抑制剂kifunensine处理细胞，可导致AXL全部滞留在110 kDa的高甘露糖型形式，进一步证实了糖基化修饰的存在及其成熟过程。此外，对细胞培养上清中AXL胞外域可溶性形式(sAXL)的分析表明，sAXL主要携带复杂型N-糖链，但其产生不依赖于糖链的完全成熟。
糖基化对AXL膜转运和磷酸化至关重要
功能实验发现，抑制糖基化成熟（kifunensine处理）会导致AXL在胞质内积累，而减少其在细胞膜上的定位，表明糖基化是AXL正确转运至细胞膜所必需的。更重要的是，当用其配体GAS6激活AXL时，磷酸化的AXL几乎全部以复杂糖基化形式存在。内切糖苷酶消化实验进一步证实，AXL的磷酸化主要发生在其复杂糖基化形式上。这些结果提示，糖基化的成熟与AXL的膜定位及其激酶活性的激活紧密耦合。
AXL蛋白糖基化位点的鉴定
为了在分子水平上解析AXL的糖基化，研究采用了基于质谱的糖蛋白组学方法。通过对内源性高表达AXL的MDA-MB-231细胞和过表达HA标签AXL的HEK293T细胞进行免疫沉淀、多种蛋白酶酶解和LC-MS/MS分析，成功实现了AXL蛋白的高序列覆盖度（93.9%），并鉴定出5个N-糖基化位点：N43、N157、N198、N339和N345。分析显示，这些位点上的糖链存在显著的微观不均一性，包括高甘露糖型和复杂型糖链，其中复杂型糖链还伴有唾液酸化、岩藻糖化和平分型GlcNAc等修饰。位点N43和N157主要携带高甘露糖型结构，而N198和N345则呈现出高甘露糖与复杂型糖链的混合，其中N345还检测到了平分型GlcNAc修饰。
N-糖基化在AXL功能、细胞运输和稳定性中的作用
通过对11个脊椎动物物种的AXL蛋白序列进行比对，发现N43、N198、N339和N345这四个位点在进化上高度保守。为了探究单个糖基化位点的功能，研究团队构建了分别将这6个天冬酰胺(N)突变为谷氨酰胺(Q)的AXL单点突变体，并在MCF10A细胞中进行诱导表达。细胞增殖实验显示，与野生型AXL相比，N43Q和N339Q突变体显著削弱了AXL促进细胞增殖的能力，而其他位点突变的影响相对较小。免疫荧光实验表明，所有单点突变体均在一定程度上减少了AXL在膜上的定位，增加了其在胞质中的滞留，说明多个糖基化位点共同贡献于AXL的膜转运。蛋白质稳定性实验（环己酰亚胺处理）发现，所有六个单点突变体均表现出不同程度的稳定性下降，其中N198Q、N339Q、N345Q和N401Q突变体的蛋白降解更为迅速。最后，对关键位点N43和N339的深入分析显示，这两个位点的突变严重损害了AXL自身的磷酸化（自激活）及其下游MAPK/ERK通路的激活，但对PI3K/AKT通路的激活影响相对较小。
本研究通过整合生物化学、细胞生物学和糖蛋白组学方法，系统阐明了N-糖基化在调控AXL受体酪氨酸激酶功能中的核心作用。主要结论包括：第一，AXL在癌细胞中主要以高甘露糖型和复杂型两种糖基化形式存在，其糖基化成熟对于蛋白的正确膜定位至关重要。第二，AXL的激活（磷酸化）主要依赖于其复杂糖基化形式。第三，研究首次在蛋白水平鉴定了AXL的五个N-糖基化位点（N43, N157, N198, N339, N345），并揭示了其糖链结构的多样性和位点特异性。第四，功能研究表明，不同糖基化位点共同调控AXL的稳定性、亚细胞定位和信号输出，其中进化上高度保守的N43和N339位点对于AXL的磷酸化激活和促细胞增殖功能尤为关键。
在讨论部分，作者强调了这项工作的意义。它首次提供了AXL在癌症细胞中位点特异性的N-糖基化全景图，将特定的糖基化修饰与AXL的生物学功能直接联系起来。这项研究不仅深化了对AXL这一重要癌症靶点调控机制的理解，更重要的是，它揭示了靶向糖基化过程可能成为调节AXL活性的一种新策略。例如，干预N43或N339等关键位点的糖基化，或许能够特异性地抑制AXL的致癌功能，同时可能减少对正常生理功能的干扰，这为开发更精准的AXL抑制剂或联合治疗策略提供了新的思路和潜在靶点。总之，该工作突出了翻译后修饰，特别是糖基化，在精确调控受体酪氨酸激酶功能中的重要性，为癌症生物学和治疗学研究开辟了新的视角。
