小龙虾与水稻的共养模式有助于调节稻田的土壤肥力，并维持土壤微生物群落组成和功能的稳定性

《Advanced Biotechnology》：The crayfish-rice coculture model contributes to regulating the soil fertility of rice fields and maintaining the stability of soil microbial community composition and function

　　摘要：稻鱼共养是一种经典的可持续农业模式；然而，其维持土壤肥力和微生物群落稳定性的微观生态机制仍不甚明了。我们进行了一项为期13个月的野外实验，比较了三种栽培系统：小龙虾-水稻共养（CRCE）、小龙虾-水草共养（CWCE）和单一水稻栽培（RME），并整合了物理化学分析、16S rRNA测序、宏基因组学、微生物网络分析以及零模型模拟。研究结果表明，共养系统，尤其是CRCE，通过碳封存（总碳：25.0–45.0 mg/g；总有机碳：15.0–35.0 mg/g）和维持氧化还原平衡（持续低氧化还原电位：-150至-50 mV）来提高土壤肥力，这与RME中观察到的极端氧化还原波动形成鲜明对比。这些稳定的土壤条件对微生物群落施加了确定性选择（CRCE中的均匀选择贡献为30%–50%，而RME中为10%–20%），使群落组装从随机漂变主导转变为可预测的演替。这种组装变化丰富了功能耦合的关键类群，包括铁还原菌（Geobacter）、硫氧化菌（Sulfuricurvum）和硝化菌（Nitrospira），这些菌群形成了以98.6%正相互作用的生态网络，并增强了与碳、氮和硫生物地球化学循环相关的功能基因库。宏基因组分析证实了这些发现，显示CRCE中涉及聚合物降解、硝化和硫酸盐还原的功能基因富集，支持了其增强的养分循环能力。我们建立了一个层次化的因果路径，其中生物扰动引起的环境稳定驱动了确定性群落组装，进而促进了关键类群的富集和功能整合。这一框架为解释小龙虾-水稻共养如何调节土壤肥力并维持人为设计的农业生态系统中的微生物群落组成和功能稳定性提供了机制上的解释。

1 引言
全球对粮食安全的需求以及集约化农业带来的环境压力，包括生态系统服务退化和非点源污染，造成了严重的紧张局势，使得同时保持土壤肥力和微生物生态系统稳定性的可持续农业模式成为当务之急。稻鱼共养被广泛认为是农业生态集约化的经典范例（Cui等人，2023年）。然而，其调节土壤肥力和维持群落稳定性的微生物机制仍不清楚。尽管这一模式被广泛采用，但驱动独特生物地球化学循环的微生物过程，特别是那些控制碳、氮和硫代谢的过程，尚未完全解码（Zhu等人，2023年）。虽然该模式的宏观生态效益，如减少农药使用、提高养分循环效率和稳定产量已有充分记录（Ren等人，2014年；Xie等人，2011年），但驱动这些生态系统服务的土壤相关过程仍缺乏机制上的解释。因此，一个关键的科学问题仍然存在：共养仅仅是改变了土壤的物理化学性质，还是能够主动重塑微生物群落组装和功能基因结构，构建一个自我维持且稳定的微生态系统，从而支撑土壤肥力和群落功能稳定性？

先前的研究从多个角度验证了稻鱼共养系统的农生态价值。例如，稻鱼系统可以减少68%的农药使用量（Xie等人，2011年），并通过互补养分利用提高氮利用效率24%（Cui等人，2023年）。传统的水稻-草鱼共养比集约化单一种植保持了更高的遗传多样性，从而减轻了近亲繁殖的负面影响。水稻冠层的遮荫效应使水温降低2–3°C，有效缓解了水生动物的热应激（Hu等人，2016年）。此外，鱼类的生物扰动使土壤氧化还原电位提高了15–20%，加速了有机物的周转（Yang等人，2017年）。这些宏观优势使稻鱼共养成为全球可持续农业的典范，联合国粮食及农业组织（FAO，2022年）将其列为全球重要农业遗产系统。然而，这些效益的微生物基础——特别是与土壤肥力维持和群落稳定性相关的方面——仍然很大程度上未得到探索。

共养系统不是静态的土地利用类型，而是经历持续生物工程的动态生态系统。作为具有经济价值的水生动物，小龙虾（Procambarus clarkii）不仅栖息在稻田中，还通过挖掘（深度可达50厘米）（Dorn和Wojdak，2004年）和食碎屑（占其饮食的62%±7%）（Barbaresi等人，2004年）在物理和化学上重构了土壤环境。其伴生植物——无论是水稻还是水草——通过根际效应和冠层遮荫进一步调节微环境条件（Hu等人，2016年）。这些生物因素相互作用，土壤微生物组既是这些相互作用的传感器也是效应器。例如，新的证据表明，在整合系统中，微生物组主要通过同化/异化硝酸盐还原将无机氮转化为有机形式，而不是通过产生污染物的反硝化作用，为提高氮同化能力提供了遗传基础（Zhang等人，2022年）。因此，共养系统调节土壤肥力和维持生态系统稳定性的能力在很大程度上取决于其土壤微生物组的稳定性。然而，直接支持这一理论推论的实证证据仍然很少，特别是那些整合长期时间动态、功能潜力和网络级相互作用的研究。更复杂的混养模型（如水稻-小龙虾-龟）对土壤健康和作物产量的长期生态效应和微生物机制也需通过长期实验系统地阐明（Li等人，2022年）。

现有的关于小龙虾-水稻共养的研究主要依赖于单时间点采样和16S rRNA基因扩增子测序。我们之前的比较研究也揭示了共养系统和单一种植系统之间土壤细菌群落组成的显著差异（Wei等人，2021年）。虽然这些研究记录了土壤细菌群落的组成变化（Zhang等人，2024年），但单时间点采样无法区分短暂的环境波动和系统性的制度变化——这排除了对群落稳定性和恢复力的评估，而这些变化只有在演替时间尺度上才能体现。群落组成的变化是否转化为与土壤肥力相关的代谢潜力的改变仍然未知。此外，微生物群落通过复杂的相互作用网络发挥作用，但共养如何重构这些网络的拓扑结构以增强功能稳定性仍大部分未得到探索。总体而言，这些研究空白掩盖了将小龙虾生物扰动效应与土壤微生物组稳定性及其肥力调节能力联系起来的因果路径。

为了填补这些空白，我们在湖北省潜江市进行了为期13个月的野外实验——这是中国小龙虾共养的核心区域。每月系统地从六个小龙虾-水稻共养（CRCE）、三个小龙虾-水草共养（CWCE）和三个水稻单一种植（RME）系统中采集土壤样本。测量了九个环境物理化学参数，并使用16S rRNA基因扩增子测序来表征细菌群落动态。此外，还对CRCE和RME系统的土壤样本进行了宏基因组测序，以解析控制碳、氮、磷和硫生物地球化学循环的功能基因库——这些是维持土壤肥力的关键过程。为此，我们提出了三个相互关联的科学问题：(i) 小龙虾-植物共养是否驱动土壤微生物组走向更稳定的演替轨迹，从而维持群落组成的稳定性，不同植物类型（水稻 vs. 水草）是否具有不同的稳定效果？(ii) 共养是否丰富了土壤微生物组的功能基因库，并增强了不同元素循环路径之间的功能耦合，从而调节土壤肥力潜力？(iii) 我们能否识别并验证一个层次化的因果路径：从“小龙虾生物扰动效应、环境过滤、关键类群选择、相互作用网络稳定、功能基因富集以维持肥力”？通过整合时间序列分析、网络生态学和功能宏基因组学，本研究旨在为人为设计的农业生态系统如何实现土壤微生物组稳定性和调节土壤肥力提供机制上的解释——将我们对可持续农业的理解从宏观观察推进到微观机制。

2 材料与方法
2.1 研究地点描述和土壤采样
本研究在中国湖北省潜江市潜江市的小龙虾-水稻养殖基地（112.48° E, 30.07° N）进行。该地区属于亚热带季风气候，年平均气温为16.1℃，年平均降水量为1,100毫米。选择了六个CRCE池塘（图1a）、三个CWCE池塘（图1b）和三个RME稻田（图1c）进行研究。

2.2 物理化学分析
土壤样本的温度（T）、氧化还原电位（ORP）和pH值在现场使用ZD-06仪器（中国）进行测量。总氮（TN）和总磷（TP）按照先前描述的方法（Wei等人，2021年）进行测量。总碳（TC）和有机碳（TOC）使用Aurora 1030分析仪（OI Analytical，美国）进行量化；铵（NH??-N）、亚硝酸盐（NO??-N）和硝酸盐（NO??-N）使用自动离散分析仪（Clever Chem380，DeChemTech，德国）通过靛酚蓝光谱法进行测量。采样地点的气候变量（年平均温度和降水量）根据地理坐标从WorldClim数据库（https://www.worldclim.org）中提取。

2.3 16S rRNA基因扩增子测序数据分析
使用DNeasy PowerSoil Pro Kit（Qiagen，德国）按照制造商的说明从每个土壤样本中提取0.5克总基因组DNA。使用引物338F（5'-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3'）和806R（5'-GGACTACHV GGGTWTCTAAT-3'）扩增细菌16S rRNA基因的V4-V5高变区。PCR产物被纯化、定量并混合至等摩尔浓度。测序在Illumina NovaSeq 6000平台（PE250）上由Meiji Bioinformatics Technology Co., Ltd.（上海，中国）进行。原始配对末端读段使用FLASH v1.2.7组装成全长序列（Magoc和Salzberg 2011）。Quantitative Insights Into Microbial Ecology（QIIME）管道（v1.7.0）用于质量过滤原始标签，去除低质量区域并保留高质量清洁标签。随后，通过将序列与Gold数据库进行比较，使用UCHIME（v8.0.1517）识别并移除了嵌合序列，从而获得了有效的读取结果（Edgar等人，2011年）。操作分类单元（OTUs）在97%的序列相似度下使用UPARSE流程进行聚类（Edgar，2013年）。每个OTU的代表性序列使用核糖体数据库项目（RDP）分类器（v2.2）在80%的置信阈值下进行分类学注释，参考了SILVA 138数据库（Wang等人，2007年）。使用MUSCLE进行多序列比对，以构建OTUs的系统发育树（Edgar，2004年）。为了减轻测序深度偏差，所有样本都被稀释到最小测序深度，生成了一个标准化的OTU丰度矩阵。使用QIIME计算了Alpha多样性指数（Chao1，Shannon）。基于Bray–Curtis距离矩阵，通过主坐标分析（PCoA）可视化了Beta多样性，以显示三个系统之间的细菌群落结构差异（Oksanen等人，2013年）。应用了999次排列的相似性分析（ANOSIM）来评估组间差异（Warton等人，2012年）。随机森林算法（500棵决策树）（Zhang等人，2018年）识别了CRCE和CWCE模式下土壤中的区分性分类单元。通过基于系统发育分箱的零模型分析（iCAMP）框架量化了所有系统中土壤群落组装的确定性和随机性过程（Ning等人，2020年）。对于iCAMP分析，根据使用R中的pheatmap和iCAMP包构建的系统发育树定义了系统发育分箱。系统发育信号使用'ps'参数进行评估，该参数根据iCAMP包内置函数确定的最佳值设置为0.2。零模型分析进行了1000次随机化，以确保选择、扩散和漂变过程的相对贡献得到稳健估计。根据软件包的建议，排除了包含少于20个OTU的分箱（Zhou和Ning，2017年）。冗余分析（RDA）结合蒙特卡洛排列测试（999次排列）阐明了土壤理化因素与细菌群落之间的关联。使用SparCC算法构建了非度量物种共现网络，以表征CRCE、CWCE和RME土壤中的细菌相互作用模式（Bastian等人，2009年）。基于随机矩阵理论（RMT）方法选择了ρ > 0.6的相关性阈值，该方法通过识别相关矩阵中随机和非随机关联之间的转折点自动确定适当的阈值。在应用假发现率（FDR）校正后，应用了0.01的P值阈值，以最小化虚假关联（Leps和Smilauer，2006年）。

2.4 土壤微生物组的宏基因组测序和分析
PE文库的构建使用了NEXTFLEX Rapid DNA-Seq Kit（Bioo Scientific，美国）。主要步骤包括适配子连接、磁珠选择以去除自连接的适配子片段、PCR扩增以富集文库模板，以及磁珠回收PCR产物以获得最终文库。随后，由上海Majorbio Bio-Pharm Technology Co., Ltd.在Illumina NovaSeq? X Plus平台（Illumina，美国）上进行了宏基因组测序。最终确定的模板DNA序列基于每个循环收集的荧光信号。获得原始数据后，使用fastp软件（版本0.20.0，https://github.com/OpenGene/fastp）从读取的3'和5'端修剪适配子序列。删除长度小于50 bp或在修剪后平均碱基质量分数低于20的读取，保留高质量序列。对于来自具有已发布基因组序列的宿主的样本，使用BWA软件（版本0.7.17，http://bio-bwa.sourceforge.net）将读取与宿主DNA序列对齐。显示高比对相似性的读取被视为潜在的污染样本并被删除。使用MEGAHIT软件（版本1.1.2，https://github.com/voutcn/megahit）组装了优化后的序列。（具体组装方法可以根据项目要求通过联系技术支持来确定）。从组装结果中选择了长度≥300 bp的contigs作为最终组装输出。使用Prodigal软件（版本2.6.3，https://github.com/hyattpd/Prodigal）预测这些contigs中的开放阅读框（ORFs）。选择核酸长度≥100 bp的基因并将其翻译成氨基酸序列（Li等人，2016年）。为了构建一个非冗余的基因目录，使用CD-HIT软件（版本4.7，http://weizhongli-lab.org/cd-hit/）对所有样本中的所有预测基因序列进行聚类（参数：90%同一性，90%覆盖率）。从每个簇中选择最长的序列作为代表性序列。随后，使用SOAPaligner软件（版本soap2.21 release，https://github.com/ShujiaHuang/SOAPaligner）将每个样本中的高质量读取与非冗余基因目录进行比对（95%同一性），以确定相应样本中每个基因的丰度（Kanehisa等人，2012年）。对于分类学和功能注释，使用Diamond软件（版本2.0.13，https://github.com/bbuchfink/diamond）对非冗余基因目录中的氨基酸序列分别进行BLASTP比对（e值≤1e-5），与NR数据库（Gemayel等人，2022年）和KEGG数据库（Smith等人，2005年）进行比对。使用与NR数据库相关联的分类学信息数据库获得分类学注释（Parks等人，2015年）。物种丰度计算为分配给该物种的基因丰度之和。根据KEGG注释结果，计算功能类别（如KO、Pathway、EC和Module）的丰度，作为分配给该特定功能类别的基因丰度之和（Rühlemann等人，2022年）。

2.5 统计分析
所有统计分析都是使用R软件（版本4.0.2）进行的。对于16S rRNA基因扩增子测序数据，使用Welch的双样本t检验比较了CRCE、CWCE和RME之间的Alpha多样性指数（Shannon和Chao1），显著性阈值分别设定为P < 0.05和P < 0.01（Hoffman，2019年）。基于Bray–Curtis差异矩阵，通过主坐标分析（PCoA）可视化了Beta多样性。应用了999次排列的排列多变量分析（PERMANOVA）来测试不同生境类型之间细菌群落结构的显著差异，并使用相似性分析（ANOSIM）来评估组间差异。使用Wilcoxon秩和检验识别了生境对之间差异丰富的细菌属。进行冗余分析（RDA）以研究细菌群落结构与环境因素之间的关系，显著性使用蒙特卡洛排列测试（999次排列）进行检验。计算Spearman秩相关系数以检查特定环境因素与细菌群落组成之间的关联（Myers和Sirois，2006年）。对于宏基因组功能基因数据，使用Welch的t检验比较了CRCE和RME之间功能基因的Alpha多样性指数。基于Bray–Curtis距离，使用PERMANOVA评估了两种生境之间整体功能基因组成的差异。使用Wilcoxon秩和检验并应用假发现率（FDR）校正，识别了CRCE和RME之间差异丰富的功能基因。进行Mantel检验以检查环境因素矩阵与功能基因组成矩阵之间的相关性，显著性水平表示为P < 0.05和P < 0.01。所有数据均以平均值±标准差表示，所有统计检验均为双侧检验。

3 结果
3.1 共培养系统重塑了土壤的理化环境
在13个月的采样期间，pH值（图1d）和ORP值（图1e）在CWCE、CRCE和RME之间表现出不同的模式。CWCE保持了相对稳定的pH值（5.5–7.0），略有波动（2018年4月为6.2，2018年11月为5.8）。相比之下，CRCE的pH值略低（5.0–6.5），2018年10月降至最低值5.2。RME的变异性更大（5.5–7.5），2018年7月达到峰值7.2，然后在2018年12月降至5.7。ORP趋势也有显著差异：CRCE始终保持较低水平（-150至-50 mV），CWCE更为稳定（-50至50 mV），而RME显示出极端的变异性（< -100至> 200 mV），2018年5月和2019年1月有显著峰值（200 mV和-150 mV）。CRCE的NH??-N水平变化较大（0.2–0.8 mg/g），2018年7月达到峰值（0.8 mg/g），2018年11月降至最低值（0.2 mg/g）。CWCE的NH??-N波动更大（0.1–1.0 mg/g），2018年8月达到最大值（1.0 mg/g），2018年12月降至最低值（0.1 mg/g），而RME保持较低但变化的浓度（0.2–0.6 mg/g），2018年6月达到峰值（0.5 mg/g）（图1f）。RME的NO??-N浓度波动较小（< 0.002 mg/g），2019年3月达到最大值，而CWCE和CRCE分别保持在0.0015 mg/g和0.001 mg/g以下（图1g）。NO??-N在RME中的变异性最大（0–0.08 mg/g），2018年11月达到峰值（0.07 mg/g）。相比之下，CWCE和CRCE的浓度较低且更稳定，分别保持在0.04 mg/g和0.03 mg/g以下（图1h）。CRCE的TN值（0.8–1.6 mg/g）低于CWCE（1.0–2.0 mg/g），2018年8月达到峰值1.8 mg/g。CRCE在2019年3月的TN值约为1.2 mg/g。RME的TN值最初相对稳定，但在采样期结束时浓度增加，2019年3月达到3.0 mg/g（图1i）。CRCE的TP值范围为0.05至0.5 mg/g，2018年12月达到峰值0.45 mg/g。CWCE的TP值（0.1–0.4 mg/g）低于RME，2018年4月为0.05 mg/g，2019年2月为0.8 mg/g（图1j）。CRCE的TOC值范围为15.0至35.0 mg/g，2018年11月达到峰值32.0 mg/g。CWCE的TOC值在10.0至30.0 mg/g之间波动，2018年10月达到峰值28.0 mg/g。RME的TOC值较低（5.0–20.0 mg/g），2018年7月达到峰值18.0 mg/g（图1k）。CWCE的TC值在20.0至40.0 mg/g之间变化，2018年8月达到峰值35.0 mg/g。CRCE的TC值相似（25.0–45.0 mg/g），2019年1月记录为30.0 mg/g。RME的TC浓度较低（10.0–30.0 mg/g），2018年9月达到峰值28.0 mg/g（图1l）。总体而言，与RME相比，CRCE显著增加了土壤的TC和TOC含量——这是有机物积累增加和土壤肥力提高的明确指标。此外，CRCE在整个13个月的实验期间保持了稳定的ORP值，这与RME观察到的极端ORP波动形成鲜明对比。这些结果表明，CRCE同时提高了土壤肥力（通过碳封存）并增强了环境稳定性（通过氧化还原缓冲），这两个相互关联但不同的土壤健康维度共同支撑了农业系统的长期可持续性。

3.2 共培养改变了土壤微生物群落的结构和组成
基于16S rRNA基因扩增子测序，比较了CRCE、CWCE和RME系统之间土壤微生物群的Alpha和Beta多样性。Shannon指数（图2a）在CRCE土壤中最高（6.5 ± 0.3），其次是CWCE（5.8 ± 0.4），RME最低（5.2 ± 0.5）；Chao1指数（图2b）显示CRCE的物种丰富度最高（2,850 ± 120），CWCE居中（2,450 ± 150），RME最低（2,100 ± 180），表明共培养系统，特别是CRCE，比水稻单作支持更大的微生物多样性和物种丰富度。基于Bray–Curtis距离的PCoA显示了微生物群的明显聚类，前两个主坐标分别解释了总变异的41.25%和9.41%（图2c）。ANOSIM确认了三组之间的显著差异（R = 0.588，P < 0.001），表明种植系统对土壤微生物群落结构有强烈的决定性影响。

图2
基于16S rRNA基因测序的多样性、群落组成和独特物种分析。使用Welch的t检验（P < 0.05；P < 0.01）对CRCE、CWCE和RME生境之间的Shannon指数（a）和Chao1指数（b）进行统计比较。基于Bray–Curtis距离的土壤细菌群落结构的PCoA（c）。CRCE（d）、CWCE（e）和RME（f）在13个月采样期间细菌门的相对丰度，每个条形代表每个时间点的三个样本的平均值。通过Wilcoxon秩和检验识别差异丰富的细菌属（g）。

在CWCE（图2d）中，Proteobacteria是主要的门之一，其相对丰度显示出显著的时间动态变化，从2018年7月的21.584%变化到2018年10月的44.692%。例如，在采样的第一个月，其相对丰度为30.558%。Bacteroidetes也显示出时间变化，2018年4月的相对丰度较低，为20.339%，到2018年12月增加到28.736%。Chloroflexi显示出显著的变异性，2019年3月达到峰值43.600%，2018年10月降至最低水平（20.658%）。此外，Firmicutes在2018年9月的相对丰度较高（22.210%），而在大多数其他月份相对较低。在CRCE（图2e）中，Proteobacteria仍然是主要的门之一，其相对丰度在23.775%到35.355%之间波动。例如，2018年5月的丰度达到35.355%。Bacteroidetes的丰度在2018年8月为8.77%，2019年2月达到最高值（25.735%）。Chloroflexi的丰度也在月份间变化，从2018年3月的5.097%变化到2018年7月的14.743%。与CWCE样本相比，CRCE样本在门级丰度动态上显示出不同的模式。RME样本显示出独特的微生物群落组成（图2f）。Proteobacteria在大多数月份占主导地位，相对丰度在2018年4月为18.452%到2018年5月为52.617%，例如2018年5月为46.908%。值得注意的是，Firmicutes在RME样本中的丰度显著较高，2018年7月达到27.312%，2018年12月达到峰值45.912%，这与CWCE和CRCE样本形成鲜明对比。2019年3月，拟杆菌门（Bacteroidetes）的丰度最高（33.82%）。在CWCE、CRCE和RME中的土壤微生物群落表现出显著的时间变化以及不同生境间的分类组成差异。这些变化可能反映了不同的环境条件，如氧化还原电位（redox potential）和pH值，这些因素影响了这些生态系统中的微生物群落结构和功能。

3.3 对不同共培养实践有响应的关键微生物类群
通过使用Wilcoxon秩和检验并校正假发现率（FDR）来识别差异性丰富的细菌属。当log2倍数变化大于1且FDR调整后的P值小于0.05时，这些类群被认为是显著富集的。结果显示，在这三个系统中，各种类群的相对丰度存在明显差异（见图2g）。对于Geobacter来说，其在CWCE、CRCE和RME中的相对丰度分别为1.70%、2.73%和0.40%。它在CRCE中的较高丰度表明，CRCE的环境生态位可能比CWCE和RME更有利于其增殖。Dechloromonas也显示出特定的生境丰度模式，在CRCE中的丰度（1.05%）高于CWCE（0.74%）和RME（0.32%）。这表明CRCE可能为Dechloromonas提供了更适宜的生态位。Sulfuricurvum在CRCE中的丰度显著较高（0.847%），而在CWCE和RME中的丰度较低（0.18%和0.03%）。这表明CRCE中的环境因素，如营养物质的可获得性和氧化还原电位（ORP），可能促进了其生长。其他类群，包括Syntrophus、Smithella、Anaerolinea、Anaeromyxobacter、Thiobacillus、Haliangium、Thioalkalispira、Methanobacterium、Nitrospira、Desulfobulbus、Bryobacter、Propionivibrio、Candidatus Nitrotoga和Sideroxydans，在不同生境间的丰度也存在显著差异。总体而言，这些类群在CRCE和CWCE中的丰度高于RME，这可能是由于土壤环境条件和微生物相互作用网络的差异。相比之下，一些类群在RME中独特富集。例如，Pseudomonas在RME中的丰度极高（4.46%），而在CWCE中仅为1.03%，在CRCE中为0.36%。同样，Stenotrophomonas、Flavobacterium、Polynucleobacter、Bacillus、Acinetobacter、Massilia、Chryseobacterium、Exiguobacterium和Planomicrobium在RME中也显著富集（见图2g）。这些发现表明，RME拥有独特的微生物群落结构，这可能是由独特的环境筛选机制驱动的。

3.4 共培养增强了微生物共现网络的复杂性和稳定性
三个系统中的细菌共现网络表现出不同的结构特征。CRCE（图3a）具有最高的复杂性，包含1,625个节点和7,986条边，以正向相互作用为主（98.6%）。CWCE（图3b）的网络较为简单（694个节点，3,590条边），负向相互作用的比例较高（16.1%）。相比之下，RME（图3c）具有最高的连通性（1,428个节点，20,684条边），其中97.8%为正向相互作用，表明其微生物群落高度互联。Proteobacteria是所有网络中最丰富的门类，在CRCE和RME中形成了中心枢纽。CWCE表现出更大的分类多样性，拟杆菌门（Bacteroidetes）发挥了更重要的作用。RME还表现出来自酸杆菌门（Acidobacteria）和浮霉菌门（Planctomycetes）的显著贡献，表明其微生物联盟更为广泛。CRCE和RME的特点是强烈的正向共现关系，暗示了互利或生态位共享的关系。然而，CWCE中的相互作用更多是竞争性的，这可能是由于资源限制。RME中的密集连通性表明了功能冗余，而CWCE中较为稀疏的网络可能表明其群落结构更为专门化。

图3
CRCE（a）、CWCE（b）和RME（c）中土壤细菌群的种间相互作用网络。每个节点代表一个细菌属，节点颜色对应不同的主要门类。边表示相互作用：红色表示正向，绿色表示负向。CRCE（d）、CWCE（e）和RME（f）中土壤细菌群落结构与环境因素之间的RDA（Relational Distance Analysis）。CRCE（g）、CWCE（h）和RME（i）中环境因素与细菌群落之间的Spearman相关性热图。CRCE（j）、CWCE（k）和RME（l）中不同生态过程对微生物群落组装的相对贡献。

3.5 将环境驱动因素与微生物特征联系起来
在CRCE土壤中（表1），Shannon指数与pH值（R = 0.28，P = 0.011）和氧化还原电位（ORP）（R = 0.36，P = 0.001）以及NO??-N（R = 0.562，P < 0.001）、NO??-N（R = 0.347，P = 0.002）和总有机碳（TOC）（R = 0.452，P < 0.001）显示出显著的正相关。Chao1指数也显示出类似的趋势，pH值（R = 0.250，P = 0.027）、ORP（R = 0.373，P = 0.001）、NO??-N（R = 0.446，P < 0.001）、NO??-N（R = 0.303，P = 0.007）和TOC（R = 0.442，P < 0.001）也呈现正相关。在CWCE土壤中，未观察到微生物多样性指数（Shannon和Chao1）与任何环境因素之间的显著相关性。在RME土壤中，Shannon指数与NH??-N（R = ?0.370，P = 0.020）呈现显著负相关，而与总氮（TN）（R = 0.599，P < 0.001）和总磷（TP）（R = 0.483，P = 0.002）呈现正相关。Chao1指数与TN（R = 0.684，P < 0.001）也呈现强正相关。表1显示了三个研究地点（CRCE、CWCE、RME）中环境变量与细菌α多样性之间的Spearman相关性分析。R值范围从?1（完全负相关）到+1（完全正相关）。星号（*）表示统计上显著的相关性（P < 0.05）。

RDA突出了主导的环境筛选因素，在CRCE中（图3d），NO??-N和NO??-N是最强的预测因子（解释了36.27%的变异），pH值和ORP表现出协同效应（RDA1 = 28.52%，RDA2 = 7.75%）。在CWCE（图3e）中，TN、TP和NH??-N是关键驱动因素（解释了20.33%的变异），pH值和ORP表现出拮抗效应（RDA1 = 15.43%，RDA2 = 4.90%）。在RME（图3f）中，pH值和TN占主导地位（29.86%的变异），TP调节了它们的相互作用（RDA1 = 27.62%，RDA2 = 2.24%）。这些结果共同表明，氮物种、pH值和氧化还原条件是塑造土壤生境中微生物群落组装的主要因素。

在CRCE中，门级分析进一步揭示了特定生境的环境响应（图3g），Proteobacteria与pH值、总碳（TC）、总磷（TP）和氧化还原电位（ORP）呈负相关（P < 0.01）。拟杆菌门（Bacteroidetes）与NO??-N和NO??-N呈负相关（R = ?0.56和?0.41），但与TP呈正相关（R = 0.31）。Chloroflexi与总碳（TOC）和NO??-N呈正相关（R = 0.47和0.38）。与氮循环相关的门类（如酸杆菌门（Acidobacteria）、浮霉菌门（Planctomycetes）和Nitrospirae）与NO??-N、NO??-N和TN呈正相关（R = 0.54–0.72）。在CWCE（图3h）中，pH值是群落组成的关键驱动因素，拟杆菌门（Bacteroidetes）和放线菌门（Actinobacteria）呈正相关（R = 0.64和0.55），而Proteobacteria呈负相关（R = ?0.54）。Chloroflexi和Gematimonadetes与TN和TP呈正相关（R = 0.45，0.60）。相反，厚壁菌门（Firmicutes）与TN和TP呈负相关（R = ?0.36）。值得注意的是，Nitrospirae与总碳（TOC）呈负相关（R = ?0.36），但与TN呈正相关（R = 0.50）。RME（图3i）与CWCE有一些共同的模式，例如拟杆菌门（Bacteroidetes）和放线菌门（Actinobacteria）与pH值保持强正相关（R = 0.64和0.55），Proteobacteria仍呈负相关（R = ?0.54），但也表现出独特特征，如Verrucomicrobia与ORP呈正相关（R = 0.41），浮霉菌门（Planctomycetes）与总氮（NH??-N）呈负相关（R = ?0.32）。

在CRCE微生物群落中，漂变（40–60%）和同质选择（30–50%）是主要的组装过程，而扩散限制（10–20%）和同质化扩散（5–15%）的作用较小。异质选择的影响可以忽略不计（< 5%）。例如，在2018年3月，漂变占群落变异的55%，同质选择占35%，与扩散相关的过程占≤10%（图3j）。CWCE群落在组装过程中的时间变异性更大。漂变（30–70%）和同质选择（20–50%）仍然占主导地位，但会随季节波动。RME中的扩散限制（10–30%）和同质化扩散（5–25%）的贡献更大，而异质选择偶尔达到10%。例如，在2018年8月，漂变（40%）、同质选择（30%）和扩散限制（20%）是关键驱动因素（图3k）。RME群落主要由漂变（70–90%）构成，同质选择的贡献最小（10–20%）。与扩散相关的过程（< 10%）和异质选择（< 5%）的影响可以忽略不计。例如，在2018年12月，漂变解释了80%的变异，而同质选择仅占15%（图3l）。

3.6 共培养驱动了土壤生物地球化学循环的功能基因谱型
对CRCE和RME的土壤样本进行了宏基因组测序，随后基于KEGG和MGHs数据库进行了功能基因注释。结果表明，在α多样性方面，两组之间的Shannon指数没有显著差异（图4a，P = 0.153），而Chao 1指数（图4b）在CRCE土壤中显著低于RME土壤（P = 0.020），表明两种系统的功能基因均匀性相似，但丰富度不同。基于Bray–Curtis距离的PCoA进行的β多样性分析显示CRCE和RME样本之间存在显著分离（Adonis检验：R = 0.168，P = 0.001），前两个主坐标分别解释了40.73%和21.18%的总变异（图4c）。基于MGHs分类的群落组成分析表明，CRCE和RME的整体功能基因谱型相似（图4d）。

图4
CRCE和RME之间宏基因组功能基因多样性和组成的比较。α多样性指数：Shannon指数（a）和Chao1指数（b）。基于Bray–Curtis距离的功能基因组成的PCoA（c）。CRCE和RME之间整体功能基因组成的比较（d）以及差异性丰富的功能基因（e）。线性判别分析（LDA）效应大小（LEfSe）识别了CRCE和RME之间差异性最丰富的功能基因（f）。碳循环相关基因的倍数变化（g）。氮循环相关基因的倍数变化（h）。

使用Wilcoxon秩和检验对CRCE和RME系统中的土壤宏基因组进行了碳循环相关基因的差异分析（图4g）。结果表明，两个系统中参与关键碳代谢途径的多个基因的丰度存在显著差异。与碳固定和中心碳代谢相关的基因表现出不同的富集模式。编码参与糖异生和CO?固定的丙酮酸磷酸二激酶（pyruvate phosphate dikinase）的pps/ppsA基因簇在CRCE土壤中显著富集（P < 0.01）。同样，编码糖酵解/糖异生中磷酸甘油酸激酶（phosphoglycerate kinase）的PGK/pgk基因在CRCE中的丰度也显著较高（P < 0.001）。编码戊糖磷酸途径中转酮醇酶（transketolase）的E2.2.1.1/tktA/tktB基因簇在CRCE中也显著更丰富（P < 0.001）。相比之下，参与三羧酸（TCA）循环和相关呼吸过程的基因在RME土壤中更为丰富。acnA基因（aconitase）在RME中显著更丰富（P < 0.001）。sdhA/frdA（P < 0.001）和sdhB/frdB（P < 0.001）基因，编码琥珀酸脱氢酶/延胡索酸还原酶的亚基，在RME中的表达也显著更高。por/nifJ基因簇，参与厌氧丙酮酸代谢，在RME中显著富集（P < 0.05）。korB/oorB/oforB基因簇，与厌氧氧化应激反应和碳代谢相关，在RME中也显著更丰富（P < 0.05）。值得注意的是，编码参与奇数链脂肪酸和支链氨基酸降解的甲基丙二酰辅酶A突变酶（methylmalonyl-CoA mutase）的E5.4.99.2A/mcmA1基因在RME中的差异富集最为明显（P < 0.001）。此外，编码参与脂肪酸生物合成的乙酰辅酶A羧化酶（acetyl-CoA carboxylase）的accC基因在RME中也显著富集（P < 0.01）。这些结果表明，CRCE和RME在土壤宏基因组中不同地影响了碳循环相关基因的丰度，特定基因在每种管理模式下表现出显著的差异富集。为了进一步阐明上述差异丰富碳循环基因的分类起源，我们进行了宿主追踪分析，将功能基因与微生物属联系起来。如图S1所示，在CRCE土壤中，参与还原性柠檬酸循环和还原性乙酰辅酶A途径的基因主要与Geobacter和Anaeromyxobacter相关，而在RME土壤中，这些基因主要由Pseudomonas和Bacillus携带（图S1a，b）。这些结果表明，共培养和单培养系统之间的不同碳循环潜力是由系统发育上不同的微生物联盟所支持的。

在CRCE和RME的土壤宏基因组中，对氮循环相关基因进行了差异分析（图4h）。结果表明，参与关键氮转化途径的基因在CRCE土壤中显著富集。与硝化作用和反硝化作用中间过程相关的基因在CRCE土壤中显著富集。编码参与硝化作用第二步（将羟胺转化为亚硝酸盐）的羟胺氧化还原酶（hydroxylamine oxidoreductase）的hao基因在CRCE中的丰度显著更高（P < 0.001）。编码参与反硝化作用（将NO还原为N?O）的一氧化氮还原酶（nitric oxide reductase）的norC基因在CRCE中也显著富集（P < 0.001）。此外，参与同化性硝酸盐还原的nasB基因在CRCE中的丰度也显著更高（P < 0.05）。相反，参与反硝化作用的nirK基因在RME中显著富集（P < 0.001）。参与同化性硝酸盐还原的narB基因在RME中也显著富集（P < 0.001）。ureC基因编码参与尿素水解的尿素酶的α亚基，在RME中的丰度略有升高，尽管这种差异并未达到统计学上的显著性。总之，CRCE和RME对土壤宏基因组中与氮循环相关的基因的丰度有不同影响。hao、norC和nasB在CRCE中的显著富集，以及nirK、nirA和narB在RME中的显著富集，表明这两种管理方式对关键氮转化过程（包括硝化、反硝化和同化性硝酸盐还原）的遗传潜力有不同的影响。为了评估生物地球化学循环潜力的功能整合，我们构建了碳循环和氮循环基因的共现网络。如图S2所示，与RME相比，CRCE在碳循环和氮循环方面表现出更模块化且连接更紧密的功能网络，具有更高的模块化系数和更短的平均路径长度（图S2a、b、c、d）。这种增强的网络组织表明共培养系统促进了更大的代谢耦合和功能冗余，这是功能稳定生态系统的关键特征。

3.7 环境因素与功能基因组成之间的关系
RDA进一步揭示了功能基因组成与环境因素之间的定量关系（CAP1：8.48%，CAP2：4.00%）。CRCE样本显示出分散的分布，而RME样本则表现出更大的聚集性，两组在排序空间中通常可以区分开来（图5a）。环境因素拟合结果显示，TC和TOC倾向于CAP1的正方向，与功能基因组成呈正相关；TN和ORP倾向于CAP1的负方向，呈负相关；pH倾向于CAP2的负方向。Mantel检验结果一致：在CRCE中，TC（P<0.01）和TN（P<0.01）与功能基因高度相关，而pH（P<0.05）和TOC（P<0.05）也显示出显著相关性，其中TC、TOC和TN呈正相关，pH呈负相关。在RME中，环境因素与功能基因之间的相关性通常较弱，相关模式与CRCE中的不同（图5b）。

图5
这张图片的替代文本可能是使用AI生成的。

环境因素对CRCE和RME宏基因组功能组成的驱动效应。基于功能基因组成的RDA，显示了CRCE和RME生境中样本的分布，并用向量指示了与环境因素的相关方向和强度（a）。Mantel检验显示了环境因素与主要功能基因类别之间的相关网络（b）。边的颜色表示相关方向（红色表示正相关，蓝色表示负相关）。P < 0.05, P < 0.01

4.1 共培养通过改变土壤物理化学环境来提高土壤肥力
十三个月的连续监测表明，小龙虾-植物共培养不仅改变了土壤的单一物理化学指标，而且通过两种协同途径——碳富集和氧化还原稳态——提高了土壤肥力和环境稳定性。CRCE中显著更高的TC和TOC含量，加上比RME更低的年内变异性，直接证明了共培养模式对土壤有机碳库的放大效应——这是土壤肥力的一个基本组成部分。这一发现与Guo等人（2025年）的研究结果高度一致，他们报告称，在10-15年的水稻-小龙虾共培养田中，土壤有机碳含量比单一种植增加了31.8%-37.2%，同时伴随着团聚体稳定性的提高、土壤养分水平的提升和较低的氧化还原电位（Guo等人2025年）。虽然之前的研究已经记录了水稻-小龙虾系统中的碳封存现象，但环境稳定、群落组装过程、网络拓扑和功能基因库之间的机制联系尚未得到探索。通过将长期时间序列分析、定量组装建模和功能宏基因组学整合在一个框架内，本研究首次提供了关于共培养系统如何同时实现土壤肥力提升和微生物群落稳定性的全面机制解释。观察到的碳封存现象与越来越多的证据相符，这些证据强调了该模型增加土壤有机碳储量的潜力，特别是通过形成水稳定的大团聚体，为有机碳提供物理保护（Chen等人2025年）。这种效应与Procambarus clarkii作为生态系统工程师的功能作用密切相关：它的挖掘行为改变了土壤的物理结构，其碎屑食性 feeding不断引入外源性有机物（剩余的饵料、粪便、腐烂的大型植物），其生物扰动促进了有机-矿物复合物的形成，特别是生物扰动增加了有机物与矿物表面（尤其是铁和铝氧化物）的接触，这些在亚热带稻田土壤中很丰富（Six等人2002年）。通过配体交换、多价阳离子桥接和疏水相互作用形成的这些复合物，物理上保护了有机碳免受酶的攻击和微生物的矿化（Lehmann等人2020年），从而减缓了有机碳的快速矿化（Li等人2025年）。正如之前的研究所提出的，这些生物活动是重塑支撑系统生态可持续性的生物地球化学循环的关键驱动力（Zhu等人2023年）。同时，CRCE系统在整个监测期间保持了稳定的氧化还原电位（-150至-50 mV），而RME则表现出从强氧化（>200 mV）到强还原（< -100 mV）的剧烈波动。Guo等人（2025年）也报告称，长期的水稻-小龙虾共培养显著降低了土壤的ORP。这一观察结果与我们的发现一致，共同指向共培养土壤中形成了一个缓冲良好的氧化还原微环境——这一机制可能是由氧气消耗（由有机物质矿化驱动）和微尺度氧气流入（由小龙虾挖掘活动和水稻根系气孔组织介导）之间的动态平衡所驱动的（Hu等人2016年）。这种稳定的还原环境不仅有利于土壤有机碳的保存，而且通过持续的碳输入，为耗氧代谢过程提供了连续的基质。这种缓冲良好的氧化还原微环境对微生物代谢有着深远的影响。还原性土壤和氧化性微环境的共存创造了电子受体可用性的空间梯度，使得有氧和厌氧过程能够同时发生。有氧呼吸和硝化作用可以在氧化微区（例如，洞壁、根表面）进行，而反硝化、铁还原和甲烷生成等厌氧过程则发生在缺氧基质中（McAllister等人2021年）。这种空间耦合促进了代谢的互补性，并减少了电子受体的竞争，这从CRCE土壤中有氧硝化菌（Nitrospira）和厌氧铁还原菌（Geobacter）的共富集中得到了证明。这些相互关联的过程共同维持了土壤肥力和氧化还原稳态，调节了随后的微生物群落组装和动态。因此，我们的发现表明，共培养通过碳封存和氧化还原稳态的整合调节来提高土壤肥力，而不是通过单一途径。

4.2 共培养驱动土壤微生物群落结构和关键类群的功能分化
土壤物理化学环境的重塑不可避免地导致微生物群落的响应，直接影响群落组成的稳定性。16S rRNA基因扩增子测序显示三个系统之间的组成存在显著差异。RME中Firmicutes的丰度异常升高（峰值丰度为45.9%），这是一个包含许多快速生长的兼性厌氧菌的门，这些厌氧菌通常与脉冲输入的易分解有机物（例如，秸秆回用）和剧烈的氧化还原波动有关（Hartmann等人2015年）。相比之下，共培养系统（CRCE和CWCE）中Firmicutes的丰度显著降低，而Proteobacteria、Bacteroidetes和Chloroflexi构成了稳定的核心微生物类群。Wang等人（2023年）也在水稻-小龙虾共培养系统的土壤中识别出这些门（Wang等人2023年）。这种群落结构的变化直接对应于共培养土壤中持续低且稳定的ORP和总碳含量的增加，表明环境稳定转化为微生物群落的稳定。更值得注意的是，共培养系统特别富集了一组对土壤肥力具有关键生态功能的关键类群。Geobacter、Dechloromonas和Sulfuricurvum在CRCE中的相对丰度显著高于RME。Geobacter是著名的铁还原菌，它们将有机物的厌氧氧化与铁氧化物的还原联系起来，并介导细胞外电子转移（Lovley等人2004年）；Dechloromonas具有异化铁还原、反硝化和芳香烃降解的能力（Achenbach等人2001年；Duffner等人2021年）；Sulfuricurvum是偏好微氧环境的硫氧化自养菌（Cron等人2019年）。这些类群在CRCE中的协同富集表明，在共培养土壤中形成了一个“铁-氮-硫”耦合的代谢网络——该网络能够高效地矿化有机物，同时缓冲氧化还原波动，代表了微生物水平上的功能稳定性。这一观察结果为这些集成系统中提出的微生物驱动的生物地球化学循环提供了实证支持（Zhu等人2023年）。相反，在RME中显著富集的类群，如Pseudomonas、Stenotrophomonas和Flavobacterium，主要是机会主义r-策略者，在干扰后迅速增殖；它们的优势证实了单一种植系统的不稳定性和其有限的持续肥力调节能力。

4.3 共培养增强了微生物相互作用网络的复杂性
群落组成的差异仅是微生物响应的表面表现；更深层次的变化在于支撑群落功能稳定性的种间相互作用的重组。共现网络分析显示，CRCE构建了一个高度复杂的相互作用网络（1,625个节点，7,986条边），其中正面相互作用的比例非常高（98.6%）。高比例的正面关联通常表明广泛的生态位共享、交叉喂养（共生）或共同代谢（Faust和Raes 2012年），表明CRCE中的微生物类群形成了高度合作的代谢联盟，提高了系统层面的功能效率。这一发现与关于长期集成多培养系统（例如，水稻-小龙虾-龟）的研究结果一致，这些研究表明，这样的实践可以塑造更复杂和稳定的微生物群落网络结构，最终通过土壤-微生物相互作用提高土壤健康和作物生产力（Li等人2022年）。Zhang等人（2024年）同样发现，水稻-小龙虾养殖模式显著增加了表层土壤和底土的网络复杂性，从而提高了网络稳定性（Zhang等人2024年）。尽管CWCE网络规模较小（694个节点），但它表现出显著更高的负面相互作用比例（16.1%），这可能促进了功能分化并在资源有限的环境中维持了群落多样性。出乎意料的是，RME网络拥有最多的边（20,684条）和几乎完全正面的关联（97.8%），从拓扑角度来看显得高度合作。然而，考虑到RME中机会主义类群（例如，Pseudomonas、Bacillus）的绝对优势，这种密集的正面关联更可能反映了功能冗余而不是真正的合作——即许多物种占据相似的生态位，使得系统对外部干扰的缓冲能力本质上较为脆弱（Loreau等人2001年）。Liu等人（2024年）在他们的水稻-鱼类共培养系统研究中也注意到，虽然传统的水稻-鱼类共培养增加了微生物相互作用的强度，但其对网络稳定性的影响仍然复杂（Liu等人2024年）。我们的发现表明，网络复杂性本身并不是一个可靠的稳定性指标；相反，一个包含功能分化关键类群的适度复杂网络结构（如CRCE所示）代表了维持群落组成和功能稳定性的更稳健架构——这是持续土壤肥力的关键要求。CRCE在调节土壤肥力和群落稳定性方面的优越表现可能归因于植物类型的差异。水稻作为一种C3植物，产生的根分泌物富含有机酸和糖类，可能更有效地促进特定功能类群（如Geobacter）的生长。相比之下，水生植物（Elodea nuttallii）作为一种淹没的大型植物，可能有不同的碳输入模式和根际效应（Pang和Xu 2024年）。此外，水稻根系发达的气孔组织提供了更有效的微尺度氧化，可能增强了“宏观还原、微观氧化”的空间模式，有利于功能耦合关键类群的富集。这些植物特定的差异突显了在优化共培养系统设计中选择植物的重要性。

4.4 环境过滤和生态过程共同塑造了共培养系统中的微生物群落组装
微生物群落的组装不是一个随机事件；不同生境中确定性和随机过程的相对贡献决定了群落结构的稳定性和功能轨迹。基于iCAMP的零模型分析显示，漂变和同质选择是塑造CRCE群落组装的主要力量（分别占40%-60%和30%-50%）。高比例的同质选择表明共培养土壤内部存在强烈且一致的环境筛选压力。相比之下，RME中漂变的贡献高达70%-90%，而同质选择仅占10%-20%，表明单一种植土壤缺乏一致的环境过滤，群落演替主要由随机出生/死亡/迁移事件驱动（Zhou和Ning 2017年）。这种“环境选择减弱—随机优势”的组装模式与RME中观察到的剧烈氧化还原潜力（ORP）波动、碳库不稳定以及机会性微生物的频繁爆发相互强化，解释了该系统无法维持稳定的群落组成和调节肥力的能力。环境因素-微生物关联分析进一步阐明了每个生境中群落组织的关键驱动因素。在CRCE中，NO??-N和NO??-N共同解释了36.3%的群落变化，并与多样性及关键硝化微生物（如Nitrospira、Planctomycetes）显示出显著的正相关性，表明在稳定的氧化还原环境中活跃的硝化作用是与氮肥力相关的群落结构的关键组织者。在CWCE中，TN、TP和NH??-N是主要驱动因素（20.3%），反映了大型植物系统中更强的养分保留压力。在RME中，pH值和TN共同占主导地位（29.9%），证实pH值波动和氮脉冲带来了强烈但不一致的干扰。这些结果清楚地表明，共培养系统通过稳定关键环境梯度，将群落组装从“随机漂变优势”转变为“确定性同质选择优势”——这是维持微生物群落组成及其调节肥力功能的核心生态机制。这种确定性主导的组装模式意味着系统功能的可预测性更高，为微生物群落的靶向调控提供了理论基础。通过维持稳定的氧化还原条件和一致的碳输入，农民可以“自上而下”地控制微生物群落，引导它们朝向期望的功能状态——例如，增强硝化能力以提高氮利用效率，或促进铁还原细菌以稳定有机碳。

我们的宏基因组分析显示，从RME到CRCE的转变显著重构了土壤微生物群落的功能基因组成，这一点通过beta多样性分析中的显著差异得到了证实（Adonis R2 = 0.168，P = 0.001）。尽管两种系统之间的功能基因均匀性（Shannon指数）相似，但这种功能分化仍然发生，表明引入小龙虾会选择性地富集或抑制特定的微生物功能，而不是广泛改变群落的功能多样性。CRCE土壤中显著较低的Chao1指数（P = 0.020）表明功能基因丰富度降低，这可能反映了小龙虾生物扰动所创造的独特物理化学环境所带来的选择压力。Hou等人也报告称，综合水稻-小龙虾养殖显著影响了土壤细菌群落，总氮和总磷成为导致群落变化的主要因素（Hou等人2024年）。这些发现与先前的观察结果一致，即在共培养条件下会出现特定水产养殖模式的生物地球化学循环模式。CRCE土壤中pps/ppsA、PGK/pgk和E2.2.1.1/tktA/tktB的显著富集表明，在共培养条件下碳固定和中心碳代谢的遗传潜力得到增强。pps/ppsA基因簇参与糖异生和厌氧CO?固定，表明CRCE微生物组可能具有将无机碳转化为有机形式的更强能力。这一观察结果与CRCE土壤中记录的较高总有机碳含量一致，并且与水稻-小龙虾系统通过持续的外源有机输入和在稳定团聚体中的物理保护来增强土壤有机碳储量的证据相符。PGK/pgk（糖酵解/糖异生）和tktA/tktB（戊糖磷酸途径）的同步富集表明，中心碳代谢具有灵活性，能够应对小龙虾生物扰动带来的变化碳底物和氧化还原条件。相比之下，RME土壤中与完全有机质氧化和呼吸能量保存相关的基因显著富集。acnA（aconitase）、sdhA/frdA和sdhB/frdB（琥珀酸脱氢酶/延胡索酸还原酶）的显著富集表明，在单一种植土壤中TCA循环活性增强，表明更依赖于有机底物的完全矿化。RME中E5.4.99.2A/mcmA1（甲基丙二酰辅酶A突变酶）的异常高富集是最显著的差异表达，表明单一种植微生物组可能更依赖脂质来源的碳，这可能反映了每年秸秆投入的累积效应。RME中accC（乙酰辅酶A羧化酶）的富集进一步支持了脂肪酸生物合成的增强能力。RME中厌氧代谢基因por/nifJ和korB/oorB/oforB的富集表明，尽管氧化还原条件波动，单一种植土壤仍保持厌氧碳转化的遗传潜力（Chen等人2025年）。总体而言，这些模式表明，引入小龙虾将微生物碳处理方式从完全有氧氧化转变为更灵活的代谢策略，增强了碳固定潜力——这种功能重组与共培养系统中观察到的土壤有机碳储量的增加相一致。

CRCE和RME之间氮循环基因的差异富集为氮转化潜力的路径特异性重构提供了证据。CRCE中hao（羟胺氧化还原酶）的显著富集表明，在共培养条件下硝化潜力增强，这可能反映了小龙虾挖掘活动和水稻根系通气组织创造了有氧微环境（Hu等人2016年）。这与环境因素分析结果一致，该分析将NO??-N和NO??-N确定为CRCE群落变化的关键驱动因素。CRCE中norC（一氧化氮还原酶）的显著富集表明了增强反硝化中间过程的潜力。最值得注意的是，nasB（同化硝酸盐还原酶）的富集表明了将硝酸盐同化为有机氮的能力增强。这一基因水平的证据直接支持了共培养系统通过微生物生物量整合促进氮保留而非反硝化损失的观点（Chang等人2025年）。nasB的富集，加上没有显著富集的异化硝酸盐还原基因，表明CRCE微生物组倾向于将无机氮导向有机氮池——这种机制有助于维持氮肥力同时最小化污染风险。这一发现提供了直接的证据，支持共培养系统在氮同化和污染物去除方面的优势（Zhu等人2023年）。相比之下，RME土壤中反硝化和异化硝酸盐还原基因显著富集。nirK（亚硝酸盐还原酶）、narB（硝酸盐还原酶）和nirA（同化亚硝酸盐还原酶）的富集表明，在响应施肥带来的脉冲氮输入时，反硝化和异化途径的潜力增强。总体而言，我们的结果验证了提出的层次因果路径：生物扰动引起的环境稳定驱动了确定性的群落组装，促进了关键微生物的富集和功能整合，最终调节了土壤肥力并维持了群落稳定性。

这项为期13个月的野外研究表明，小龙虾-水稻共培养从根本上将土壤微生物组重塑为更加稳定、功能更整合的状态，从而在维持微生物群落组成和功能稳定性的同时调节了土壤肥力。通过整合时间序列分析、网络生态学、定量群落组装建模和功能宏基因组学，我们建立了一个层次因果路径：小龙虾生物扰动和植物存在通过碳封存和氧化还原稳态协同稳定了物理化学环境，进而施加了强烈的确定性选择压力（同质选择的优势）。这种选择富集了功能耦合的关键微生物（如Geobacter、Sulfuricurvum、Nitrospira），并促进了以正向互动为特征的合作生态网络。最终，这表现为一个丰富且整合的功能基因库，支持碳、氮、磷和硫的生物地球化学循环，直接增强了土壤肥力。相比之下，水稻单一种植土壤受随机漂变支配，以机会性微生物为主，仅表现出功能冗余而非真正的功能稳定性。我们的发现提供了一个机制框架，解释了人为设计的共培养系统如何实现土壤微生物组的稳定性和目标性肥力调节，将可持续农业的理解从宏观观察推进到微生物机制层面。此外，这项工作提供了可操作的见解，例如，通过调节有机改良剂中的碳氮比或优化淹水深度来维持稳定的氧化还原条件，可以加强确定性选择并定向富集功能微生物，为优化综合农业系统的土壤健康提供了实用策略，突显了利用微生物过程优化生态集约化的价值。