ZmWRKY74通过调节抗氧化酶活性和脯氨酸积累参与玉米的干旱胁迫响应

《Plant Science》：ZmWRKY74 participates in maize drought stress response through regulating antioxidant enzyme activity and proline accumulation

　　马中贤|张学仕|赵东旭|严海东|朱学如|方秀|马青|蔡荣豪
中国安徽农业大学生命科学学院作物抗逆育种国家工程实验室，合肥230036

**摘要**
玉米（Zea mays L.）是一种极其重要的粮食作物和工业原料。然而，近年来干旱事件的频繁发生对其生产构成了严重威胁。揭示玉米干旱胁迫响应的分子机制对于提高产量至关重要。在本研究中，筛选并鉴定了一种耐旱突变体，并对关键突变基因ZmWRKY74进行了功能分析。结果表明，ZmWRKY74的过表达显著降低了玉米的耐旱性。过表达系表现出抗氧化酶活性和脯氨酸含量的下降，以及对干旱诱导的氧化损伤的敏感性增加。进一步的研究发现，ZmWRKY74与ZmNAC49相互作用。这种相互作用不仅抑制了ZmSOD3的表达，还增强了ZmWRKY74与ZmAAP3启动子的结合亲和力，从而加强了ZmAAP3的转录抑制。这些发现表明，ZmWRKY74通过调节抗氧化酶活性和脯氨酸积累在干旱胁迫响应中起着关键作用。本研究揭示了ZmWRKY74在干旱条件下的新调控机制，为通过遗传工程方法提高作物耐旱性提供了理论基础和潜在的分子靶点。

**引言**
玉米（Zea mays L.）是全球最重要的粮食作物之一，不仅是人类饮食的核心组成部分，也是畜牧业和生物能源行业的重要原料。然而，由于其高水分需求，玉米特别容易受到干旱胁迫的影响，导致严重的产量损失，危及粮食安全（Lamlom等人，2024年）。此外，全球气候变化显著加剧了干旱事件的频率、强度和持续时间。在过去三十年中，全球超过四分之三的土地表面变得越来越干旱（Wang，2025年）。在干旱条件下，植物的呼吸速率显著增加，导致碳源消耗加快和活性氧（ROS）的产生增加，进而对蛋白质、DNA和脂质造成氧化损伤（Baxter等人，2014年）。为了应对干旱胁迫，植物进化出了多种防御策略，包括维持ROS平衡和渗透调节。
抗氧化酶系统是植物抵御氧化损伤的第一道防线，主要由超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）和过氧化氢酶等关键酶组成。通过协同作用，这些酶将高反应性的氧自由基转化为毒性较低或无害的物质，从而有效减轻细胞的氧化损伤（Jomova等人，2024年）。渗透调节系统通过积累渗透调节物质来维持细胞膨压，氨基酸转运是这一过程的关键组成部分。氨基酸转运蛋白（AAPs）是植物中负责氨基酸跨膜转运的核心蛋白家族，在干旱和盐胁迫条件下介导渗透调节物质的积累（Tarczynski等人，1993年）。例如，TaAAP3、TaATLa2和TaATLb13在干旱和高温胁迫下表现出持续的反应，这对于在长期干旱和热胁迫期间维持小麦的正常氨基酸转运至关重要（Tian等人，2020年）。在拟南芥中的功能验证表明，AtAAP1的过表达可提高植物的脯氨酸积累水平，从而显著提高其耐逆性（Wang等人，2017年）。在水稻中，OsAAP6和OsAAP11在盐胁迫和干旱胁迫下的表达显著上调，通过转运相关化合物来调节植物的耐逆性（Zhao等人，2012年）。这些复杂的生理响应过程涉及复杂的信号调控网络，包括胁迫信号感知、信号转导级联和基因表达调控。在这些复杂的调控网络中，作为基因表达开关的转录因子（TFs）在整合环境胁迫信号和协调下游胁迫响应基因的表达中起着核心作用（Wang等人，2025年；Xiong等人，2025年；Yang等人，2025年；Yu等人，2025年）。
在众多TFs中，WRKY TF家族是最大的家族之一，其特征是在N端具有一个或两个WRKY结构域（保守的WRKYGQK基序），在C端具有锌指样基序。值得注意的是，WRKY TFs特异性结合到其目标基因启动子区域内的W-box顺式作用元件（Jiang等人，2017年）。越来越多的证据表明，WRKY TFs在植物对干旱胁迫的响应中起着关键作用。例如，在小麦中，TaWRKY31和TaWRKY1-2D通过调节抗氧化酶活性来增强耐旱性，从而促进ROS的清除（Ge等人，2024年；Yu等人，2023年）。在水稻中，OsWRKY55和OsWRKY97通过上调抗氧化酶活性和促进脯氨酸积累显著提高了植物的耐旱性（Lv等人，2023年；Zheng等人，2023年）。此外，ZmWRKY30和ZmWRKY71通过维持细胞氧化还原平衡和调节胁迫响应基因的表达来正向调节玉米的耐旱性（Gu等人，2024年；Ma等人，2025年）。
与WRKY TFs类似，NAC TFs也是植物特有的一类家族，在干旱胁迫响应中也起着关键作用。例如，在干旱条件下，沉默小麦幼苗中的TaNAC5D-2会导致多个A组PP2C基因的上调，从而负向调节ABA诱导的气孔关闭，导致水分流失增加。在拟南芥中，TaNAC5D-2的过表达显著增强了耐旱性（Ma等人，2022年）。在水稻中，OsNAC25通过上调胁迫响应基因的表达来提高耐旱性（Yang等人，2025年）。OsNAC29a被证明可以直接结合到OsPOD1的启动子并激活其表达，从而增加抗氧化酶活性，减轻干旱胁迫引起的氧化损伤（Lu等人，2025年）。在玉米中，ZmNAC55被鉴定为干旱胁迫下ROS产生的关键调节因子。ZmNAC55通过直接结合到ZmHOP3的启动子区域并激活其表达来负向调节干旱胁迫响应（Fan等人，2024年）。Xiang等人的研究表明，ZmNAC49（Zm00001d034601）特异性结合到ZmSOD3的启动子并上调其表达，显著提高SOD活性，从而提高玉米的抗氧化能力。通过构建ZmNAC49和ZmSOD3的过表达和RNAi系，他们提供了直接的遗传证据，揭示了ZmNAC49–ZmSOD3模块在通过调节抗氧化酶活性来减轻氧化损伤中的关键作用（Xiang等人，2021年）。
WRKY和NAC TFs不仅通过独立机制发挥作用，WRKY TFs还可以直接与NAC TFs相互作用，共同调节目标基因。先前的研究表明，在苹果中，MdNAC7与MdWRKY31形成蛋白质复合物，这种相互作用减轻了MdWRKY31对MdXTH2的转录抑制，从而参与乙烯介导的果实软化调节（Wang等人，2024年）。在桃子中，PpWRKY14可以直接结合到PpACS1和PpACO1的启动子，诱导其表达。当PpWRKY14与PpNAC1形成二聚体时，这种诱导作用显著增强，最终通过调节乙烯的产生来调节果实成熟（Liu等人，2024年）。尽管已有报道WRKY和NAC TFs在发育调控中的相互作用，但关于它们在非生物胁迫响应中的相互作用的研究仍然有限。
在本研究中，从EMS诱变后的B73玉米自交系群体中分离出一种耐旱突变体，并成功鉴定出候选基因ZmWRKY74（Zm00001d039032）。ZmWRKY74过表达系在干旱胁迫下表现出严重的氧化损伤，表明其在干旱胁迫响应调节中的作用。进一步的酵母文库筛选鉴定出ZmNAC49是ZmWRKY74的关键相互作用伙伴，它们的相互作用通过双分子荧光互补（BiFC）、pull-down、共免疫沉淀（Co-IP）和split-LUC互补成像实验在体内和体外得到证实。双荧光素酶和电泳迁移率实验（EMSA）证实，ZmWRKY74不仅直接结合到ZmSOD3的启动子并抑制其表达，还降低了ZmNAC49与ZmSOD3启动子的结合亲和力，从而间接调节ZmSOD3的表达水平。转录组和生理分析表明，ZmAAP3可能是ZmWRKY74的下游靶标。随后的EMSA和双荧光素酶实验证实，ZmWRKY74通过启动子结合直接抑制ZmAAP3的表达。值得注意的是，ZmNAC49增强了这种结合活性，这与观察到的脯氨酸含量减少相关。本研究不仅加深了我们对ZmWRKY74-ZmNAC49在调节抗氧化酶活性和脯氨酸积累中的相互作用的理解，还为玉米耐旱性的分子调控网络提供了新的见解，为提高作物抗逆性提供了重要的理论基础和遗传资源。

**部分摘录**
**突变体的分离、植物生长条件和处理**
共100个通过EMS诱变产生的玉米突变体接受了20%（w/v）PEG6000的干旱胁迫模拟。从筛选中分离出一种耐旱突变体，命名为dst28。为了验证其耐旱表型的遗传稳定性，对dst28纯合植物进行了多代自交。选择20株表现出稳定耐旱性的幼苗进行遗传分析和基因克隆（Zou等人，2016年）。

**基于耐旱玉米突变体的分离和特征描述**
分离出一种耐旱性显著提高的突变体（与B73相比，萎蔫延迟），并将其命名为dst28（图1A）。在非胁迫和干旱胁迫条件下测量了生理指标。在非胁迫条件下，B73和dst28在MDA含量、REL、RWC或存活率方面没有显著差异。经过24小时的干旱胁迫处理后，所有品系的MDA含量显著增加。然而，