桉树（Eucalyptus globulus）和香茅（Cymbopogon flexuosus）的精油对鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella enterica serovar typhimurium）的抗菌及防腐作用及其潜在的细胞毒性：一项在接种了沙门氏菌的猪里脊肉中的体外和体内研究

《Brazilian Journal of Microbiology》：Eucalyptus globulus and Cymbopogon flexuosus essential oils antimicrobial and conservative effects against Salmonella enterica serovar typhimurium and possible cytotoxicity: an in vitro and in situ investigation in inoculated pork sirloin

　　摘要
食源性疾病，尤其是由沙门氏菌（Salmonella spp.）引起的疾病，是全球主要的健康问题，其中鼠伤寒沙门氏菌（S. typhimurium）是导致疫情爆发的重要因素。鼠伤寒沙门氏菌在食品生产环境中的持续存在及其对传统消毒剂的抗性突显了寻找替代抗菌解决方案的必要性。来自蓝桉（Eucalyptus globulus，简称EGEO）和柔叶香茅（Cymbopogon flexuosus，简称CFEO）的精油显示出对鼠伤寒沙门氏菌的抗菌潜力，但它们的作用机制及其对真核细胞的细胞毒性效应需要进一步研究，以评估其在食品应用中的安全性，特别是在实际使用环境（in situ）中的安全性。我们通过溶血（HA）、MTT实验和NR吸收实验评估了这些精油在红细胞和斑马鱼肝脏（ZF-L）细胞中的细胞毒性。此外，我们还通过MIC/MBC测试、时间杀灭实验以及一种新设计的TSI适应性测试，研究了EGEO和CFEO对鼠伤寒沙门氏菌ATCC 14,028的抗菌效果，以评估这些精油对细菌代谢的影响。我们还进行了一项原位实验，评估EGEO和CFEO在冷藏条件下对含有感染剂量鼠伤寒沙门氏菌的猪里脊肉的防腐效果，处理时间为7天。我们监测了样品中沙门氏菌的存在情况以及pH值、钙（Ca2?）和镁（Mg2?）的浓度。结果表明，当CFEO浓度超过0.73 mg/mL时具有溶血作用，EGEO浓度超过0.45 mg/mL时也具有溶血作用。MTT实验显示，CFEO在浓度为2.941 mg/mL时不会损害线粒体功能，EGEO在浓度为14.36 mg/mL时也不会损害线粒体功能。NR吸收实验表明，这两种精油都不会影响ZF-L细胞中的溶酶体功能。CFEO和EGEO的MIC（最低抑菌浓度）和MBC（最低杀菌浓度）分别为0.37 mg/mL和1.79 mg/mL。时间杀灭实验显示，CFEO在4倍和2倍MIC浓度下6小时内具有杀菌效果，而EGEO仅在4倍MIC浓度下具有杀菌效果。EO-TSI琼脂实验表明，EGEO抑制了糖的发酵和硫的代谢，而CFEO影响了肽的氧化和蛋白质的代谢。原位分析显示，CFEO对猪肉样品的颜色和气味变化比EGEO更显著，但两种精油都使pH值保持在约6。微生物数据确认，除了CFEO处理组中的两个样品外，所有样品中均不存在沙门氏菌。没有一个样品显示出自溶或腐败的迹象，这表明根据具体应用需求，CFEO和EGEO都是可行的食品防腐剂选择。

引言
食源性疾病仍然是全球主要的公共卫生问题，细菌性病原体是导致食品污染和疫情爆发的主要原因之一[1]。其中，沙门氏菌因其广泛存在、在多种环境中的高耐受性以及能够引起人类和动物的严重感染而尤为重要[1,2,3]。沙门氏菌病是一种常见的动物源性食源性疾病，每年全球有数百万病例并导致大量死亡[4, 5]。它是许多地区最常见的细菌性食源性疾病，由于医疗费用、工作缺勤和医院资源消耗而造成重大经济负担[1, 5]。沙门氏菌感染在全球范围内发生，通常表现为自限性胃肠炎，症状包括腹泻、发热和脱水[2, 3, 9]。健康成年人的感染剂量范围为103至10? CFU/g，但在老年人和癌症患者等易感人群中，感染可能导致败血症或全身性疾病[4, 7]。疾病的严重程度受菌株毒力和宿主免疫状态的影响[6, 9]。尽管大多数病例无需抗生素治疗即可痊愈，但抗菌素耐药性的增加使临床管理变得更加复杂[2, 10, 11]。在巴西，每年报告数千例与沙门氏菌相关的胃肠炎病例；然而，由于监测系统往往只捕捉到严重的疫情，因此报告不足仍然是一个问题[8]。传播主要通过受污染的食物（尤其是动物源性产品，如禽肉和猪肉）的粪-口途径发生[3, 4, 7, 12, 13]。沙门氏菌可以在生肉、灌溉水、农产品和食品加工表面上存活，从而在整个生产链中造成交叉污染[3, 4, 7]。在流行的血清型中，鼠伤寒沙门氏菌亚种（S. typhimurium）是食源性疾病中最常分离出的血清型之一，与人类的胃肠炎和全身性感染有关[6, 14]。该血清型主要与猪肉和禽肉生产系统相关，其中单相变体在猪和猪肉产品中尤为普遍，这突显了动物宿主和加工环境在传播动态中的作用[6, 15, 16, 17]。鉴于鼠伤寒沙门氏菌在食品生产系统中的持续存在及其在食源性疾病爆发中的作用，有效的控制措施至关重要。这种细菌能够在各种条件下存活，在食品加工环境中持续存在，并抵抗传统消毒方法[18, 19, 20]。为了减少食品中的细菌污染，工业界依赖化学防腐剂和消毒剂；然而，关于这些物质的毒性和抗菌素耐药性的出现（AMR）引发了人们对替代天然抗菌化合物（如精油EO）的兴趣，这些化合物为减少微生物污染和提高食品安全提供了有希望的解决方案[21, 22]。精油是复杂的生物活性植物次级代谢物混合物，其组成因气候、植物年龄和提取方法等因素而异[23, 24]。由于其抗菌、抗氧化和防腐特性，精油受到了广泛关注，其应用范围已从传统的体外实验扩展到直接在食品基质中进行的原位研究[25, 26, 27, 28]。其中，蓝桉精油（EGEO）和柔叶香茅精油（CFEO）已被证明对包括沙门氏菌在内的食源性病原体具有抗菌活性[29, 30]；然而，它们在真实食品条件下的作用机制和代谢效应仍需进一步探索。尽管它们来源于天然，但由于其亲脂性和与生物膜相互作用的能力，精油成分可能会产生剂量依赖性的细胞毒性效应[31]。因此，使用生物学相关的细胞模型进行安全性评估是必要的。在这方面，红细胞可以作为膜破坏和潜在全身毒性的敏感指标，而肝细胞衍生的系统（如斑马鱼肝脏（ZF-L）细胞尤为重要，因为肝脏在摄入后对外来物质的代谢中起核心作用。这些互补模型共同有助于评估膜的完整性和代谢毒性，从而为潜在的食品应用提供更全面的安全性评估[31, 32]。

本研究旨在评估商业EGEO和从柔叶香茅叶片中提取的CFEO控制鼠伤寒沙门氏菌污染的有效性，评估它们在体外和原位条件下的抗菌活性和细胞毒性效应，为了解这些精油在食品相关环境中的影响提供有价值的见解。此外，还评估了EGEO和CFEO在红细胞和ZF-L细胞中的细胞毒性，以评估它们在食品应用中的潜在安全性。通过结合抗菌和代谢评估与细胞毒性评估，本研究旨在揭示精油作为天然防腐剂的应用前景及其在控制食品工业中沙门氏菌污染方面的潜在作用。

材料与方法
试剂
蓝桉精油（EGEO）来自Ferquima（巴西），通过蒸馏绿色叶子提取。其主要成分是桉叶醇、α-蒎烯和γ-萜品烯。柔叶香茅精油（CFEO）来自ViaAroma，通过蒸馏新鲜切割的草提取，主要成分包括香叶醇、香叶醇、香芹酚、d-柠檬烯和芳樟醇。这两种精油均适用于专业和工业用途。我们的研究小组在另一项研究中分析了这两种精油的化学组成（未发表数据）。
Leibovitz’s L-15、Ham’s F-12和高葡萄糖DMEM培养基来自Vitrocell Embriolife（巴西），去纤维化绵羊血液来自Laborclin（巴西）。本研究中使用的所有化学试剂均为分析级或药用级。

细胞毒性实验
**溶血实验（HA）**
该实验遵循Cerveira等人（2021）[33]的方案，使用去纤维化绵羊血液（Laborclin，巴西）。血液离心（1500 RPM，10分钟），弃去血浆，将红细胞重新悬浮在PBS（4% v/v）中。EGEO和CFEO溶解在DMSO（50% v/v）中，然后将25 μL该溶液稀释到PBS（100 μL）中，初始DMSO浓度为6.5%，随后进行系列稀释至0.001%。Triton X-100（Neon，巴西）作为阳性对照，PBS作为阴性对照。样品在37°C下孵育（30 RPM，1小时）并离心（800 × g，10分钟）。上清液转移到96孔板（KASVI，巴西）中，并在UV-Vis分光光度计（Rosys Anthos，瑞士）上于405和425 nm处读取吸光度。

**ZF-L细胞和初始处理**
细胞活力通过MTT实验进行评估，该实验通过3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯四唑溴化物还原形成甲酚蓝晶体来测量线粒体代谢活性；以及NR吸收实验，该实验通过染料在活性细胞中的结合来评估溶酶体完整性。这些实验使用来自里约热内卢细胞库（BCRJ）的斑马鱼（Danio rerio）ZF-L细胞系（代码0256）的肝细胞。细胞在含有50% Leibovitz’s L-15、35%高葡萄糖DMEM、10% Ham’s F-12和5% RPMI 1640的培养基中培养，补充NaHCO?（0.15 g/L）、HEPES（15 mmol/L）、胰岛素（0.01 mg/mL）和5%热灭活的胎牛血清（FBS）及抗生素。培养温度为28°C，不添加CO?。
孵育24小时后（28°C），以三重复的方式施加处理。EGEO和CFEO首先溶解在二甲基亚砜（DMSO）中，然后稀释到PBS中，最终浓度范围为0.5%至0.001%（共九次系列稀释），确保培养基中的DMSO浓度不超过0.5%。过氧化氢（5% v/v）作为阳性对照，PBS作为阴性对照。平板在28°C下孵育（24小时），同时轻轻搅拌（30 RPM）。

**MTT实验**
过夜孵育后，收集每个孔中的培养基以供后续分析。准备MTT溶液（1 mg/mL，Invitrogen，美国），每孔加入100 μL。平板在28°C下避光孵育4小时。然后弃去培养基，向每个孔中加入100 μL无水乙醇（Merck，德国）。再过夜孵育（27°C，轻轻搅拌）后，使用微孔读数仪（Biochrom Anthos）在570 nm处测量吸光度。这是对Mossmann（1983）[34]协议的改编版本。MTT在活细胞中通过线粒体脱氢酶的作用被还原，形成不溶的紫色甲苯胺蓝晶体。颜色的深浅表示细胞的存活情况，测试化合物的毒性越低，颜色越浅。乙醇可以溶解这些晶体，从而进行分光光度定量分析[35]。

NR吸收测定：经过过夜培养后，弃去培养基，向每个孔中加入100 μL浓度为40 μg/mL的NR（Invitrogen，美国）溶液。将平板密封并在28°C下避光培养4小时。然后弃去NR溶液，向每个孔中加入100 μL漂白溶液，该溶液由50%的纯乙醇（Merck，德国）、49%的去离子水和1%的冰醋酸（Merck，德国）组成。再次将平板培养过夜，并使用微孔板读取器（Rosys Anthos，瑞士）在570 nm波长下读取数据。该协议是根据Borenfreund和Puerner（1985）[36]的研究结果进行改编的。NR在生理pH值下是一种弱阳离子染料，可溶于水，并能通过细胞膜被动扩散。在活细胞中，由于质子梯度的存在，NR会在溶酶体内积累。而在溶酶体膜受损的细胞中，这种梯度消失，导致NR脱质子并从溶酶体中释放出来。酸化的酒精溶液可以将NR从细胞中提取出来，从而通过UV-Vis分光光度法进行定量分析[37]。

EGEO和CFEO的抗菌作用及细菌敏感性：通过最小抑菌浓度（MIC）和最小杀菌浓度（MBC）测定法测试了EGEO和CFEO对S. typhimurium的抗菌敏感性。确定这些浓度后，进行了时间杀灭实验，以评估精油（EOs）随时间变化的抗菌效果。为了进行这些实验，从实验室的细菌库中选取了一株S. typhimurium菌株。该菌株在美国典型培养物收藏中心（ATCC）的编号为ATCC 14,028，是从4周龄鸡的心脏和肝脏组织中分离出来的，适用于类似的研究[38]。首先将菌株培养在营养肉汤中，然后在选择性沙门氏菌-志贺氏菌（SS）琼脂（Kasvi，巴西）上培养，培养温度为37°C，培养时间为24至48小时。对于MIC、MBC和时间杀灭实验，将细菌接种在0.5 McFarland浊度范围内（1.5 × 10? CFU/mL），接种液使用0.9%（m/v）的氯化钠（NaCl，Merck，德国）溶液。

MIC和MBC的测定：根据临床和实验室标准协会（CLSI）的M7-A6协议中的指南，采用微量稀释法进行测定[39]。实验使用96孔微孔板，每个孔含有100 μL的Mueller Hinton（MH）肉汤（Kasvi，巴西）。EGEO和CFEO进行系列稀释，确保最终孔体积为100 μL。将10 μL的细菌接种液加入每个孔中。对照组包括细菌生长对照（含有细菌悬浮液的MH肉汤）和无菌对照（仅含MH肉汤）。平板在37°C下有氧条件下培养24小时。通过观察浊度来评估细菌生长情况，浊度增加表示细菌繁殖。MIC被定义为没有观察到细菌生长的最低EO浓度。确定MIC后，需要进一步确定该浓度是具有抑菌作用还是杀菌作用。抑菌作用会抑制细菌生长，而杀菌作用会导致细胞死亡。为此，将对应于MIC的浓度（0.5× MIC）和更高浓度（2× MIC）划线接种到MH琼脂板上（Kasvi，巴西），然后在37°C下有氧培养48小时。在给定实验条件下，没有细菌菌落形成的最低浓度即为MBC。

时间杀灭实验：时间杀灭实验是根据Tsuji（2007）[40]描述的协议的修改版本进行的。实验前，将细菌菌株在选择性琼脂板上培养24小时。随后监测EOs在48小时内的抗菌效果。首先将细菌悬浮液调整到0.5 McFarland浊度，接种到含有1 mL MH肉汤的试管中。这些试管在37°C下使用摇床（Láctea，巴西）以温和的搅拌速度（30 RPM）培养。实验包括七种不同的试管条件：无菌对照（SC）、细菌生长对照（BC）以及含有EOs浓度为MIC、2× MIC和4× MIC的试管。在九个不同时间点（0、6、12、18、24、30、36、42和48小时）收集样本。在每个时间点进行定量接种，以确定细菌数量（CFUs），从而评估随时间变化的细菌种群。

EGEO和CFEO的代谢影响：本研究专门设计了精油改良的三糖铁琼脂测定法（EO-TSI Assay），旨在评估EGEO和CFEO对S. typhimurium ATCC 14,028的抗菌效果，重点关注它们对关键细菌代谢过程（如糖发酵、硫化氢（H?S）产生和整体生长活力）的可能影响。三糖铁（TSI）琼脂培养基（KASVI，巴西）按照标准配方制备，含有葡萄糖（0.1%）、乳糖（1%）、蔗糖（1%）、蛋白胨、硫代硫酸钠（Na?O3S2）、硫酸亚铁（FeSO4）和酚红作为pH指示剂。培养基使用蒸馏水制备并高压灭菌（marka da autoclave），待进一步使用。准备EGEO和CFEO的储备溶液，并用DMSO（Merck，德国）稀释至相应的浓度，分别为ATCC 14,028菌株的4x MIC、2x MIC和MIC。将稀释后的EOs加入液体TSI培养基中，充分混合以确保均匀。将改良的TSI琼脂分配到无菌试管（Bioclin，巴西）中，并倾斜放置使其固化，形成适合后续接种的琼脂表面。从SS琼脂上选取分离出的S. typhimurium ATCC 14,028菌落进行接种。使用无菌接种针刺破TSI琼脂底部并在倾斜表面上划线接种。接种后的试管在36°C下有氧培养24小时。在没有细菌菌落在琼脂上的最低浓度即为给定实验条件下的MBC。

EGEO和CFEO的代谢影响：精油改良的三糖铁琼脂测定法（EO-TSI Assay）旨在评估EGEO和CFEO对S. typhimurium ATCC 14,028的抗菌效果，重点关注它们对关键细菌代谢过程（如糖发酵、硫化氢（H?S）产生和整体生长活力）的可能影响。三糖铁（TSI）琼脂培养基（KASVI，巴西）按照标准配方制备，含有葡萄糖（0.1%）、乳糖（1%）、蔗糖（1%）、蛋白胨、硫代硫酸钠（Na?O3S2）、硫酸亚铁（FeSO4）和酚红作为pH指示剂。培养基使用蒸馏水制备并高压灭菌（marka da autoclave），待进一步使用。准备EGEO和CFEO的储备溶液，并用DMSO（Merck，德国）稀释至相应的浓度，分别为ATCC 14,028菌株的4x MIC、2x MIC和MIC。将稀释后的EOs加入液体TSI培养基中，充分混合以确保均匀。将改良的TSI琼脂分配到无菌试管（Bioclin，巴西）中，并倾斜放置使其固化，形成适合后续接种的琼脂表面。从SS琼脂上选取分离出的S. typhimurium ATCC 14,028菌落进行接种。使用无菌接种针刺破TSI琼脂底部并在倾斜表面上划线接种。接种后的试管在36°C下有氧培养24小时。对照组包括未改良的TSI琼脂接种细菌的细菌对照（BC）和不含细菌接种的无菌对照（SC）。培养后，检查试管的颜色变化、黑色沉淀物的形成以及气体的产生。培养基的颜色变化用于评估糖发酵情况，黄色表示产生酸，红色表示没有发酵。黑色FeS沉淀物的形成表示产生硫化氢（H?S）。比较不同浓度的EGEO和CFEO对S. typhimurium代谢的影响。

原位实验：进行了原位实验，以评估EGEO和CFEO在受S. typhimurium污染的猪肉中的防腐效果，模拟肉类在腌制和冷藏前的室温环境。实验接种前，对猪肉样本进行微生物分析以确认没有沙门氏菌存在。

实验设计：新鲜屠宰的猪里脊肉（来自巴西南里奥格兰德州Pelotas的当地屠宰场）被切成标准大小的10克份，确保不含防腐剂。将每份肉放入无菌Falcon试管中，然后加入1 mL浓度为10? CFU/mL的S. typhimurium（ATCC 14028）接种液。选择这种接种浓度是为了模拟可能导致的感染情况。将接种后的肉样在室温下培养5小时以促进细菌定植。随后向每个试管中加入10 mL预先制备的盐水溶液，并将样本储存在8°C ± 2°C的冷藏条件下7天。

盐水制备：使用蒸馏水和1%（v/v）的NaCl制备盐水储备溶液。实验分为四组：（1）不含EOs的对照组；（2）EGEO处理组，加入10× MIC浓度的EGEO；（3）CFEO处理组，加入相同浓度的CFEO；（4）无菌对照组，包含10克未经处理的冷藏肉，不含盐水或细菌接种，以确认接种前没有沙门氏菌。除无菌对照组外，所有组都接种了细菌。选择10× MIC浓度是因为原位实验需要较高的化合物浓度，因为它们会与食品基质中的蛋白质和脂质相互作用。无菌对照组仅用于微生物分析和视觉评估。所有实验均重复三次。

后续分析：在第1天和第7天进行微生物分析，以检测盐水中的沙门氏菌是否存在。这些评估旨在确定EOs是否可以通过减少或消除细菌负荷来提高食品安全性，并降低感染风险。此外，在第1天、第3天和第7天测量盐水的pH值。在这些时间点还分析了电解质浓度（Mg2?和Ca2?），以评估EOs的防腐效果。在第1天、第3天和第7天拍摄肉样的照片，以记录外观的变化。

肉类的视觉评估和微生物分析：在第1天、第3天和第7天，使用iPhone 11（Apple，美国）拍摄肉样的照片，以评估颜色和整体完整性。在第1天和第7天，按照美国公共卫生协会[41]的指示进行沙门氏菌的微生物分离程序。首先进行富集步骤，将肉样与225 mL的缓冲蛋白胨水混合均匀。然后将混合物在37°C下培养24小时以促进细菌生长。富集后，进行第二次富集步骤以增强沙门氏菌的检测效果。将1 mL的富集肉汤转移到含有10 mL Tetrathionate肉汤（TTB，LabM，美国）的试管中，同时将0.1 mL接种到含有10 mL Rappaport-Vassiliadis肉汤（RVB，Accumedia，美国）的试管中。TTB在35°C下培养，RVB在42°C的水浴中培养，两者均为24小时。富集后，将每种培养物的一个环状物划线接种到木糖-赖氨酸-脱氧胆酸盐（XLD，Kasvi，巴西）琼脂板和铋-亚硫酸盐（BSA，Himedia，印度）琼脂板上，以获得分离的菌落。接种后的平板在35°C下培养24小时。根据选择性培养基和TSI、LIA和UREA（Kasvi，巴西）琼脂上的特征表现来鉴定疑似沙门氏菌菌落。决定是否进行存在/不存在分析是基于巴西国家卫生监督局（ANVISA）制定的微生物标准，具体为Instru??o Normativa no 161/2022，该标准对肉制品中的沙门氏菌采取零容忍态度。根据这些指南，即使在定义的样本单元中检测到一个活细胞也被视为潜在的公共卫生风险，因此合规性是定性的而非定量的。

pH测量：使用带有离子电极和温度计的数字pH计（MyLabor，巴西）测量样品的氢电位（pH值）。仅在实验的第1天、第3天和第7天的盐水中进行pH测量，结果表示为三次测量的平均值±标准偏差（SD）。

电解质浓度：根据Ferrer等人（2024）[42]的描述，在冷藏1天、3天和7天后，测量肉中镁（Mg2?）和钙（Ca2?）离子的释放情况，并进行了相应的修改。该测试使用单试剂Mg试剂盒（Bioclin?，巴西）进行比色法测定。使用Cobas MIRA?自动分析仪（Roche Diagnostics，瑞士）在500 nm波长下测量吸光度。Mg2?浓度根据以下公式计算：$$[\text{M}\text{g}^{2+}]=\left[\right({\text{A}\text{b}\text{s}}_{\text{s}\text{a}\text{m}\text{p}\text{l}\text{e}}\times\:2)/{\text{A}\text{b}\text{s}}_{\text{s}\text{t}\text{a}\text{n}\text{d}\text{a}\text{r}\text{d}}]$$ （1）其中Absample是样品的吸光度，Absstandard是标准试剂的吸光度。由于反应遵循比尔-朗伯定律，可以使用校准因子（CF）：$$\:\text{C}\text{F}=\left[\text{S}\text{t}\text{a}\text{n}\text{d}\text{a}\text{r}\text{d}\right]/\left[{\text{A}\text{b}\text{s}}_{\text{S}\text{t}\text{a}\text{n}\text{d}\text{a}\text{r}\text{d}}\right],\:\text{w}\text{h}\text{e}\text{r}\text{e}\:\left[\text{S}\text{t}\text{a}\text{n}\text{d}\text{a}\text{r}\text{d}\right]\:\text{i}\text{s}\:2\:\text{m}\text{g}/\text{d}\text{L}$$ 反应原理利用Mann和Yoe/Magon磺酸盐/ Xylidyl Blue染料。在碱性pH值和Mg存在下，染料会呈现红色，其颜色强度与Mg浓度成正比。该方法不需要蛋白质沉淀，因此比Titan Yellow方法更加灵敏。Ca2?浓度是通过使用Arsenazo III的终点比色法来测量的。在酸性介质中，Ca2?与Arsenazo III反应，形成蓝色复合物，其颜色强度与样品中的Ca2?浓度成正比。反应产物的吸光度是使用Cobas MIRA?自动化分析仪在600至680纳米的波长范围内测量的。使用方程2来计算Ca2?浓度：
$$[\text{C}\text{a}^{2+}]=\left[\right({\text{A}\text{b}\text{s}}_{\text{s}\text{a}\text{m}\text{p}\text{l}\text{e}}\times\:10)/{\text{A}\text{b}\text{s}}_{\text{S}\text{t}\text{a}\text{n}\text{d}\text{a}\text{r}\text{d}}]$$ (2) 所有浓度均以mg/dL表示。

**统计分析**
数据分析使用GraphPad Prism 8.0（GraphPad Software，美国）进行，包括HA、MTT、NR吸收测定、时间-杀灭测定以及pH值、Mg2?和Ca2?的测量。对于细胞毒性测定，数据以三次重复实验的平均值±标准差表示，并使用单因素方差分析（ANOVA）进行后验检验Dunnett检验。对于时间-杀灭测定，使用Mantel-Cox（Log-rank）检验、Gehan-Breslow-Wilcoxon检验和Mantel-Haenszel检验进行统计分析。这些检验用于评估实验组之间的生存曲线差异，同时考虑了细菌数量随时间的变化。Mantel-Cox检验用于评估整体生存差异，而Gehan-Breslow-Wilcoxon和Mantel-Haenszel检验用于关注不同时间点的生存情况并控制混杂变量。选择这些检验是因为它们能够处理被审查的数据，并有效地比较各组之间的事件发生时间分布。pH值、Mg2?和Ca2?浓度数据使用非线性回归模型进行分析，以评估随时间的变化趋势。为了比较多个时间点和处理条件，进行了双因素方差分析（ANOVA），然后使用Tukey的后验检验进行多重比较。使用Shapiro-Wilk检验评估正态性，统计显著性设定为p < 0.05。

**微生物分析**
微生物分析使用Flourish（英国）软件以热图形式呈现。

**结果与讨论**
**细胞毒性测定**
使用哺乳动物红细胞和斑马鱼肝细胞进行了细胞毒性测定，以全面评估所测试化合物对粘附性和非粘附性真核细胞的潜在毒性作用。选定的测定方法——HA、MTT和NR吸收——是评估细胞毒性的成熟且广泛使用的方法。通过采用这种多方面的方法，我们可以确定化合物的细胞毒性行为，并初步了解其在真核细胞中的可能作用机制。在HA测定中，CFEO和EGEO在所有测试浓度下都导致了红细胞破裂，两种化合物的溶血活性相似。该测定作为初步筛选方法，用于在将化合物应用于ZF-L肝细胞进行细胞毒性测试之前确定适当的浓度范围。测试的浓度范围（6.25 %–0.001% v/v）在高达0.5% (v/v)时表现出高细胞毒性。较低的浓度范围（0.5–0.001% v/v）表现出显著较低的溶血活性。选择这个较低范围是为了确保后续细胞活力测定的可行性。溶血活性的结果如图1所示。

**pH值、Mg2?和Ca2?浓度数据分析**
使用非线性回归模型分析pH值、Mg2?和Ca2?浓度数据，以评估随时间的变化趋势。为了比较多个时间点和处理条件，进行了双因素方差分析（ANOVA），然后使用Tukey的后验检验进行多重比较。使用Shapiro-Wilk检验评估正态性，统计显著性设定为p < 0.05。

**讨论**
细胞毒性测定使用哺乳动物红细胞和斑马鱼肝细胞进行，以全面评估所测试化合物对粘附性和非粘附性真核细胞的潜在毒性作用。选定的测定方法——HA、MTT和NR吸收——是评估细胞毒性的成熟且广泛使用的方法。通过采用这种多方面的方法，我们可以确定化合物的细胞毒性行为，并初步了解其在真核细胞中的可能作用机制。在HA测定中，CFEO和EGEO在所有测试浓度下都导致了红细胞破裂，两种化合物的溶血活性相似。该测定作为初步筛选方法，用于在将化合物应用于ZF-L肝细胞进行细胞毒性测试之前确定适当的浓度范围。测试的浓度范围（6.25 %–0.001% v/v）在高达0.5% (v/v)时表现出高细胞毒性。较低的浓度范围（0.5–0.001% v/v）表现出显著较低的溶血活性。选择这个较低范围是为了确保后续细胞活力测定的可行性。溶血活性的结果如图1所示。

MTT测定使我们能够观察到CFEO从第五稀释度（2.94 mg/mL）和EGEO从第三稀释度（14.3 mg/mL）处理后细胞的存活情况。因此，可以认为EGEO对肝细胞的细胞毒性低于CFEO，因为在较高浓度下细胞也没有发生死亡。结果与使用的阳性对照（H?O?）进行了比较。两种油的细胞存活率均高于100%，表明在这些浓度下，化合物没有细胞毒性，也没有抑制细胞增殖。结果如图2所示。

关于NR吸收，化合物从第一个测试浓度开始就没有表现出细胞毒性活性。这表明在测试浓度下，化合物无法改变溶酶体功能。结果如图3所示。

EGEO中高浓度的桉叶油（通过气相色谱分析确定，数据未显示）可能解释了观察到的高细胞存活率。这是因为桉叶油的渗透真核细胞膜的能力较低，主要通过载体蛋白运输[46]。桉叶油常被用作牙膏、糖浆和漱口水等产品中的调味剂，部分原因是其低细胞毒性。Adukwu等人（2016年）[48]的研究表明，CFEO在低于0.25% (v/v)的浓度下对人体真皮成纤维细胞（HDF）没有表现出细胞毒性。然而，CFEO中的主要成分香叶醇在浓度达到0.03%时，细胞存活率达到了80%，在本研究中也得到了类似的结果。其他研究表明，CFEO中香叶醇和香叶醇的浓度之间存在正比关系，这表明香叶醇可能与其他化合物协同作用，从而降低CFEO的细胞毒性。另一种方法是使用纳米乳液和气相CFEO等配方来降低细胞毒性并提高与挥发性化合物混合物的稳定性[43, 45]。

需要强调的是，这里呈现的解释性假设是基于文献支持的推理得出的，并不代表我们实验数据的直接结论。我们的研究小组计划在不久的将来通过实验来验证这些提出的机制。

**EGEO和CFEO的抗菌行为**
表1中的结果显示了CFEO和EGEO对S. typhimurium（ATCC 14028）的MIC和MBC值。CFEO表现出显著更低的MIC和MBC值（0.37 mg/mL），表明其抗菌效力高于EGEO，后者需要1.79 mg/mL的MIC和MBC才能达到类似的效果。在两种精油中，MIC在特定协议下也具有杀菌作用。

这些发现表明，CFEO在较低浓度下更有效地抑制细菌生长并诱导细胞死亡，这可能归因于其特定的化学组成和作用机制。两种精油的MIC和MBC值相同，表明它们的抑菌和杀菌效果发生在相同的浓度，最初表明这是一种直接的杀灭效应，而不仅仅是生长抑制。Cymbopogon属植物以其低MIC值而闻名，特别是因为该属的精油被认为是良好的膜破坏剂[49]。其他研究表明，临床分离株和其他血清型的沙门氏菌的MIC/MBC值较高，这与我们的结果不符[50]。很少有研究专门针对Cymbopogon flexuosus进行研究。

此外，未在测试浓度范围之外发现MBC值，这证实所选浓度足以确定两种精油的杀菌潜力，并且该菌株对这些化合物敏感。这些结果突显了CFEO作为对抗S. typhimurium的更强效的抗菌候选物的潜力，而尽管EGEO需要更高的浓度，但仍表现出显著的抗菌活性。

与细胞毒性测定相比，CFEO在MIC/MBC（0.37 mg/mL）时并不被认为具有显著的溶血作用，也没有损害ZF-L细胞的线粒体和溶酶体功能。同样，EGEO在MIC/MBC（1.79 mg/mL）时在MTT和NR吸收测定中也没有细胞毒性，但这是一个高溶血浓度。为了进一步研究这些精油在恒定搅拌条件下的抗菌行为，进行了时间-杀灭测定。结果如图4所示。

时间-杀灭测定结果显示，CFEO在4x、2x和MIC浓度下对S. typhimurium（ATCC 14026）表现出强烈的杀菌效果。CFEO在4×和2× MIC浓度下六小时内完全消除了活性菌落，显示出显著的杀菌效果。在MIC浓度下，CFEO仅表现出抑制作用，与细菌对照（BC）相比菌落数量明显减少，表明抗菌反应具有剂量依赖性。同样，EGEO在4× MIC浓度下六小时内也表现出杀菌活性，而较低浓度（2× MIC和MIC）仅抑制了细菌生长，菌落数量相对于BC有所减少。CFEO在对大肠杆菌（E. coli）和金黄色葡萄球菌（S. aureus）的时间-杀灭测定中也显示出类似的结果，在6小时内完全杀菌。使用CFEO在0.25倍其MIC浓度处理大肠杆菌的研究也表明，它在6小时开始减少细菌数量[53]。对不同血清型沙门氏菌的研究表明，该属似乎对EGEO的组成具有相当的抵抗力，其MIC和MBC值显著高于我们的研究结果[54, 55]。

观察到的杀菌效果差异可以归因于CFEO和EGEO的不同化学组成。CFEO与膜破坏有很强的关联[48, 49]，这可能解释了其快速和显著的杀菌活性，使其成为消毒用途的有希望的候选物。相比之下，EGEO在破坏细菌膜方面的效果较弱[46]，但其抑制作用表明可能存在另一种作用机制，可能是针对细菌代谢，而不是直接的膜破坏。这表明EGEO可能在调节细菌代谢过程中具有价值，这可以为新的抗菌策略提供探索方向。

总体而言，时间-杀灭数据强化了CFEO作为快速作用杀菌剂的潜力，而EGEO的抑制作用需要进一步研究以阐明其确切的作用机制和潜在的应用。S. typhimurium BC菌株显示了预期的结果：K/A试管反应、H?S的产生以及气体置换（尽管可能不易察觉），这证实了所用菌株的活性。关于CFEO的结果，培养基中的油并未抑制葡萄糖的发酵或H?S的产生。然而，油阻止了细菌作为能量来源所使用的肽类的氧化降解，导致A/A试管中出现黑色沉淀物。对于EGEO，4倍和2倍的MIC浓度并未引起任何颜色变化，与SC组相似。提出了两种假设来解释这种行为：（1）微生物立即死亡，导致试管中没有微生物活性；（2）细菌代谢显著降低，以至于阻止了葡萄糖的发酵并随之导致培养基酸化。通过划线培养前两个试管中的样本，排除了（1）种可能性，因为观察到了细菌生长。在1倍的MIC浓度下，EGEO并未阻止葡萄糖的发酵，但抑制了肽类的氧化。最有趣的发现是，在所有EGEO浓度下均未观察到H?S的产生，这表明其对硫代谢有显著影响。这些结果提供了重要见解，例如EGEO可能直接干扰细菌的硫代谢，即使在仍允许葡萄糖发酵的浓度下也能阻止H?S的产生。这表明其作用具有针对性，可能暗示了超越简单细胞破坏的新抗菌机制。在CFEO的情况下，显然硫代谢和葡萄糖发酵均未受到影响，细菌仍然能够繁殖。然而，它直接影响了肽类的氧化。

MIC/MBC、时间杀菌效果和EO-TSI结果之间的相关性提供了对EGEO和CFEO对S. typhimurium抗菌和代谢效应的全面理解。这种代谢紊乱可能显著影响S. typhimurium的毒力，因为硫代谢对多种细胞功能至关重要，包括能量产生、应激反应和生物膜的形成[57,58,59,60]。抑制H?S的合成可能会降低细菌调节宿主免疫反应和抵抗氧化应激的能力，从而可能削弱其致病性[58, 60]。同时，CFEO对肽类氧化的抑制可能会影响氮的吸收，进一步限制细菌在营养受限环境中的生长和存活[61]。这些发现不仅突显了EGEO和CFEO的直接抗菌效果，还表明它们能够改变关键代谢途径，这可能影响细菌在宿主环境中的适应性和毒力。

在冷藏一周后的腌制猪肉中进行了微生物检测，以确定实验开始（第1天）和结束时（第7天）是否存在沙门氏菌。拍摄了照片以评估腌制肉块的颜色和外观，如图6所示。

不同盐液配方对肉外观随时间变化的影响进行了视觉评估。图6展示了用（a）标准盐液（1%盐）、（b）基于EGEO的盐液和（c）基于CFEO的盐液处理的肉样在第1天（D1）、第3天（D3）和第7天（D7）的代表性图像。为了对比，还展示了一块未腌制的肉的参考图像。基于CFEO的盐液处理显示出随时间逐渐变暗和泛黄的现象，而基于EGEO的盐液较好地保持了肉的结构完整性，但仍有一些降解。两种EO处理都表现出各自特有的强烈气味。标准盐液保持了肉的原始外观，变化最小，表明其在保持视觉质量方面的有效性。在EO处理中，基于EGEO的盐液在外观上与标准盐液最为相似。与未腌制的肉的参考图像相比，无论使用哪种盐液配方，腌制过程都会随时间改变肉的外观，并影响其质地和颜色，EO可能还引入了额外的防腐效果。微生物分析显示，在第1天所有样本中均未检测到沙门氏菌。然而，在第7天，CFEO处理组中有两个重复样本检测到了沙门氏菌，而盐水和EGEO组则保持了完全的细菌抑制。微生物分析的结果如图7所示。

对用标准盐液（盐水溶液）和含有桉树精油（EGEO）或香茅精油（CFEO）的盐液浸泡的猪里脊肉样本中的沙门氏菌进行了微生物分析，盐液的浓度为10倍MIC，在冷藏条件下储存7天。结果展示了第1天和第7天的情况。绿色条形表示没有沙门氏菌，红色条形表示存在沙门氏菌。每种处理都进行了三次重复实验。疑似含有沙门氏菌菌落的样本进行了生化确认。热图使用Flourish软件生成。

这些结果表明，在储存期间，CFEO在防止沙门氏菌存活方面不如EGEO有效。一个可能的解释是，CFEO中的抗菌化合物虽然最初有效，但可能随时间发生了降解或扩散，降低了其效力。相比之下，EGEO在整个实验过程中似乎保持了其抗菌活性。对照组中没有沙门氏菌可能是由于冷藏过程的自然抑制作用以及初始的细菌接种量。然而，这并不排除在没有抗菌干预的情况下，如果储存时间较长，沙门氏菌数量可能会增加的可能性。

在实验过程中，分别在第1天、第3天和第7天测量了盐液的pH值以及Mg2?和Ca2?的水平。关于pH值，结果总结在表3中。

初始时，不同处理组的样本pH值存在显著差异，CFEO盐液的pH值（3.86±0.70）明显低于盐液对照组（5.62±0.34）和EGEO盐液（5.20±0.62）。这表明CFEO可能在储存初期增加了酸度。然而，从第3天开始，所有样本的pH值趋于一致，表明肉可能具有缓冲作用或逐渐中和的过程。到第7天，所有处理的pH值稳定在6.00左右，组间差异较小。CFEO组pH值随时间的逐渐升高表明其最初的酸化效应是短暂的，可能是由于EO成分与肉基质之间的相互作用。这些pH值的变化可能影响细菌生长、酶活性和肉的保存，因为较低的pH值通常与抗菌效果相关[63]，而向中性pH值的转变可能会促进与腐败相关的微生物活动。需要进一步的微生物分析来确定这些pH值变化是否与细菌负荷差异相关。相比之下，保存不当的肉通常会因酸性副产物的积累（例如乳酸）和内源性酶的活性而pH值下降[63, 64]。然而，长期的高酸度可能表明自溶，这一过程通过冷藏得到了有效抑制[64,65,66]。此外，冷藏在一定程度上也防止了腐败[63]。在我们的实验中并未观察到这些现象。

在整个实验过程中测量了Ca2?的水平，以评估EGEO和CFEO在含有S. typhimurium的腌制猪肉中的潜在防腐效果。钙是一种重要的电解质，参与多种生化过程，包括微生物代谢、细胞壁完整性和酶活性[66, 67]。因此，监测钙水平可以了解EOs、细菌活性和肉基质组成之间的潜在相互作用。表4总结了不同盐液中Ca2?的水平。

在第1天，所有实验组的Ca2?浓度相对稳定，对照组（盐水溶液）和处理组（含有EGEO或CFEO的盐液）之间没有显著差异。这表明EO的初始添加并未立即改变盐液中Ca2?的溶解度或可用性。到第3天，对照组中的Ca2?水平略有下降，可能是由于与蛋白质和其他肉成分的相互作用，导致沉淀或结合。有趣的是，两种EO处理组的Ca2?水平更加稳定，这可能表明EGEO和CFEO在维持盐液中的电解质平衡方面具有保护作用。一个可能的解释是EO的抗菌活性减少了可能导致钙耗尽的细菌和内源性酶的自溶过程[62, 63, 67]。到第7天，对照组中的钙浓度显著下降，而EO处理组的钙浓度显著升高。对照组的下降可能与细菌生长和代谢活动的增加有关，导致钙的结合或消耗。相比之下，EO处理组表现出保存效果，可能是通过限制细菌定植和肉环境中的代谢变化。值得注意的是，CFEO在稳定钙水平方面似乎比EGEO更有效，表明它们的作用机制可能存在差异。

在肉中，包括里脊肉这样的切割部位，无氧条件会加速依赖氧的蛋白质（如肌红蛋白、血红蛋白）的降解，在没有保存方法的情况下，作为离子泵的蛋白质也会开始水解。ATP酶、钙结合蛋白和其他参与Ca2?运输的蛋白质在死后早期变化中促进了大量的离子交换，导致Ca2?离子的增加[66, 68]。实际上，所有生物阳离子都会增加，尤其是Mg2?、Ca2?和Na?[69]。阳离子浓度的增加也与肉组织中的水分损失有关，这会导致离子平衡失调[68, 69]。这些发现支持EGEO和CFEO通过其抗菌特性有助于在肉保存过程中稳定电解质平衡的假设[70]。EOs减轻Ca2?波动的能力可能提高腌制作为保存方法的整体效果，减少细菌引起的变质并延长肉的保存时间。表5总结了三种盐液中Mg2?的水平。与Ca2?类似，Mg2?在肉细胞中扮演着多个关键角色，主要与细胞代谢、酶激活和结构稳定性相关。Mg2?有助于即使在死后也能维持肌肉细胞的能量产生，影响肉中的生化过程，如糖酵解和pH调节[66,67,68]。

在不同实验组中，肉样本中的Mg2?水平随时间有显著变化。第1天，所有组的Mg2?浓度相对较低，其中盐水对照组（1.60 mg/dL）的浓度略高于EO处理组（EGEO为1.13 mg/dL，CFEO为1.07 mg/dL）。这表明EO的初始添加并未立即改变盐液中的Ca2?溶解度或可用性。到第3天，对照组中的Ca2?水平略有下降，可能是由于与蛋白质和其他肉成分的相互作用。有趣的是，两种EO处理组的Ca2?水平更加稳定，这可能表明EGEO和CFEO在维持盐液中的电解质平衡方面具有保护作用。一个可能的解释是EO的抗菌活性减少了可能导致钙耗尽的细菌和内源性酶的自溶过程[62, 63, 67]。到第7天，对照组的钙浓度显著下降，而EO处理组的钙浓度显著升高。对照组的下降可能与细菌生长和代谢活动的增加有关，导致钙的结合或消耗。相比之下，EO处理组表现出保存效果，可能是通过限制细菌定植和肉环境中的代谢变化。值得注意的是，CFEO在稳定钙水平方面似乎比EGEO更有效，表明它们的作用机制可能存在差异。

在肉中，包括里脊肉这样的切割部位，无氧条件会加速依赖氧的蛋白质的降解。在没有保存方法的情况下，作为离子泵的蛋白质也会开始水解。ATP酶、钙结合蛋白和其他参与Ca2?运输的蛋白质在死后早期变化中促进了大量的离子交换，导致Ca2?离子的增加[66, 68]。实际上，所有生物阳离子都会增加，尤其是Mg2?、Ca2?和Na?[69]。阳离子浓度的增加也与肉组织中的水分损失有关，这会导致离子平衡失调[68, 69]。这些发现支持EGEO和CFEO通过其抗菌特性有助于在肉保存过程中稳定电解质平衡的假设[70]。EOs减轻Ca2?波动的能力可能提高腌制的整体效果，减少细菌引起的变质并延长肉的保存时间。表5总结了三种盐液中Mg2?的水平。与Ca2?类似，Mg2?在肉细胞中也扮演着多个关键角色，主要与细胞代谢、酶激活和结构稳定性相关。Mg2?有助于即使在死后也能维持肌肉细胞的能量产生，影响肉中的生化过程，如糖酵解和pH调节[66,67,68]。

在不同实验组中，肉样本中的Mg2?水平随时间有显著变化。第1天，所有组的Mg2?浓度相对较低，其中盐水对照组（1.60 mg/dL）的浓度略高于EO处理组（EGEO为1.13 mg/dL，CFEO为1.07 mg/dL）。这表明EO的初始添加并未立即影响盐液中的Ca2?溶解度或可用性。到第3天，盐水组中的Mg2?浓度显著增加（3.67 mg/dL），而EGEO组的增加较为温和（2.67 mg/dL）。有趣的是，CFEO组的Mg2?水平最低（0.93 mg/dL），这表明CFEO可能与盐液中的矿物质成分发生了相互作用。这种减少可能是由于CFEO中的成分螯合、沉淀或吸收了Mg2?。到第7天，盐水溶液中的Mg2?浓度降至1.80 mg/dL，可能是由于沉淀或蛋白质-矿物质相互作用。相比之下，两种EO处理组的镁浓度都高于之前的时间点，EGEO达到3.07 mg/dL，CFEO达到3.33 mg/dL。这表明EO可能影响了盐液中Mg2?的保留或释放，可能改变了离子平衡并影响了保存过程。CFEO和EGEO处理之间的对比趋势突显了这些EO可能与电解质之间的不同化学相互作用。CFEO最初降低了Mg2?浓度，而EGEO则显示出更稳定的增加。这种差异可能与它们的化学组成有关，这可能影响它们在盐液中的溶解度、结合亲和力或代谢活性。图8显示了样品中pH值和电解质水平之间的差异。该图像的替代文本可能是使用人工智能生成的。全尺寸图像显示了使用桉树（Eucalyptus globulus，EGEO）和香茅（Cymbopogon flexuosus，CFEO）精油处理的肉样与盐水对照液相比，钙（Ca2?）和镁（Mg2?）浓度以及pH值随时间的变化情况。a 不同时间点（第1天、第3天和第7天）测得的Ca2?浓度（mg/dL）。b 相同时间点的Mg2?浓度（mg/dL）。c 实验过程中的pH变化。误差条代表标准差（SD）。通过双因素方差分析（Two-way ANOVA）后进行Tukey事后检验来确定统计显著性。当p<0.05时，认为各组之间的差异具有显著性。

不同处理方法下的pH变化似乎与Ca2?和Mg2?浓度直接相关，因为这些离子在生物缓冲系统中起作用，并与氢离子相互作用[71, 72]。与盐水和EGEO处理相比，CFEO处理样品的初始pH值较低，这可能表明氢离子的可用性较高，这可能是由于CFEO中某些成分（如柠檬醛[73]）的螯合作用。随着时间的推移，所有处理组的pH值趋于稳定，反映了氢离子浓度和电解质平衡之间的动态平衡。Ca2?和Mg2?通过参与生化平衡在pH稳态中起着关键作用[72, 74]。在CFEO处理样品中观察到的Ca2?水平升高可能表明肉基质中的离子渗出或是对酸化的补偿反应，因为Ca2?通常会被动员出来以抵消pH值的下降。相比之下，Mg2?水平的波动，尤其是在EGEO处理中，表明可能存在不同的相互作用机制，可能涉及有助于pH稳定的离子交换。

将这些生化发现与微生物数据相关联时，可以得出一个可能的解释：CFEO处理样品在第1天的环境非常酸性（平均pH约为3.86），这可能最初抑制了细菌生长。然而，随着pH值的升高（第7天约为5.99），条件变得更加有利于沙门氏菌的生存。与此同时，EGEO处理样品保持了更稳定的pH值（第1天约为5.53，第7天约为6.04），可能支持了更持久的抗菌效果。电解质测量进一步揭示了关键趋势：CFEO处理样品中的Ca2?和Mg2?水平低于EGEO和盐水组。由于这些阳离子对细菌细胞壁稳定性和应激反应至关重要，它们的减少可能最初削弱了细菌的抵抗力。然而，随着离子紊乱随时间的减轻，CFEO的抗菌效果也减弱了。

结论

本研究表明，EGEO和CFEO都对鼠伤寒沙门氏菌（S. typhimurium）具有抗菌活性，尽管其效力和生物学效应不同。CFEO显示出较低的最低抑菌浓度（MIC）和最低杀菌浓度（MBC），并且在时间杀菌试验中表现出快速的杀菌活性，表明在受控的体外条件下具有强烈的膜破坏潜力。相比之下，EGEO的MIC/MBC较高，但引起了细菌代谢行为的显著变化，包括抑制H?S的产生，这可能表明其对硫代谢产生了干扰。然而，这些解释应被视为基于生化观察的机制假设，而不是确定的机制结论。细胞毒性试验提供了关于这些精油在食品应用中安全性的宝贵见解。两种精油都表现出不同程度的细胞毒性，其中EGEO在较高浓度下表现出较低的细胞毒性并保持了细胞活力。这些发现表明，虽然这两种精油在抗菌活性方面都有效，但它们的安全性特征不同，使得CFEO成为更强的抗菌剂，但由于其较高的细胞毒性，不太适合直接应用。在猪肉原位模型中，这两种精油被评估为传统腌制系统的辅助成分。由于盐水对照也完全抑制了沙门氏菌的生长，因此抗菌效果不能完全归因于精油。相反，研究结果表明EGEO在测试的保存基质中保持了抗菌稳定性，而CFEO的长期效果较差。因此，这些精油的作用应被视为对现有保存方法的补充，而不是独立的防腐剂。

总体而言，结果强化了EGEO和CFEO的抗菌潜力，并突显了它们与细菌细胞和食品基质的独特生物学相互作用。未来的研究应进一步探讨它们的作用机制，并评估优化配方和安全参数，以更好地定义它们在食品保存系统中的适用性。