《Theriogenology》：Lipopolysaccharide (LPS)-induced inflammation alters expression of TGF beta signaling components in the bovine oviduct
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马克西米利亚诺·德·博克（Maximiliano De Boeck）|弗朗科·塞巴斯蒂安·乔克（Franco Sebastián Choque）|米尔达·阿莱杭德拉·维拉（Milda Alejandra Vella）|玛丽埃拉·罗尔丹-奥拉特（Mariela Roldán-Ola
马克西米利亚诺·德·博克（Maximiliano De Boeck）|弗朗科·塞巴斯蒂安·乔克（Franco Sebastián Choque）|米尔达·阿莱杭德拉·维拉（Milda Alejandra Vella）|玛丽埃拉·罗尔丹-奥拉特（Mariela Roldán-Olarte）|巴勃罗·阿尔贝托·瓦尔德坎托斯（Pablo Alberto Valdecantos）
阿根廷图库曼省圣米格尔-德图库曼市查卡布科461号，CONICET-UNT所属生物研究所（Instituto Superior de Investigaciones Biológicas, INSIBIO），邮编T4000ILI
摘要
产后细菌感染引发的脂多糖（LPS）诱导的炎症是导致牛繁殖能力下降的主要原因之一；然而，其对输卵管功能的影响仍知之甚少。本研究在模拟发情周期卵泡期和黄体期的激素条件下，探讨了LPS对牛输卵管上皮细胞（BOEC）中炎症因子和TGFβ/BMP信号通路成分表达的影响。细胞毒性分析显示，从短期输卵管组织培养物中提取的BOEC细胞比传统单层培养细胞对LPS的耐受性更强，即使在LPS浓度极高、严重损害单层培养中上皮细胞和基质细胞存活能力的情况下也是如此。通过对炎症介质（IL6、TNFA、NFKB1、IL10）及TGFβ/BMP信号通路成分（TGFB1、BMP7、ID3）的基因表达分析，发现激素环境调节了上皮细胞对LPS的反应。在无激素条件下，LPS上调了促炎基因以及TGFB1、BMP7和ID3的表达；在类似卵泡期的条件下，LPS上调了IL10、TGFB1和BMP7的mRNA表达；而在类似黄体期的条件下，LPS则下调了促炎基因IL6、TNFA和NFKB1的表达，同时上调了IL10及相关TGFβ/BMP信号通路的基因表达，这表明这些反应受激素调控。通过检测细胞与胶原基质的粘附能力来评估上皮细胞功能，发现LPS会损害BOEC的粘附能力，且这种损害程度受卵巢类固醇的影响不同。这些发现表明，牛输卵管的炎症免疫反应受到激素环境和组织结构的共同调控，TGFβ/BMP信号通路可能在维持上皮细胞稳态中起关键作用，这对牛的生殖功能具有重要意义。
引言
哺乳动物的输卵管是一个重要的生殖器官，它提供了精细调控的微环境，使得配子运输、卵子成熟、精子获能、受精及早期胚胎发育能够依次顺利进行，从而确保繁殖成功[1]、[2]、[3]、[4]。然而，在牛的养殖过程中，早期胚胎丢失是一个主要问题，其中大部分胚胎丢失发生在输卵管内[5]，这凸显了维持输卵管稳态对繁殖成功的重要性。
产后由革兰氏阴性细菌引起的子宫感染主要通过脂多糖（LPS）的作用损害生育能力，LPS是一种与病原体相关的分子模式（PAMP），会破坏卵巢和生殖道的功能。尽管LPS对卵巢和子宫内膜生理的影响已有充分记录，但其对输卵管功能的影响及其在早期胚胎丢失中的作用仍不甚清楚[6]。在输卵管上皮细胞（OEC）中，LPS可激活Toll样受体（TLRs），引发NF-κB信号通路并产生促炎细胞因子[7]、[8]。
输卵管黏膜由纤毛上皮细胞和分泌上皮细胞以及其下的固有层组成，会分泌含有生长因子、免疫调节因子和细胞外囊泡的复杂液体，这些成分调节早期生殖过程[9]、[10]。其中，转化生长因子β（TGFβ）超家族的成员在维持上皮细胞稳态、免疫调节和组织修复中起关键作用[11]、[12]。在输卵管中，TGFβ配体及其受体既具有典型作用（通过SMAD依赖性途径），也具有非典型作用[13]、[14]、[15]、[16]，它们通过多种途径调节细胞增殖、分化和上皮细胞完整性[17]。值得注意的是，TGFβ信号通路对维持小鼠的输卵管结构至关重要[18]，并且在牛体内具有免疫调节和胚胎支持功能[19]、[20]、[21]。
来自生殖组织的最新研究表明，TLR和TGFβ介导的信号通路之间存在广泛相互作用，炎症刺激会调节TGFβ信号通路，进而影响炎症的强度和消退过程。在输卵管中，LPS激活TLR2/4，改变胚胎微环境，同时增加促炎细胞因子和TGFβ1的表达[6]，这种双重激活可能导致一种功能失调的状态：TGFβ信号通路试图限制炎症，但同时又加剧了炎症反应，可能损害上皮细胞功能[22]。然而，LPS对牛输卵管中TGFβ通路成分表达和调控的具体影响尚不明确。
我们假设LPS通过改变上皮细胞内的TGFβ信号通路来破坏输卵管的稳态。为此，我们使用了一种体外输卵管培养模型，在模拟发情周期卵泡期和黄体期的激素条件下暴露于LPS。这种方法使我们能够确定上皮细胞对LPS的反应是否受主导性性激素环境的影响，并研究LPS对炎症因子和TGFβ通路成分表达的影响。这些发现为理解与炎症相关的输卵管功能障碍机制提供了新的见解。
章节摘录
组织采集
在屠宰后立即从当地屠宰场收集未怀孕母牛（Bos taurus）的生殖道样本，并将其置于pH 7.4的磷酸钠缓冲液（PBS）中，然后在4°C下运输至实验室。样本在采集后3小时内进行处理。仅纳入没有解剖学异常的生殖道样本。根据卵巢结构和子宫黏液特征通过肉眼观察确定发情周期阶段。
输卵管上皮细胞培养物比单层培养细胞更耐受LPS诱导的细胞毒性
为了确定后续实验中使用的非细胞毒性LPS浓度，我们首先比较了作为单层培养的BOEC和从输卵管组织中提取的BOEC的存活能力。
在BOEC单层培养中，浓度高达0.1 μg/mL的LPS在24小时后并未影响细胞存活率；而暴露于1 μg/mL的LPS后，细胞存活率显著下降至约55 ± 5.01%（平均值±标准误差），而对照组为90 ± 3.1%（p < 0.05）（图1A）。BOSC单层培养细胞的敏感性类似。
讨论
本研究揭示了BOEC对LPS的炎症反应机制，强调了细胞环境和激素环境的影响。通过使用原代单层细胞和在生理激素条件下培养的短期输卵管组织，我们证明了LPS的细胞毒性依赖于细胞所处的环境。此外，非细胞毒性的LPS剂量可以调节炎症介质和TGFβ信号通路成分的表达。
结论
我们的研究表明，牛输卵管上皮细胞对LPS的炎症反应具有激素依赖性。结果还强调了组织结构、细胞间相互作用以及细胞与细胞外基质相互作用在调节炎症反应中的重要性。转录分析表明，卵巢类固醇可调节炎症介质和TGFβ/BMP信号通路关键成分的表达，这可能有助于维持上皮细胞的稳态。
作者贡献声明
巴勃罗·阿尔贝托·瓦尔德坎托斯（Pablo Alberto Valdecantos）：负责撰写、审稿与编辑、项目监督、方法设计、资金获取及概念构思。马克西米利亚诺·德·博克（Maximiliano De Boeck）：负责撰写初稿、数据可视化、方法设计、实验实施及结果分析、概念构思。弗朗科·塞巴斯蒂安·乔克（Franco Sebastián Choque）：负责数据可视化及实验实施。米尔达·阿莱杭德拉·维拉（Milda Alejandra Vella）：负责实验实施。玛丽埃拉·罗尔丹-奥拉特（Mariela Roldán-Olarte）：负责撰写、审稿与编辑、项目监督及资金获取。
利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。
致谢与资金披露
作者感谢阿根廷图库曼市的Frigorífico Calchaquí S.A.屠宰场提供的牛样本支持。本研究部分得到了阿根廷国家科学技术促进机构（Agencia Nacional de Promoción Científica y Tecnológica, ANPCyT；M.R.O.，项目编号PICT 2020-3858）、国家科学技术研究委员会（Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas, CONICET；M.R.O.，项目编号PIP 2021-3289）以及图库曼国立大学（Universidad Nacional de Tucumán；M.R.O.，项目编号PIUNT 2023-D-751和P.A.V.，项目编号PIUNT D-763）的资助。
