氟苯尼考会抑制牛卵巢颗粒细胞的类固醇激素分泌：这与cAMP/PKA/StAR信号通路及氧化应激有关

《Theriogenology》：Florfenicol impairs steroid hormone secretion in bovine ovarian granulosa cells: Involvement of the cAMP/PKA/StAR signaling pathway and oxidative stress

　　

Jiahao Zhao|Xiangyu Zhou|Baoyi You|Bowen Cheng|Jiashuo Hu|Yuxuan Lu|Dianrui Xu|Xiwei Zhang|Chunlong Yan|Qingshan Gao|Haixing Liu|Qingguo Jin

延边大学，吉林延吉，133002，中国

摘要

氟苯尼考（FLO）被广泛用于治疗处于不同生理阶段的牛的细菌性呼吸道疾病和蹄腐病。然而，积累在牛体内的FLO残留物可能对动物健康产生不良影响。尽管已有研究表明FLO具有胚胎毒性和细胞毒性，但其对牛颗粒膜细胞（GCs）的作用机制仍不完全清楚。在这项研究中，我们将GCs暴露于0、10和100 μg/mL浓度的FLO中48小时，以评估FLO对细胞活力、线粒体功能和类固醇激素合成的影响。结果表明，FLO处理导致细胞凋亡增加、GCs增殖减少以及线粒体功能受损。此外，FLO处理还伴随着ATP水平下降和细胞内活性氧（ROS）增加。进一步的研究发现，FLO暴露与PROG和E2的产生变化、StAR和CYP11A1的蛋白质表达减少以及腺苷酸环化酶（AC）、环磷酸腺苷（cAMP）和蛋白激酶A（PKA）水平降低有关。抗氧化剂N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC）部分缓解了这些变化。总之，我们的研究结果表明，FLO暴露与GCs功能障碍和类固醇生成能力下降有关。这些效应可能与氧化应激、线粒体功能障碍以及cAMP/PKA/StAR信号通路的变化有关，尽管直接的因果关系仍需进一步阐明。

引言

兽药对于维持动物健康、控制疾病和提高生产力至关重要。它们在兽医实践和农业生产中得到广泛应用。氟苯尼考（FLO）是一种第三代氯霉素衍生物，通过抑制细菌蛋白质合成来抑制革兰氏阳性和革兰氏阴性细菌以及支原体的生长[1,2]。最初，FLO在水产养殖中得到广泛应用；然而，水生生物无法完全代谢它，导致其释放到水生生态系统中[3]。由于其稳定的化学性质，FLO在环境中不易降解。因此，它存在于动物源性食品、农场废水和天然水体中可能对公共健康构成风险[4]。在农场中，FLO被广泛用作氯霉素的替代品，因为它副作用较少。此外，FLO具有良好的组织渗透性和缓慢的代谢清除特性，可以在各种器官和组织中分布，并可能作为残留物积累[[5], [6], [7]]。

FLO在动物体内的使用会引发多种毒性效应，包括肝毒性、免疫毒性、肾毒性和生殖毒性[[8], [9], [10], [11]]。许多研究表明，FLO具有胚胎毒性。当雌性斑马鱼连续暴露于0.05和0.5 mg/L浓度的FLO中28天时，它们的生殖能力和孵化率会降低。同时，还会观察到胚胎发育异常[12]。在另一项研究中，雌性海兰鸡通过口服给予60和90 mg/kg体重的FLO。到胚胎发育的第五天，孵化率显著下降，而胚胎死亡率增加[13]。重要的是，先前的研究报道，长期暴露于FLO可能会在海洋青鳉中引起生殖毒性，包括卵巢损伤和后代的发育毒性[14]。此外，在牛的精浆中检测到了FLO及其代谢物的残留物，表明它可能在生殖系统中分布[15]。在细胞水平上，FLO已被报道具有细胞毒性效应，这可能与线粒体功能障碍有关。例如，FLO抑制P19多能胚胎干细胞（P19SCs）的增殖并损害其细胞功能[16]。此外，体外研究表明，FLO抑制成纤维细胞的增殖和自噬活性，同时伴随着线粒体DNA编码蛋白表达减少、线粒体膜电位降低和活性氧（ROS）产生增加[17]。

颗粒膜细胞（GCs）是卵巢的功能核心，通过分泌类固醇激素（如雌二醇和孕酮）来调控卵泡成熟和卵子发育。在GCs中，线粒体作为主要的代谢中心，将能量产生与类固醇前体的生物合成相结合[18]。类固醇生成的调控是一个紧密协调的过程，其中cAMP/PKA信号通路的激活促进了类固醇生成急性调节蛋白（StAR）的表达和活性，从而促进了胆固醇向线粒体的限速转运[19]。越来越多的证据表明，氧化应激会破坏线粒体功能并损害GCs的类固醇生成能力，从而影响激素生产和卵泡发育[20]。GCs功能障碍可能导致卵泡发育异常和排卵问题，影响雌性生育能力，并导致不孕症、多囊卵巢综合征（PCOS）和早发性卵巢衰竭（POF）等生殖障碍[21,22]。由于其高代谢活性、增殖能力和对环境压力的敏感性，GCs被广泛用于体外模型中研究生殖毒素[23]。

基于这些发现，我们假设FLO暴露会损害颗粒膜细胞功能并影响类固醇激素合成，并可能与线粒体功能障碍和氧化应激有关，可能是通过cAMP/PKA/StAR信号通路实现的。为了验证这一假设，我们研究了FLO对牛原代GCs的影响，重点关注细胞活力、线粒体功能和类固醇生成能力。

章节片段

化学

氟苯尼考（FLO；纯度≥98%，F111293）和N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC；纯度≥99%，A105420）购自Aladdin Biochemical Technology（上海，中国）。二甲基亚砜（DMSO）购自Sigma-Aldrich（MKCP0362，圣路易斯，密苏里州，美国）。Dulbecco改良Eagle培养基/Nutrient混合物F-12（DMEM/F12）购自Gibco（C11330500BT，纽约州格兰德岛，美国）。FLO溶解在90% DMEM/F12培养基和10% DMSO的混合物中，充分涡旋以确保

FLO对GCs活力的影响

FSHR是GCs的特异性标志物。因此进行了免疫荧光染色以验证分离细胞的身份[30]。如图1A所示，细胞质中观察到强烈的绿色荧光信号，而细胞核用DAPI（蓝色）进行复染。这些结果表明，分离出的细胞是纯度≥95%的牛GCs，适合后续实验。细胞活力结果如图1B所示。GCs被不同

讨论

FLO的胚胎毒性和生殖毒性值得特别关注。先前的研究表明，12.6 mg/L浓度的FLO会抑制水蚤的生长并减少新生个体的数量[31]。在斑马鱼中，FLO引起的线粒体损伤可以遗传给后代，导致发育异常[12]。长期暴露于FLO已被报道会导致海洋青鳉的生殖系统损伤[14]。此外，FLO及其代谢物的残留物

结论

FLO是一种广泛使用的兽用抗生素，其对动物的潜在不良影响越来越受到关注。我们的研究表明，FLO处理会降低GCs的活力，抑制细胞增殖并促进细胞凋亡。如图8所示，FLO处理与GCs的类固醇生成能力下降和cAMP/PKA/StAR信号通路的活性改变有关，同时伴有线粒体功能障碍和氧化应激增加。总之，这些发现

CRediT作者贡献声明

Jiahao Zhao：撰写——原始草稿、可视化、验证、方法学、研究、正式分析、数据管理、概念化。Xiangyu Zhou：验证、软件、方法学、正式分析、数据管理。Baoyi You：验证、监督、方法学、研究、正式分析。Bowen Cheng：可视化、资源管理、方法学、研究。Jiashuo Hu：可视化、验证、方法学、研究、正式分析。Yuxuan Lu：验证、资源管理，

出版同意

已获得所有参与者的书面知情同意。

伦理批准

本研究已获得延边大学实验动物福利和伦理委员会的批准（批准编号：YD20240430004）。

数据声明

数据可根据请求提供。

资助

本研究得到了中国吉林省科学技术厅（项目：地方特色肉牛胚胎工程技术系统的研究与示范的支持；资助编号：YDZJ202203CGZH040。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的财务利益或个人关系。