隐睾症导致牦牛莱迪希细胞（Leydig cells）发生睾丸氧化应激诱导的铁死亡（ferroptosis）的分子机制

《Theriogenology》：Molecular mechanism of testicular oxidative stress-induced ferroptosis in Leydig cells caused by cryptorchidism in yak

　　

曾建林|袁立刚|齐玉梅|陈国娟|陈玉璐|李海军|宋亚金|张彦龙

甘肃农业大学兽医学院，兰州，730070，中国

摘要

隐睾症是一种常见的生殖障碍，会导致严重的睾丸损伤和男性不育。然而，高原牦牛隐睾症的潜在分子机制仍不明确。本研究探讨了由牦牛隐睾症引起的雄激素缺乏和莱迪希细胞铁死亡（ferroptosis）的发病机制，并阐明了相关的调控途径。从健康和隐睾牦牛中收集睾丸标本，分离并培养莱迪希细胞，结合组织病理染色、免疫荧光、Western blotting和ELISA技术检测氧化应激（OS）、铁死亡、雄激素合成及相关信号通路的标志物。结果表明，隐睾牦牛的睾丸组织形态受损，睾酮和二氢睾酮（DHT）水平降低，STAR、CYP11A1和雄激素受体（AR）的表达下调。隐睾症还加剧了睾丸的氧化应激，使Nrf-2/Keap-1通路失活，并通过破坏GPx4/FPN1/FTL轴诱导莱迪希细胞中的铁过载和铁死亡。体外实验验证了H₂O₂诱导的氧化应激通过抑制Nrf-2/Keap-1通路加速了莱迪希细胞的铁死亡，而NAC、Fer-1和DHT能有效缓解这种损伤，其中DHT通过激活AR发挥作用。本研究阐明了牦牛隐睾症导致氧化应激、抑制Nrf-2/Keap-1通路、引发莱迪希细胞铁死亡和雄激素分泌紊乱的机制，为牦牛隐睾症的预防和治疗提供了新的分子靶点。

引言

隐睾症的特点是睾丸未能通过腹股沟管正常下降至阴囊[1]。这种情况主要表现为睾丸发育不良、血睾屏障受损[2]和雄激素分泌异常[3]，因此对男性生殖功能有严重影响。

作为重要的性激素，雄激素在睾丸下降以及包括附睾、输精管、精囊和阴茎在内的生殖器官的发育、功能维持和生育能力保持中起着关键作用[3,4]。雄激素主要在莱迪希细胞中合成和代谢，类固醇生成急性调节蛋白（STAR）将胆固醇转运到线粒体内膜，随后由细胞色素P450家族11亚家族A成员1（CYP11A1）催化生成孕烯醇酮，经过复杂的生化修饰后最终转化为雄激素[5,6]。因此，莱迪希细胞的结构完整性和功能稳定性是保证正常雄激素合成的核心前提。

研究表明，小鼠单侧睾丸腹腔固定会导致隐睾症相关的氧化应激（OS），最终引发睾酮（T）分泌紊乱和血睾屏障损伤[2]。这些发现表明，隐睾症引起的氧化应激是睾丸损伤的关键介质。氧化应激定义为体内促氧化剂和抗氧化剂系统之间的失衡，活性氧（ROS）的过度积累是氧化应激的标志[7]。

氧化应激破坏了细胞内铁的稳态，导致铁离子过度积累；同时加剧了细胞内的氧化还原失衡，引起大量谷胱甘肽耗竭，并进一步促进脂质过氧化的启动。这一过程导致谷胱甘肽过氧化物酶4（GPX4）因辅因子丢失和氧化修饰而完全失活，使其丧失清除脂质过氧化物的核心功能。反过来，这又放大了脂质过氧化链反应，引发铁依赖性的程序性细胞死亡，即铁死亡。当细胞内发生大量且持续的铁死亡时，细胞功能全面崩溃，机体无法及时进行补偿性修复，最终导致局部或全身组织结构损伤、功能衰竭和严重的器官损伤[[8], [9], [10]]。

铁死亡的原因与细胞内铁的稳态密切相关，这依赖于铁的摄取、储存和排出之间的动态平衡。铁转运蛋白1（FPN1）是唯一负责将铁从细胞内转运到细胞外的膜转运蛋白，而由铁蛋白轻链（FTL）和铁蛋白重链组成的铁蛋白是主要的细胞内铁储存蛋白。相关研究证实，铁抑制剂Fer-1可通过上调GPX4和FPN1的表达、抑制FTL的表达以及减少细胞内铁过载来有效抑制铁死亡[2]。

在睾丸组织中，稳定的铁稳态是维持正常雄激素合成和精子发生的基础。铁过载或不足都会降低睾丸抗氧化酶的活性，引发氧化应激和脂质过氧化，降低血清睾酮浓度，最终导致男性生殖功能障碍[11]。因此，保持睾丸抗氧化能力和细胞内铁水平之间的动态平衡对于减轻铁死亡相关损伤和保护动物生殖健康具有重要意义。

本研究从健康和隐睾牦牛中收集睾丸样本，主要进行了莱迪希细胞的体外分离和培养。本研究旨在探讨睾丸雄激素紊乱的发病机制，并揭示隐睾症引起的莱迪希细胞铁死亡的分子机制。这将为牦牛隐睾症的靶向预防和治疗提供潜在的分子靶点。

章节摘录

动物和样本的收集

所有实验程序均获得了中国甘肃省兰州市甘肃农业大学兽医学院动物护理和使用委员会的批准。从青海省西宁市的一个屠宰场收集了7只正常牦牛（n = 7）和8只隐睾牦牛（n = 8）（4-5岁），收集睾丸组织并用4%中性甲醛固定，剩余组织储存在液氮中以备后续实验使用。

莱迪希细胞的分离、培养和处理

新鲜的正常牦牛睾丸组织

正常睾丸中的生精小管结构良好，基底膜光滑完整，上皮细胞中没有空泡或核破裂。塞尔托利细胞（Sertoli cells）分散在生精细胞中。莱迪希细胞具有典型的结构，细胞质丰富，分泌泡明显。而在隐睾睾丸中，生精小管萎缩，间质变宽，管腔面积减小，基底膜出现皱褶。

讨论

牦牛是一种生活在高原缺氧环境中的独特本土动物，它具有长期耐受高山缺氧环境的能力，自然放牧，生长和发育周期缓慢，有效地保持了其生理和发育的自然特征[[14], [15], [16]]。牦牛隐睾症的发病机制和病理损伤为深入研究男性生殖障碍提供了重要的理论支持。

作者贡献声明

曾建林：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原稿，方法学，资金获取，正式分析，数据管理，概念构思。袁立刚：撰写 – 审稿与编辑，可视化，项目管理，资金获取。齐玉梅：方法学。陈国娟：方法学。陈玉璐：数据管理。李海军：正式分析。宋亚金：数据管理。张彦龙：数据管理。

不适用。

所有实验程序均获得了甘肃农业大学兽医学院动物护理和使用委员会的批准（批准编号：GSAU-Eth-VMC-2024-007），并遵循了甘肃农业大学（中国兰州）的实验动物护理和使用指南。

数据可用性声明

数据包含在文章中。

资助

本研究得到了甘肃省自然科学基金（资助编号：23JRRA1420）、国家自然科学基金（资助编号：31160488）、甘肃农业大学动物临床实践项目（编号：GSAU-JSFW-2024-80）以及甘肃省研究生创新之星项目（编号：2025CXZX-771）的支持。

本手稿尚未在其他地方部分或全部发表，也未被其他期刊考虑。所有研究参与者均提供了知情同意，研究设计已获得相应的伦理审查委员会的批准。我们已阅读并理解了您的期刊政策，认为本手稿和研究均未违反任何规定。不存在需要声明的利益冲突。