黄芩素通过抑制过度的糖酵解作用，缓解反复超排卵引起的卵巢功能障碍和卵子损伤

《Theriogenology》：Baicalin alleviates repeated superovulation induced ovarian dysfunction and oocyte impairment by suppressing excessive glycolysis

　　

李林峰|沈浩|齐志敏|罗天|刘胜明|欧丽丽|徐长龙|刘宇

广西大学医学院，中国广西南宁市，530004

摘要

重复超排卵在畜牧业繁殖计划中被广泛使用，以提高排卵率和胚胎产量，但越来越多的证据表明，强烈的刺激可能会破坏卵巢的稳态并降低卵子的质量。本研究评估了黄芩素（一种生物活性黄酮类化合物）是否能够缓解由重复超排卵引起的卵巢功能障碍。雌性小鼠接受了四个周期的超排卵处理，其中一部分接受了黄芩素处理，另一部分未接受。记录了生理参数和繁殖结果。通过LC–MS和16S rRNA测序分析了卵巢和粪便的代谢组谱以及肠道微生物群组成。进行了组织学和分子分析，以评估卵巢形态、类固醇生成、AMPK/Foxo3a介导的糖酵解以及卵子质量。重复超排卵导致了卵泡闭锁、以过度糖酵解为特征的代谢紊乱、AMPK/Foxo3a信号通路抑制、肠道微生物群失调以及MII期卵子质量下降。黄芩素通过恢复代谢和信号通路稳态、改善微生物平衡以及保持卵子成熟和纺锤体完整性，显著缓解了这些变化。总体而言，这些发现为重复超排卵引起的卵巢功能障碍的代谢基础提供了新的见解，并表明黄芩素可能有助于在强烈卵巢刺激条件下保护卵巢功能和卵子质量，这对畜牧业繁殖计划中供体动物的可持续性具有潜在意义。

引言

多排卵和胚胎移植（MOET）是一种在畜牧业生产中广泛使用的繁殖技术。超排卵作为MOET的核心程序，是通过给予外源性促性腺激素来实现的。这种处理可以刺激单个发情周期内多个卵泡的同步发育和排卵。因此，从遗传上优越的供体雌性动物中获得的可移植胚胎数量增加，从而提高了繁殖产出和遗传传播的效果[1]。然而，人们越来越关注在重复超排卵方案下接受强烈繁殖管理的供体动物的长期可持续性。

先前的研究表明，重复超排卵会对卵巢造成累积性压力，导致不同哺乳动物物种的卵巢功能受损和卵子质量下降。在牛的研究中，发现接受重复超排卵的供体母牛的循环抗苗勒氏管激素（AMH）浓度显著降低，表明卵巢储备能力下降[2]。在小鼠模型中也得到了类似的结果，重复超排卵上调了与原始卵泡激活相关的基因，减少了卵巢储备，抑制了雌激素生物合成，并增加了闭锁卵泡的比例[3]。在卵子水平上，有研究报道超排卵后羊的卵子出现异常，重新刺激的猴子中获得的卵子数量也显著减少[4,5]。此外，小鼠模型研究表明，重复超排卵会导致细胞质碎片化、细胞器异常聚集、纺锤体损伤以及多能因子表达减少，最终影响受精和胚胎发育[6]。转录组分析进一步显示，经过五个周期超排卵的小鼠卵子的DNA甲基化水平整体降低，影响了基因表达，尤其是在与代谢和受精相关的途径中[7]。此外，机制研究还表明，重复超排卵会导致线粒体功能障碍、氧化应激失衡和DNA损伤，从而破坏卵巢的代谢稳态，增加对重复激素刺激的敏感性[8,9]。然而，大多数研究主要集中在描述重复超排卵的负面后果上，而有效的缓解这些有害影响的策略仍然有限。

黄芩素是从黄芩中提取的一种黄酮类化合物，由黄酮苷元和葡萄糖醛酸组成。由于含有酚羟基和羰基，黄芩素通过与生物大分子的相互作用表现出广泛的生物活性，包括调节氧化应激、代谢稳态和免疫炎症反应。在生殖生物学领域，黄芩素受到了越来越多的关注。在卵巢保护方面，动物研究表明，黄芩素可以增强环磷酰胺处理的小鼠卵巢中的超氧化物歧化酶和过氧化氢酶水平，减少促炎细胞因子的表达，并缓解氧化应激和炎症[10]。它还能抑制老年小鼠的颗粒细胞凋亡，同时提高类固醇生成能力[11]。关于卵子和胚胎质量，有报道指出黄芩素可以增加小鼠囊胚的线粒体膜电位，抑制凋亡，并提高耐热性[12]。在大型动物研究中，黄芩素通过减少活性氧种类、增加ATP含量和促进 cumulus 细胞扩张，提高了猪卵子的体外成熟率和随后的胚胎发育能力[13]。此外，黄芩素在脂多糖（LPS）诱导的流产模型中对蜕膜细胞具有保护作用，通过减轻炎症发挥作用，进一步的研究还发现它通过调节自噬和重新分布紧密连接蛋白来维持子宫内膜屏障功能[14]。这些发现引发了黄芩素是否也能缓解重复超排卵引起的卵巢功能障碍的问题，这成为了我们研究的重点。

在本研究中，我们评估了黄芩素对接受重复超排卵的小鼠卵巢功能的保护作用。结果表明，黄芩素增强了卵巢类固醇生成蛋白的表达并改善了卵子质量。代谢组和肠道微生物群分析进一步表明，黄芩素可以恢复由重复超排卵引起的微生物群失调和代谢紊乱。机制研究表明，重复超排卵通过激活AMPK/Foxo3a通路增强了糖酵解活性，而黄芩素有效抑制了这些变化。综合来看，这些发现突显了黄芩素在缓解与重复超排卵相关的卵巢功能障碍中的作用。

章节片段

化学试剂和抗体

黄芩素（CAS: 21967-41-9，纯度≥95%）购自Aladdin（中国上海）。妊娠马血清促性腺激素（PMSG）和人绒毛膜促性腺激素（hCG）由Sansheng（中国杭州）提供。M2培养基购自Sigma-Aldrich（美国密苏里州圣路易斯）。Alexa Fluor? 488标记的小鼠单克隆抗α-微管蛋白抗体（ab195887）购自Abcam（英国剑桥），DAPI购自Vector（美国加利福尼亚州纽瓦克）。针对BMP15（18982-1-AP）、STAR（12225-1-AP）、HK 2的抗体也来自这些公司

黄芩素对接受重复超排卵的小鼠体重、卵巢指数和发情周期的影响

连续28天内每三天监测一次小鼠的体重。R4组的体重增长速度明显快于对照组，而黄芩素处理组与对照组之间没有显著差异（图1A，详细数据见补充材料）。28天后，卵巢采集和比较显示R4组的卵巢重量显著增加，伴随

讨论

排卵诱导和超排卵在畜牧业繁殖计划中被广泛使用，以提高排卵率和胚胎产量，尤其是在用于胚胎移植的供体动物中。然而，越来越多的证据表明，重复超排卵会对卵巢造成累积性压力，导致氧化损伤、线粒体功能障碍和卵子质量下降，这可能最终影响胚胎的发育潜力。在本研究中，我们调查了

CRediT作者贡献声明

李林峰：项目管理、研究实施、数据管理。沈浩：项目管理、方法学。齐志敏：软件支持、数据管理。罗天：软件支持、方法学、数据管理。刘胜明：验证、软件支持、方法学。欧丽丽：软件支持、资源管理、方法学。徐长龙：写作——审稿与编辑、资金获取、概念构思。刘宇：写作——审稿与编辑、初稿撰写、监督、资金获取、正式分析，

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文报道工作的财务利益或个人关系。

致谢

本工作得到了南宁市科学研究和技术发展计划（编号20253037）的资助。