《Tissue and Cell》：Knockdown of METTL3 ameliorated myofibroblast activities in oral submucous fibrosis through upregulating DKK3
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Jing Peng|Sheng Guo|Peipei Zhang
长沙口腔医院新大新分院普通牙科部门，中国湖南省长沙市410000
摘要
背景
口腔黏膜下纤维化（OSF）是一种癌前疾病，其特征是颊黏膜成纤维细胞（BMF）向肌成纤维细胞的异常转化。Dickkopf相关蛋白3（D
Jing Peng|Sheng Guo|Peipei Zhang
长沙口腔医院新大新分院普通牙科部门，中国湖南省长沙市410000
摘要
背景
口腔黏膜下纤维化（OSF）是一种癌前疾病，其特征是颊黏膜成纤维细胞（BMF）向肌成纤维细胞的异常转化。Dickkopf相关蛋白3（DKK3）与纤维化有关，但其在OSF中的作用和调控机制仍不清楚。
方法
对临床OSF组织和正常组织进行了DKK3及m6A调控因子的表达分析。使用阿雷科尔碱（arecoline）处理的BMFs在体外模拟OSF。通过RT-qPCR、Western blot、免疫荧光染色和免疫组化技术检测mRNA和蛋白质的表达。分别使用CCK-8测定法检测细胞活力、迁移能力和侵袭性，使用伤口愈合测定法和Transwell测定法检测细胞迁移能力。采用Dot blot测定法检测整体m6A水平。通过RIP测定法分析METTL3/YTHDF2与DKK3之间的相互作用。通过Me-RIP测定法分析DKK3 mRNA上的m6A修饰。
结果
在OSF组织和经阿雷科尔碱处理的BMFs中，DKK3表达下调。DKK3过表达抑制了阿雷科尔碱诱导的BMF向肌成纤维细胞的转化。METTL3介导的m6A修饰通过招募YTHDF2来沉默DKK3，从而降解DKK3 mRNA。正如预期的那样，敲低METTL3可以恢复DKK3的表达并抑制肌成纤维细胞的活性，而这种效应可以通过共沉默DKK3来逆转。
结论
METTL3-m6A-YTHDF2轴通过抑制DKK3促进BMF向肌成纤维细胞的转化，从而驱动OSF的进展。我们的研究为开发针对OSF的新治疗策略提供了研究基础。
引言
口腔黏膜下纤维化（OSF）是一种潜在的恶性疾病，其特征是口腔黏膜的异常细胞外基质沉积和进行性纤维化，最终导致口部肌肉痉挛和口腔功能受损（Gayathri等人，2023年）。OSF是一种癌前疾病，其恶性转化率为1.5-15%，由于可能进展为口腔癌，因此存在显著的死亡风险（Wang等人，2014年）。然而，尽管最近取得了进展，但目前尚无批准的针对OSF的靶向抗纤维化策略（Tang等人，2025年），这可能是由于对驱动纤维化发生和进展的机制了解不完全。OSF进展的一个标志是颊黏膜成纤维细胞（BMFs）的激活以及肌成纤维细胞的病理转化，这些细胞表现出增强的胶原收缩、迁移和侵袭能力（Lin等人，2019年）。虽然TGF-β/Smad信号通路是驱动这一过程的关键分子机制，但调控BMFs向肌成纤维细胞转化的精确表观遗传和转录后分子机制仍不清楚，这限制了针对这种癌前疾病的有效治疗策略的开发。
Dickkopf相关蛋白3（DKK3）是DKK家族的关键成员，在组织纤维化中起着矛盾的作用（Fang等人，2020年）。据报道，在肾纤维化小鼠模型中，DKK3缺乏可以减轻肾小管萎缩和间质基质沉积（Federico等人，2016年）。此外，在异常内皮分泌组中，DKK3可触发肾成纤维细胞的激活和内皮-间充质转化（Lipphardt等人，2019年）。然而，也有研究表明，在血管紧张素灌注的动物模型中，DKK3可以减轻心脏肥大和纤维化（Zhai等人，2018年）。这种组织特异性的二分性突显了进一步研究DKK3在纤维化疾病中调控机制的必要性。值得注意的是，先前的一项研究表明，DKK3的表达从OSF早期阶段到晚期阶段逐渐降低，这与上皮萎缩的加重相关（Al-Dhohorah等人，2016年）。尽管取得了这些进展，DKK3在OSF发病机制中的功能意义仍不清楚，特别是在调控成纤维细胞激活中的作用。
N6-甲基腺苷（m6A）RNA甲基化是哺乳动物mRNA上最丰富的修饰类型，在调控纤维化疾病的发展中起着关键作用（Zhuang等人，2024年；Wang等人，2024年）。m6A由甲基转移酶催化，由去甲基酶去除，并被读取蛋白识别（Sun等人，2022年）。甲基转移酶样3（METTL3）是一种在纤维化疾病中起关键作用的甲基转移酶。例如，METTL3上调促进了视网膜下纤维化和上皮-间充质转化（Wang等人，2023年）。此外，靶向抑制METTL3显著抑制了肾纤维化中的纤维化标志物表达（Jung等人，2024年，无论是体内还是体外）。重要的是，OSF组织中的m6A水平和METTL3表达显著升高（Li等人，2022年）。在当前的研究中，我们的基于SRAMP的生物信息学分析预测了DKK3 mRNA转录本中的多个保守m6A基序。因此，建议METTL3介导的m6A修饰可能在表观遗传水平上抑制OSF中的DKK3表达，这值得进一步研究。
基于上述证据，我们假设METTL3依赖的m6A甲基化可以沉默DKK3表达，从而促进肌成纤维细胞的激活和OSF的进展。我们的研究为OSF的表观遗传调控提供了新的见解，并确定了METTL3/DKK3轴作为一个有前景的治疗靶点。
章节摘录
临床样本收集
从长沙口腔医院的16名OSF患者（经组织病理学确认）和16名健康对照组（接受常规牙科手术）处获取了人类口腔黏膜组织。所有程序均符合赫尔辛基宣言，并得到了长沙口腔医院伦理委员会的批准。组织立即在液氮中快速冷冻以提取RNA，或用4%福尔马林固定用于免疫组化（IHC）。
OSF中的DKK3表达较低
从OSF患者和健康对照组中获取了人类口腔黏膜组织，观察到OSF患者的口腔黏膜组织中的DKK3表达显著降低（图1A-B）。用阿雷科尔碱处理BMFs以建立OSF细胞模型。与临床观察结果一致，经阿雷科尔碱处理的BMFs在mRNA和蛋白质水平上均表现出DKK3表达下调（图1C-D）。这些发现共同表明DKK3...
讨论
OSF是一种潜在的恶性疾病，其特征是进行性纤维化和细胞外基质沉积，通常由咀嚼槟榔引起（Gupta和Jawanda，2021年）。OSF被广泛认为是口腔潜在恶性疾病的前兆。先前的研究表明，OSF通常在初次诊断后的3-16年内进展为口腔鳞状细胞癌（Pindborg等人，1984年；Jeng等人，2001年）。不幸的是，目前尚无有效的OSF治疗方法...
CRediT作者贡献声明
Peipei Zhang：撰写 – 审稿与编辑、监督、研究。Jing Peng：撰写 – 审稿与编辑、初稿撰写、资源提供、方法学设计、概念构思。Sheng Guo：撰写 – 审稿与编辑、初稿撰写、资源提供、方法学设计、概念构思。
患者同意书
已从所有参与研究的个体那里获得知情同意，允许使用他们的组织用于研究目的。
伦理批准
这项涉及人类参与者的研究遵循世界医学协会的赫尔辛基宣言的伦理原则。研究方案已由长沙口腔医院的适当伦理委员会审查并批准。（批准参考编号：（2025-Ethics ?172）
所有程序均符合相关法律法规和机构指南。
