静脉注射核桃叶提取物可减轻氧化应激，改善饲料限制条件下肥胖尾羊的胰岛素敏感性和脂肪组织代谢

《Veterinary and Animal Science》：Intravenous administration of walnut leaf extract attenuates oxidative stress and improves insulin sensitivity and adipose tissue metabolism in feed-restricted fat-tailed ewes

　　玛丽亚姆·萨赫比-阿拉 | 哈梅德·哈利勒万迪-贝赫鲁齐亚尔 | 拉苏尔·皮尔莫哈马迪 | 埃赫桑·阿纳索里 | 莫尔特扎·侯赛尼-加法里
伊朗乌尔米亚大学动物科学系

**摘要**
植物产生多种次生代谢物，如多酚化合物，尤其是黄酮类物质，这些物质具有抗氧化、抗炎和免疫调节作用，能够改善牲畜的健康和生产力。然而，在反刍动物中，这些化合物的生物利用度和效果常常受到瘤胃微生物降解的限制。本研究评估了通过静脉注射核桃叶提取物（WLE）对受饲料限制的Makui母羊的氧化状态、代谢参数和胰岛素信号传导的影响。选取12只健康、非妊娠、非哺乳期的母羊，采用拉丁方设计，分别给予生理盐水（对照组）或50、75、100毫克/千克体重的WLE，每个处理周期持续10天，并设有20天的洗脱期，以诱导负能量平衡状态。测量了血浆中的葡萄糖、胰岛素、非酯化脂肪酸（NEFA）和丙二醛（MDA）浓度，并分析了胰岛素受体（INSR）、葡萄糖转运蛋白4（GLUT4）和过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）等代谢和炎症相关基因的表达。结果显示，特别是在100毫克/千克剂量下，WLE显著降低了MDA和NEFA水平，提高了胰岛素敏感性，并上调了INSR和GLUT4的表达。组织学分析表明，处理组中的脂肪细胞数量减少且细胞体积增大。这些发现表明，静脉注射WLE可以减轻氧化应激并改善负能量平衡期间的代谢功能，支持其作为植物源干预措施来增强反刍动物代谢健康的潜力。

**1. 引言**
植物合成多种次生代谢物，对动物具有多种生理作用（Wink, 2010; Fraenkel, 1959）。其中，多酚化合物，尤其是黄酮类物质，因其显著的抗氧化、抗炎和免疫调节作用而受到关注，这些作用可以改善牲畜的健康和生产力（Jomova et al., 2024; Messinese et al., 2024）。在反刍动物营养学中，富含多酚的植物提取物被视为有前景的天然饲料添加剂，不仅因为它们能够缓解氧化应激和代谢紊乱，还因为其环境可持续性和成本效益（Chandni Ahmad et al., 2024）。然而，尽管有大量证据表明多酚对单胃动物有益，但由于反刍动物独特的消化生理特性和广泛的预吸收代谢过程，其在反刍动物中的效果仍不明确（Scalbert et al., 2005; Manach et al., 2004; Vasta & Luciano, 2011）。一个主要限制因素是瘤胃内多酚的广泛微生物生物转化，这可能导致这些化合物在吸收前被修饰或降解，从而降低其生物利用度并可能低估其系统效应（Vasta & Luciano, 2011）。静脉注射（IV）提供了一种绕过瘤胃代谢的策略，可以直接评估这些植物化学物质的生理影响（Bionaz et al., 2015; Van Soest, 1994）。尽管如此，关于静脉注射多酚在反刍动物中的代谢、内分泌和分子反应的研究很少，其安全性和效果也尚未得到充分研究（Vasta & Luciano, 2011）。研究表明，黄酮类物质可以调节单胃和反刍动物的代谢途径，包括与胰岛素敏感性、脂质代谢和氧化平衡相关的过程（Hanhineva et al., 2010; Williamson, 2017; Gessner et al., 2017）。实验证据表明，黄酮类补充剂可以增强抗氧化酶活性，减轻脂质过氧化，并在代谢应激期间支持葡萄糖-胰岛素稳态（Hassanpour & Doroudi, 2023）。核桃（Juglans regia L.）的叶子富含黄酮类物质，如槲皮素、山柰酚和鞣花酸，以及酚酸，具有很强的抗氧化能力（Cordova et al., 2025）。核桃叶提取物（WLE）在细胞培养和啮齿动物模型中显示出对氧化平衡、葡萄糖调节和脂质代谢的有益作用（Mirzababaei et al., 2022; Popescu et al., 2020）。在反刍动物中，虽然有报道称喂食核桃叶可以改善羔羊的抗氧化状态（Kazemi & Mokhtarpour, 2021），但静脉注射WLE的系统效应尚未得到研究。氧化应激和慢性炎症是负能量平衡（NEB）期间导致胰岛素抵抗的关键机制，这是反刍动物常见的代谢挑战，会促进脂肪分解，增加循环中的非酯化脂肪酸（NEFA）并影响葡萄糖利用（Qiao et al., 2024）。因此，确定有效的干预措施以缓解NEB引起的代谢紊乱具有重要的实际意义。为了填补这一空白，本研究采用了Makui脂尾母羊的饲料限制模型来模拟NEB，并研究标准化静脉注射WLE对氧化状态、代谢参数以及与胰岛素相关通路、脂质调节过程和炎症反应相关基因转录活性的剂量依赖性影响。我们假设静脉注射WLE可以减轻氧化应激，提高胰岛素敏感性，并调节关键的能量代谢调节因子。这项工作首次直接证明了WLE在羊体内的代谢和分子效果，并突显了其作为植物源干预措施在反刍动物健康管理中的潜力。

**2. 材料与方法**
**2.1. 动物、饲养环境和条件**
本研究于2023年10月至12月在伊朗乌尔米亚大学的实验农场进行，所有实验程序和动物管理均在此完成。从乌尔米亚大学实验农场选取12只健康、多产、非妊娠、非哺乳期的Makui母羊（Ovis aries），平均体重为60.0 ± 1.2千克，体况评分（BCS）为2.5 ± 0.25。所有母羊均经过兽医检查，确保无布鲁氏菌病和内部寄生虫，并接受了标准的驱虫处理（伊维菌素，0.2毫克/千克皮下注射）。母羊单独饲养在面积为2米×1.5米的围栏中，配备橡胶地面、单独的喂食槽和自动饮水器。环境参数（温度18–22°C、相对湿度50–60%和通风率）使用HOBO?数据记录仪（Onset Computer Corp., Bourne, MA, USA）进行连续监测。照明采用自然日光和人工照明相结合的方式，确保整个研究期间保持12:12的光暗周期。

在试验期间，非妊娠和非哺乳期的母羊被给予饲料限制处理，提供的能量约为其估计可代谢能量（ME）需求的50%，以诱导饥饿并刺激脂肪分解。每只母羊每天在8:00和16:00各接受0.25千克干物质（DM）的苜蓿干草，确保在每个喂食期间全部消耗。实验室分析显示，该干草含有约15.0%的粗蛋白、1.78 Mcal/千克DM的可代谢能量和约50%的中性洗涤纤维（NDF）。这种限制性喂食方案旨在提供大约一半的维持能量需求，从而促进明显的负能量平衡（NEB）。在整个研究期间，提供新鲜饮用水、盐块和商业维生素-矿物质预混剂（每只母羊80克，包含维生素A、D3、E以及锌（Zn）、铜（Cu）、锰（Mn）和硒（Se）等矿物质，详见表1）。

**表1. 洗脱期间使用的基礎混合日粮的成分和化学组成**
| 成分（% DM） | 苜蓿干草 | 玉米青贮 | 大麦粒 | 小麦麸 | 大豆粕 | 二钙磷酸盐 | 矿物质-维生素补充剂 | 脂肪补充剂（钙盐） |
| --- | --- | --- | --- | --- | --- | --- | --- |
| | 25.6 | 35.2 | 15.7 | 9.09 | 10.1 | 0.50 | 11.00 | 22.80 |
| 营养素和能量 | 可代谢能量（Mcal/Kg DM） | 2.53 | 粗蛋白（% DM） | 15.0 | 乙醚提取物（% DM） | 5.30 | 中性洗涤纤维（% DM） | 43.1 |
| 灰分（% DM） | 6.50 | 钙（% DM） | 0.85 | 磷（% DM） | 0.48 | 脂肪酸谱（% FA） | C16:0 | 13.25 |
| C16:1 | 1.34 | C18:0 | 8.11 | C18:1 | 37.06 | C18:2 | 30.36 | C18:3 | 5.71 |
| 矿物质-维生素补充剂 = 每千克矿物质和维生素补充剂包含500,000国际单位的维生素A、100,000国际单位的维生素D、0.1毫克的维生素E、180克的钙、90克的磷、20克的镁、2克的锰、3克的铁、3克的铜、0.3克的锌、0.1克的钴、0.1克的碘、0.001克的硒、3克的抗氧化剂。 | | | | | |

**2.2. 血液采样和生化检测**
在每个试验期的第2天，在无菌条件下（使用2%利多卡因HCl，5毫升皮下注射）插入颈静脉导管（14号，BD Insyte?，USA），并进行局部麻醉。插入部位用70%乙醇和含碘的消毒溶液清洁。手术操作遵循无菌技术，导管用3-0号丝线固定。术后给予氟尼辛美格鲁明（2.2毫克/千克，皮下注射）进行疼痛管理，并在术后48小时内监测动物是否有感染迹象。导管每天用50 IU/mL肝素化生理盐水冲洗以保持通畅并防止血栓形成，并每天检查通畅性。

每天在两个时间点（喂食前07:30和喂食后4:30）采集10毫升血液样本，样本置于锂肝素化试管中。样本立即放入冰袋中以减少降解，然后在4°C下使用Thermo Scientific冷冻离心机以2000 × g离心15分钟。血浆样本分配到预先标记的微离心管中，并保存在-80°C直至进一步分析。样本最多保存6个月，在分析前解冻一次以防止反复冷冻和解冻造成的降解。血浆在采集后2小时内进行处理，以避免代谢物浓度变化。通过测定血浆氧化应激生物标志物和抗氧化酶活性来评估系统氧化状态。丙二醛（MDA）作为脂质过氧化的指标，使用Ohkawa等人（1979）描述的方法通过硫代巴比妥酸反应物质（TBARS）测定法进行定量。血浆样本与硫代巴比妥酸（TBA）、三氯乙酸和十二烷基硫酸钠混合后，在沸水浴中加热形成MDA-TBA加合物。冷却并离心后，使用自动微孔板读数仪（BioTek Instruments, USA）在532 nm处测量上清液的吸光度。MDA浓度根据使用1,1,3,3-四乙氧基丙烷制备的标准曲线计算，以nmol/mL血浆表示。总抗氧化能力（TAC）根据Whitehead等人（1992）的方法使用增强化学发光法测定，评估血浆对抗活性氧的累积抗氧化能力。结果以每升血浆的mmol Trolox当量表示。抗氧化酶超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）的活性是使用市售的分光光度测定试剂盒（Cayman Chemical Company，美国密歇根州安娜堡）按照制造商的说明和先前验证的方法来确定的。SOD的测定基于四唑盐在超氧化物诱导下的还原反应（Aebi，1984），而GSH-Px的活性则是通过与谷胱甘肽还原酶的耦合反应来测量的，在此过程中监测NADPH在340纳米处的氧化速率（Paglia & Valentine，1967）。

2.3. 静脉葡萄糖耐量试验（ivGTT）和胰岛素耐量试验（ivITT）
在实验期的最后几天（第9天和第10天）进行了静脉葡萄糖耐量试验（ivGTT）和胰岛素耐量试验（ivITT），以最大化提取物的摄入时间，并允许动物有足够的时间完全适应饮食和实验条件。在每个时期结束时进行这些试验（而不是开始时）可以最小化由饮食变化引起的短暂和短期效应，确保获得的结果更准确地反映动物对处理的真实生理反应。实验前，母羊需禁食过夜12小时，并且可以自由饮水以标准化基线代谢条件。对于ivGTT，动物通过颈静脉导管快速注射0.25克/千克体重的50%无菌葡萄糖溶液（Glucojet?，Zoopha，Parnian Pars，伊朗）。对于ivITT，还通过静脉注射0.1 IU/千克体重的胰岛素（Lansulin R?，EXIR Pharmaceutical Co.，伊朗德黑兰）30秒内完成。注射量根据试验前24小时测量的体重精确计算。每次试验后，在固定时间点收集系列血液样本（每个样本约5毫升）：注射前-15分钟、-5分钟（基线）、注射后0分钟以及注射后5分钟、10分钟、15分钟、20分钟、30分钟、40分钟、50分钟、60分钟、90分钟、120分钟、150分钟和180分钟。样本通过颈静脉内的导管收集到肝素化管中，并立即置于冰上。通过定期用肝素化盐水（50 IU/mL）冲洗来保持导管的通畅。每次收集后，通过静脉补充等量的无菌盐水以防止血液动力学效应。血浆通过离心（4°C下2000 × g离心15分钟）立即分离，并在-80°C下储存，以便后续使用先前描述的验证过的酶学和免疫学方法进行葡萄糖和胰岛素的生化分析。从ivGTT和ivITT数据集中得出的动态代谢参数包括浓度-时间曲线下面积（AUC）、峰值血浆浓度（Cmax）、葡萄糖消失率（K_glucose）、胰岛素清除率（K_insulin）以及葡萄糖（T?_glucose）和胰岛素（T?_insulin）的半衰期。这些参数是使用GraphPad Prism软件（版本9.4，GraphPad Software，美国加利福尼亚州圣地亚哥）通过单相指数衰减模型和梯形积分计算得出的。

2.4. 组织取样和组织学分析
在每个实验期结束时，即处理后第10天（包括对照组和静脉注射核桃提取物剂量为50、75和100 mg/kg），从母羊的尾部和腰部皮下脂肪区域收集脂肪组织样本。取样前，先剃除取样部位并用70%乙醇消毒以减少污染。在局部麻醉下使用无菌手术剪刀和镊子切除大约1立方厘米的脂肪组织，以尽量减少动物的不适。样本立即用冷磷酸盐缓冲盐水（PBS）冲洗以去除血液和碎片，然后在室温下用10%中性缓冲福尔马林固定24-48小时以保持组织结构。固定后，按照标准组织学程序处理样本：用二甲苯脱蜡，通过分级乙醇系列（70%、80%、95%和100%）脱水，用二甲苯澄清，最后嵌入石蜡中。使用旋转切片机从石蜡块中切割出5微米厚的连续切片。切片固定在涂有聚-L-赖氨酸的玻璃载玻片上，然后用苏木精和伊红（H&E）染色进行形态学评估。使用光学显微镜在40倍和100倍放大倍数下进行显微镜检查。每个切片至少评估5个视野，以确保分析的代表性。使用连接到显微镜上的校准相机系统捕获数字图像，以便进行形态计量和定性比较。所有程序均遵循动物实验的伦理指南，并设计为确保脂肪组织形态学评估的可重复性和准确性。

2.5. RNA提取和定量实时PCR（qRT-PCR）分析
在每个实验期的第10天，在局部麻醉下（2%盐酸利多卡因，3毫升，皮下注射）从尾部区域和脂肪尾部使用无菌6毫米活检针头（Miltex?，美国宾夕法尼亚州约克）采集大约40毫克的皮下脂肪组织。取样后立即将组织迅速浸入液氮中（1分钟内）以保持RNA的完整性，随后在-80°C下储存直至分析。按照制造商的协议使用Trizol试剂（Dena Zist Asia，伊朗马什哈德）从脂肪组织中提取总RNA。使用NanoDrop 2000分光光度计（Thermo Fisher Scientific，美国马萨诸塞州沃尔瑟姆）定量RNA的质量和纯度，确保A260/A280吸光度比在1.8到2.0之间，表明RNA纯度高。通过电泳在2%琼脂糖凝胶上染色（0.5 μg/mL的溴化乙锭）确认RNA的完整性和无基因组DNA污染。从每个样本中提取1微克纯化的总RNA，使用PrimeScript? RT Master Mix（Biofact?，韩国大田市）合成互补DNA（cDNA），按照制造商的说明进行操作（37°C孵育15分钟，然后在85°C下灭活5秒）。合成的cDNA在-20°C下储存直至进一步分析。定量实时PCR分析使用SYBR? Premix Ex Taq? II（Takara Bio Inc.，日本）和StepOnePlus Real-Time PCR System（Applied Biosystems，美国加利福尼亚州福斯特城）进行。反应混合物（总体积20 μL）包含10 μL SYBR Premix、各0.8 μL的正向和反向引物（10 μM）、2 μL cDNA模板和6.4 μL无核酸酶的水。PCR扩增在以下循环条件下进行：初始变性95°C 120秒，然后是40个循环，每个循环95°C 15秒（变性）和60°C 30秒（退火/延伸）。扩增后立即进行熔解曲线分析（温度范围60–95°C）以检查PCR产物的特异性。

针对编码葡萄糖转运蛋白4（GLUT4）、激素敏感脂肪酶（HSL）、白细胞介素-6（IL-6）、胰岛素受体（INSR）、过氧化物酶体增殖激活受体γ（PPARγ）、 perilipin（PLIN）和肿瘤坏死因子-α（TNF-α）的基因，使用Primer3Plus软件（www.bioinformatics.nl/cgi-bin/primer3plus/primer3plus.cgi）设计特异性引物，并由Invitrogen（美国）合成。引物的特异性通过BLAST与NCBI基因组数据库（GenBank）比对确认。通过使用混合cDNA的系列稀释进行标准曲线分析，PCR效率在90%到110%之间。所有实验均重复三次，每次实验包括非模板对照（NTC）以监测污染。目标基因的表达水平根据qBASEplus软件（版本3.1；Biogazelle，比利时根特）的geNormPLUS算法标准化到三个最稳定的参考基因（GAPDH、RPL19和SDHA）。然后使用标准化的表达数据进行统计分析。

表2. 用于实时PCR分析的引物序列。
基因
Accession no.
Forward
Reverse
Amplicon size (bp)
PPARγ
NM_001100921.1
ACGGGAAAGACGACAGACAAAAAACTGACACCCCTGGAAGATG
150
INSR
XM_069578387.1
CAGCCTTCACACCGATGATGGTTTGTCCAGAGCTTGCCAT
292
GLUT4
AB005283.1
GCTTCCAACAGATCGGCTCTGACCCCAATGTTGTAGCCA
133
HSL
XM_069550865
CACAAAGGCTGCTTCTACGGCTCGTTGCGTTTGTAGTGCT
120
Perilipin
XM_069576641
TGTCCTCGGCTTACATCAGTACAGGCATAGGTATTGGCAAC
167
TNF-α
NM_001024860.1
CTCAAGCCTCAAATAACAAGCCTGAAGAGGACCTGCGAGTAG
180
IL-6
NM_001009392.1
GACACCACCCCAAGCAGACTATGCCAGTGTCTCCTTGCTGTT
144
GPDHD
Q152956.1
ACTGCTATGTGGGGGATGAGACATGGCAGGTGTGTTGAAA
163
RPL19
XM_012186026.2
AGCCTGTGACTGTCCATTCCACGTTACCTTCTCGGGCATT
126
SDHAXM_012097183.2
CATCCACTACATGACGGAGCAATCTTGCCATCTTCAGTTCTGCTA
90

PPARγ，过氧化物酶体增殖激活受体γ；INSR，胰岛素受体；GLUT4，葡萄糖转运蛋白4型；HSL，激素敏感脂肪酶；Perilipin；TNF-α，肿瘤坏死因子α；IL-6，白细胞介素-6；GAPDH，3-磷酸甘油醛脱氢酶；RPL19，核糖体蛋白L19；SDHA，琥珀酸脱氢酶复合体黄素蛋白亚单位。

2.6. 统计分析
选择N = 12只母羊的样本量，分配到三个重复的4 × 4拉丁方格中，以提供足够的统计功效。根据拉丁方格设计的资源方程方法，这种配置产生的残差误差自由度E = 30，超过了可靠检测中等至较大生理效应大小所需的推荐最小阈值（10 ≤ E ≤ 20），同时适当考虑了背景方差。由于处理是在四个时期中依次随机分配给动物的，因此将每只母羊与每个时期的组合视为评估处理效应的实验单元，而嵌套在方格内的母羊作为随机受试者效应，以考虑个体基线变异。所有统计分析均使用SAS中的线性混合效应模型（PROC MIXED，SAS版本9.4；SAS Institute Inc.，北卡罗来纳州卡里）进行。在拟合模型之前，依次评估了分析的假设。使用Shapiro–Wilk检验（PROC UNIVARIATE，SAS）结合分位数-分位数（Q–Q）图形的视觉检查来评估残差的正态性。使用Levene检验检查处理组间的方差同质性。对于违反正态性假设的变量，在分析前应用了以10为底的对数转换。转换后，重新评估正态性和方差同质性，以确认转换后的数据满足统计模型的假设。对于在每个实验期间仅测量一次的变量（例如，基因表达和脂肪库测量），使用以下混合效应模型：
Yijkl=μ+Si+Pk+Tl+Aj(i)+εijkl
其中Yijkl是观察到的响应，μ是第i个方格的总体均值，Si是第i个方格的固定效应（i = 1, 2, 3），Pk是第k个时期的固定效应（k = 1, 2, 3, 4），Tl是第l个实验处理的固定效应（Control, WLE50, WLE75, WLE100），Aj(i)是嵌套在第i个方格内的第j只母羊的随机效应，εijkl是随机残差。

对于在单个时期内多次测量的变量（例如，血浆葡萄糖、胰岛素和对ivITT及ivGTT的NEFA响应），使用重复测量混合模型进行分析：
Yijklm=μ+Si+Pk+Tl+Γm+(T×Γ)lm+Aj(i)+εijklm
其中Γm表示第m个采样时间的固定效应，(T × Γ)lm表示处理与时间之间的固定交互效应。嵌套在方格内的母羊[Aj(i)]在REPEATED语句中被指定为受试者，以考虑动物内的重复观察。评估了几种候选的方差-协方差结构，包括自回归1阶[AR(1)]、复合对称性和Toeplitz。选择AR(1)协方差结构是因为它基于最低的贝叶斯信息准则（BIC）提供了最佳的模型拟合。由于实验期之间的20天清洗间隔旨在消除潜在的携带效应，因此模型中不包括处理×时期的交互作用。统计显著性在P ≤ 0.05时宣布，当0.05 < P < 0.10时讨论统计趋势。

3. 结果
3.1. 动物状态
静脉注射WLE对饲料限制的母羊的体重（BW）和体况评分（BCS）有显著影响（表3）。接受WLE100处理的母羊与对照组、WLE50组和WLE75组相比，体重变化显著较低（P < 0.05）。此外，WLE100组的平均每日体重减轻明显低于对照组（0.235 kg/d）和WLE50组（0.422 kg/d；P < 0.01）、WLE75组（0.385 kg/d；P < 0.01）。关于BCS，对照组、WLE50组和WLE75组的BCS从2.50下降到2.25（P < 0.05），而WLE100组保持其初始BCS（2.50；P < 0.05）。
表3. 不同剂量核桃叶提取物（WLE）静脉注射对饲料限制的母羊的体重（BW）变化、体况评分（BCS）和平均每日体重减轻的影响。数据以每个处理组的最小二乘均值表示。
变量
Treatment
1
Empty Cell
P-value
CON
WLE50
WLE75
WLE100
SEM
Treatment
Period
Linear
Quadratic
Initial BW (kg)
61.57
60.94
61.64
61.72
0.60
0.78
0.82
0.67
0.56
0.03
0.77
0.01
0.00
0.19
0.00
0.235
a
3.84
a
4.39
a
2.37
b
0.49
0.03
0.01
0.00
0.19
0.00
0.25
b
2.25
b
2.25
b
2.50
a
0.10
0.04
0.00
0.25
0.01
0.00
0.77
0.00
Average daily weight loss (kg/d)
0.422
a
0.385
a
0.439
a
0.235
b
0.03
0.01
0.00
0.18
0.00
0.20
0.37
CON = 对照组；WLE50, WLE75和WLE100 = 每千克体重50、75和100毫克WLE。
BW：体重；BCS：体况评分。
Period = 拉丁方格设计中的实验时期（0–10天）的效果。
SEM = 均值的标准误差。
值以最小二乘均值表示。在同一行中，具有不同小写字母（a–c）的均值根据Tukey–Kramer事后检验在不同处理间显著不同（P ≤ 0.05）。
1
WLE剂量表示每千克体重的核桃叶提取物（BW）毫克数。血液中的代谢物和抗氧化酶因子
表4显示了不同剂量核桃叶提取物（WLE）通过静脉注射对母羊血液生化参数的影响，这些影响发生在早晨喂食前以及喂食后4小时。与对照组相比，WLE100组的胆固醇水平在喂食前（54.3 mg/dL vs 61.5 mg/dL；P < 0.01）和喂食后（56.2 mg/dL vs 64.4 mg/dL；P < 0.01）均显著降低。观察到强烈的线性趋势（P < 0.001）和二次趋势（P < 0.01），并且治疗与时间之间存在显著交互作用（喂食前P = 0.01，喂食后P = 0.03）。WLE处理的母羊在喂食前（WLE75：23.1 mg/dL vs 对照组：25.3 mg/dL；P < 0.01）和喂食后（WLE100：26.3 mg/dL vs 对照组：28.9 mg/dL；P < 0.01）的血清甘油三酯（TG）浓度显著降低，同时治疗与时间也存在显著交互作用（P < 0.01）。喂食前后血液尿素浓度均显著下降（P = 0.04），WLE100组在两个时间点的尿素浓度均最低（分别为20.9 mg/dL和25.8 mg/dL），而对照组为24.1 mg/dL和26.2 mg/dL）。血清肌酐和总蛋白浓度在喂食前后均未受到WLE处理的影响（P > 0.05），也未观察到治疗与时间之间的显著交互作用（P > 0.70）。在8天的输注期间，喂食前的血糖浓度没有显示出治疗与时间之间的显著差异（P > 0.57）（图2A）。实验期间血浆葡萄糖浓度呈下降趋势。喂食后，血浆葡萄糖水平高于喂食前，其中WLE100组的葡萄糖浓度最低（图2A和a）。

表4. 不同剂量核桃叶提取物（WLE）静脉注射对母羊喂食前及喂食后4小时血液生化参数的影响。数据以各处理组的均方根均值表示。

变量 | 处理 | P值 |
|-------|------|------|
| 蛋白质（mg/dL） | 4.03 | 53.99 | 54.10 | 3.96 | 50.08 | 30.48 | 0.14 | 90.35 | 0.53 | 0.29 | 0.05 |
| 胆固醇（mg/dL） | 61.58 | 60.79 | 56.80 | 54.34 | 0.35 | 40.01 | 0.001 | 0.53 | 0.95 | 0.001 | 0.003 |
| TG（mg/dL） | 25.26 | 25.52 | 23.19 | 22.95 | 0.12 | 0.001 | 0.001 | 0.24 | 0.87 | 0.001 | 0.04 |
| 尿素（mg/dL） | 24.10 | 24.20 | 22.80 | 20.96 | 0.18 | 0.03 | 0.005 | 0.40 | 0.70 | 0.001 | 0.177 |
| 总蛋白（g/dL） | 8.60 | 8.80 | 8.75 | 8.85 | 0.10 | 0.84 | 0.76 | 0.10 | 0.65 | 0.23 | 0.177 |
| 肌酐（μmol/L） | 73.20 | 72.75 | 71.90 | 71.75 | 0.24 | 0.75 | 0.74 | 0.73 | 0.60 | 0.40 | 0.65 |
| 喂食后4小时 | 4.14 | 4.09 | 4.17 | 4.03 | 0.19 | 0.72 | 0.23 | 0.38 | 0.82 | 0.60 | 0.04 |
| 胆固醇（mg/dL） | 64.48 | 62.53 | 58.09 | 56.23 | 1.73 | 0.01 | <0.01 | 0.23 | 0.89 | <0.01 | 0.003 |
| TG（mg/dL） | 28.98 | 28.18 | 28.31 | 27.35 | 0.43 | 0.07 | <0.01 | 0.064 | 0.49 | <0.01 | 0.29 |
| 尿素（mg/dL） | 26.24 | 26.26 | 26.01 | 25.82 | 0.57 | 0.94 | 0.01 | 0.35 | 0.62 | 0.001 | 0.238 |
| 总蛋白（g/dL） | 9.55 | 9.75 | 9.73 | 9.81 | 0.21 | 0.84 | 0.76 | 0.11 | 0.65 | 0.55 | 0.65 |
| 肌酐（μmol/L） | 74.45 | 73.90 | 73.32 | 72.84 | 1.10 | 0.75 | 0.74 | 0.73 | 0.60 | 0.40 |

图2. 补充核桃叶提取物（WLE）的母羊在喂食前（A、B、C）及喂食后4小时（a、b、c）的血浆葡萄糖、胰岛素和非酯化脂肪酸（NEFA）浓度。数据为均值±标准误差（SEM）。各图中显示了处理、时间的主效应及其交互作用。喂食前血清胰岛素浓度和处理与时间的交互作用均显著（P < 0.04、0.01），但喂食后两者交互作用不显著（P > 0.99、0.97）。WLE100组的胰岛素浓度始终高于其他组，表明存在剂量依赖性反应。WLE输注导致NEFA浓度降低（图2C和c）。喂食前，处理、时间和处理与时间的交互作用均显著（P < 0.001），表明WLE——尤其是100 mg/kg剂量——抑制了与饲料限制相关的NEFA升高。喂食后4小时，WLE100组的NEFA浓度仍较低，尽管处理与时间的交互作用不显著。在整个9天实验期间，由于能量负平衡，所有动物的NEFA浓度均呈上升趋势，但在WLE处理的母羊中这种上升趋势较为缓和。

图3. 显示了WLE处理对血浆MDA、TAC、SOD和GSH-Px浓度的影响。结果表明，接受WLE100和WLE75处理的母羊的血浆MDA水平较低（P < 0.05），血浆TAC水平较高（P < 0.05），而GSH-Px和SOD的浓度未受处理影响（P > 0.05）。

表5. 不同剂量核桃叶提取物（WLE）静脉注射对母羊静脉葡萄糖耐量测试（IVGTT）期间葡萄糖、胰岛素和非酯化脂肪酸（NEFA）动力学的影响。数据以各处理组的均方根均值表示。

图4A和图4B显示，在补充核桃叶提取物（WLE；CON、WLE50、WLE75、WLE100）的母羊中，喂食前后血浆葡萄糖、胰岛素和NEFA浓度的变化。WLE100组的血糖峰值（P < 0.05）和清除率（CR60 = 1.94%/min）较高，导致AUC60和AUC180值显著低于对照组（P < 0.05）。WLE100组在注射后1小时内的胰岛素峰值（P = 0.001）和AUC也高于对照组，且存在线性及二次趋势。WLE100和WLE75组的180分钟IVGTT期间胰岛素AUC也高于WLE50和对照组（P = 0.0006）。NEFA的最低浓度在各组间无差异（P > 0.21），但在60分钟IVGTT期间WLE100和WLE75组的AUC较低。

图5显示，在注射不同剂量WLE后，WLE处理组动物的血糖和胰岛素浓度变化。WLE100组的血糖峰值（P < 0.05）和清除率（CR60 = 1.94%/min）较高，导致AUC60和AUC180值显著低于对照组。WLE100组在注射后1小时内的胰岛素峰值（P = 0.001）和AUC也高于对照组。WLE100组在180分钟IVGTT期间的胰岛素AUC也较高。

图4C显示，WLE处理对血浆NEFA浓度的影响。WLE100和WLE75组的NEFA浓度在喂食后下降，尤其是在喂食后50分钟时下降更为明显（P < 0.05）。统计分析表明，时间（P < 0.001）和处理与时间的交互作用（P < 0.001）对整个IVGTT期间的血糖浓度曲线有显著影响。WLE100组和WLE75组的胰岛素曲线下面积（AUC60和AUC180）也高于对照组。

图5显示，在IVGTT期间，不同剂量WLE对血糖和胰岛素的影响。WLE100组的血糖峰值（P < 0.05）和清除率较高，导致AUC60和AUC180值显著降低。WLE100组在注射后1小时内的胰岛素峰值（P < 0.01）和AUC也高于对照组。

图6显示了不同剂量WLE对母羊尾部和皮下脂肪组织的影响。WLE处理显著改变了脂肪细胞的形态（P < 0.05），WLE75和WLE100组的脂肪细胞直径增大。WLE处理还显著影响了脂肪细胞的横截面积（P < 0.001），但处理与组织之间的交互作用不显著。数据以每个处理组的最小二乘均值呈现。变量包括尾脂、皮下脂肪和空细胞。P值用于比较不同处理组之间的差异。

| 处理组 | 尾脂 | 皮下脂肪 | 空细胞 | P值 |
|-------------|------------|-----------|---------|-----------|
| CONWLE50 | 109.1 | 103.0 | 97.3 | 0.098 |
| WLE75 | 106.6 | 101.0 | 93.1 | 0.098 |
| WLE100 | 108.3 | 82.5 | 92.1 | 1.18 |
| SEM | | | | |

表中数据为最小二乘均值。在同一行中，不同小写字母（a–c）表示根据Tukey–Kramer事后检验（P ≤ 0.05）处理组之间存在显著差异。

3.5 基因表达
通过qRT-PCR分析了WLE处理组中PPARγ、INSR、GLUT4、HSL、Perilipin、TNF-α和IL-6基因的表达情况，如图7所示。图8展示了提取物对尾脂和皮下脂肪组织中基因表达的比较效应。基因表达分析显示，与对照组相比，WLE处理显著上调了INSR和GLUT4基因的表达，并下调了TNF-α基因的表达。WLE处理（尤其是100毫克剂量WLE100）显著增加了皮下脂肪和尾脂组织中GLUT4的表达，尽管不同组织类型之间的差异没有统计学意义（图6，P = 0.057）。HSL和IL-6的表达水平在所有WLE剂量和脂肪库中保持不变。相反，INSR的表达呈剂量依赖性上调。在WLE100剂量下，尾脂中的表达最高；而在皮下脂肪中，WLE50和WLE75引起的表达高于对照组。有趣的是，WLE50剂量下皮下脂肪中的INSR表达显著高于尾脂（图6，P < 0.001）。同样，WLE100剂量下尾脂中的PPARγ表达显著增加，而皮下脂肪中则没有显著变化。Perilipin的表达在两种脂肪库中均未受到WLE处理的影响。作为促炎细胞因子的TNF-α的表达呈剂量依赖性下降，尤其是在WLE100剂量下下降最为显著（P < 0.001）。这些结果表明，WLE（尤其是高剂量）可能通过上调关键代谢基因（GLUT4、INSR和PPARγ）来改善胰岛素敏感性，并通过抑制TNF-α表达发挥抗炎作用。

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图7. 实验第10天时，不同剂量核桃叶提取物（WLE）对母羊脂肪组织中关键代谢基因mRNA表达的影响。图表显示了尾脂和皮下脂肪中葡萄糖转运蛋白4（GLUT4）、激素敏感脂肪酶（HSL）、白细胞介素-6（IL-6）、胰岛素受体（INSR）、过氧化物酶体增殖激活受体γ（PPARG）、Perilipin和肿瘤坏死因子α（TNF-α）的相对mRNA水平。实验前母羊经历了10天的饲料限制。实验处理在饲料限制开始后48小时开始，分别在早晨喂食前和喂食后4小时进行注射，第4、5、6、7和8天重复注射。数据以均值±标准误差（SEM）呈现。不同处理组在同一组织类型内的显著差异由不同上标字母表示（P < 0.05），大写字母表示尾脂的差异，小写字母表示皮下脂肪的差异。

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图8. 实验第10天时，核桃叶提取物对尾脂组织和皮下脂肪组织中关键代谢基因mRNA表达的影响。图表显示了尾脂和皮下脂肪中葡萄糖转运蛋白4（GLUT4）、激素敏感脂肪酶（HSL）、白细胞介素-6（IL-6）、胰岛素受体（INSR）、过氧化物酶体增殖激活受体γ（PPARG）、Perilipin和肿瘤坏死因子α（TNF-α）的相对mRNA水平。实验前母羊经历了10天的饲料限制。实验处理在饲料限制开始后48小时开始，分别在早晨喂食前和喂食后4小时进行注射，第4、5、6、7和8天重复注射。数据以均值±标准误差（SEM）呈现。不同处理组在同一组织类型内的显著差异由不同上标字母表示（P < 0.05），大写字母表示尾脂的差异，小写字母表示皮下脂肪的差异。

4. 讨论
小型反刍动物的可持续生产从根本上依赖于有效利用营养物质，以在具有挑战性的环境或营养条件下维持最佳动物健康、生产力和适应性（Nehra等人，2024年）。虽然核桃叶提取物在啮齿动物和人类模型中因其抗氧化、抗炎和代谢调节作用而被广泛研究，但其对反刍动物代谢的影响，特别是在绵羊中的影响，仍然很大程度上未被探索。本研究提供了新的证据，表明静脉注射WLE可以缓解与饲料限制相关的几种不良代谢后果，为将其作为增强反刍动物健康的植物源干预措施提供了重要见解。核桃叶提取物中的黄酮类化合物是主要的生物活性成分，已被证明可以调节饲料摄入量、调节氧化应激并提高小型反刍动物的代谢效率（Lucio-Ruíz等人，2024年；Zhuang等人，2024年）。在本研究中，WLE以100毫克/千克体重（mg/kg BW）的剂量给药，在负能量平衡期间有效防止了体重（BW）和体况评分（BCS）的下降。相比之下，对照组和低剂量组在这些参数上出现了显著下降，表明高剂量WLE具有保护性代谢效应。这些结果可能反映了多酚化合物在提高能量效率、减少体内储备的过度动员以及维持氧化还原平衡方面的多方面作用（Piao等人，2023年）。WLE稳定体重和BCS的能力与先前的研究结果一致，这些研究表明植物源化合物可以支持肝脏功能、调节脂质代谢并提高反刍动物的能量利用。例如，Kazemi和Mokhtarpour（2021年）报告称，包括核桃在内的多种树叶具有足够的营养潜力，可以在饲料短缺期间满足小型反刍动物的需求。在本研究中，WLE给药还导致血清甘油三酯和胆固醇浓度降低，尤其是在WLE100组，进一步证实了多酚和植物源化合物可以有益地调节反刍动物的脂质代谢和代谢健康（Piao等人，2023年）。

除了对脂质和能量代谢的影响外，接受WLE100治疗的母羊表现出显著较低的BUN（血尿素氮）浓度。Wang等人（2021a）报告称，在泌乳绵羊中，BUN含量受蛋白质摄入量的强烈影响，饮食中蛋白质的减少与BUN水平的降低相关。这些观察表明，WLE可能会影响蛋白质周转或瘤胃-肝脏氮循环（Reynolds & Kristensen，2008年）。同时，WLE处理动物的血清NEFA（游离脂肪酸）浓度也降低。循环中的NEFA主要反映来自脂肪组织的甘油三酯动员，在禁食条件下也可能反映饮食脂肪组成（Tor等人，2021年）。尽管NEFA的降低可能表明代谢效率的提高或脂肪分解的减少（Contreras & Sordillo，2011年），但其解释应谨慎进行，因为较低的NEFA水平并不一定意味着有益的效果。尽管如此，NEFA仍然是监测反刍动物脂质动员和代谢状态的有价值生物标志物（LeBlanc，2010年），需要进一步研究以明确这些变化的功能意义。

本研究另一个关键观察结果是WLE处理母羊的血浆胰岛素浓度升高。胰岛素在调节脂肪分解和脂肪动员中起关键作用，有效抑制皮下脂肪组织的NEFA释放（Lafontan等人，2005年）。观察到的胰岛素升高可能部分解释了NEFA水平的降低，反映了胰岛素敏感性的提高和对脂肪组织代谢的调节作用。多项研究支持核桃叶对葡萄糖-胰岛素动态的影响。Mukarram等人（2024年）报告称，核桃叶可以改善血糖控制，可能是通过改善碳水化合物吸收实现的。同样，Ansari等人（2023年）证明核桃叶中的生物活性化合物可以刺激活化的胰腺β细胞分泌胰岛素。Mohammadi等人（2011年）进一步强调，WLE可以在体外增强葡萄糖摄取并抑制蛋白质酪氨酸磷酸酶1B（PTP1B），后者会负调节胰岛素信号传导，从而提供改善胰岛素活性的潜在机制。氧化应激是胰岛素抵抗和2型糖尿病（T2DM）发展的关键因素，主要是通过产生活性氧（ROS）和促炎介质，这些因素会损害胰岛素分泌并促进代谢功能障碍的自我循环（Weinberg Sibony等人，2024年）。与这些机制一致，本研究发现表明，WLE通过其丰富的黄酮类和酚酸成分发挥强大的抗氧化和抗炎作用（Pereira等人，2007年），可能有助于提高胰岛素敏感性。Dai等人（2024年）和Shabbir等人（2024年）证明核桃叶可以调节促炎代谢途径并清除自由基，进一步支持其在缓解氧化应激引起的代谢紊乱中的潜在作用。Mirzababaei等人（2022年）确定核桃叶中的3-和5-咖啡酰奎宁酸及槲皮素是关键成分，它们显著降低了空腹血糖并提高了空腹胰岛素水平。这些效应被认为是通过抗氧化机制实现的，鉴于炎症和先天免疫激活在T2DM发病机制中的核心作用（Shabbir等人，2024年）。

Moravej等人（2016年）提出，核桃叶的降糖作用可能涉及模拟胰腺β细胞活性，从而增强胰岛素释放并减少肠道碳水化合物吸收。Samei等人（2024年）进一步证实，口服WLE可以通过多种机制改善血糖控制，包括抑制PTP1B、增加外周葡萄糖摄取和α-淀粉酶抑制。这些发现为核桃叶制剂在管理高血糖水平中的传统用途提供了强有力的体外和体内依据。尽管有大量的啮齿动物和人类研究，但在反刍动物中的类似研究仍较少。Sun等人（2020年）报告称，核桃油衍生的多不饱和脂肪酸可以改善葡萄糖和脂质代谢，减轻妊娠糖尿病大鼠的氧化应激并降低胰岛素抵抗。Ali和Zeb（2024年）也强调了核桃油对脂质谱的有益影响。在反刍动物模型中，Jamali Emam Gheise等人（2018年）证明，在产前和产后期间补充核桃粉可以降低高产奶牛的NEFA浓度，表明核桃衍生产品可能在调节脂质动员中发挥作用。总体而言，这些发现强调了WLE的强大抗氧化能力及其调节脂肪组织脂质过氧化和β-氧化的潜力，从而有助于饲料限制反刍动物的代谢稳定。

本研究独特地采用了静脉注射WLE的方法，首次揭示了其在肥胖反刍动物中的系统抗氧化和代谢效应。与饮食补充不同，静脉注射绕过了瘤胃降解，保护了多酚化合物并提高了其生物利用度。这种方法允许观察诸如血脂异常和氧化损伤的减少等机制（Manach等人，2004年）。WLE给药与氧化应激生物标志物的有利变化相关，包括MDA（丙二醛）浓度的降低（Cordiano等人，2023年）。Daddam等人（2023年）报告称，植物多酚可能通过激活Nrf2介导的抗氧化反应来提高脂肪组织的韧性，这与我们的发现一致。此外，血清分析显示胰岛素和总抗氧化能力（TAC）升高，支持静脉注射WLE可以改善母羊的氧化还原状态和整体代谢健康（Sordillo & Aitken，2009年）。

静脉葡萄糖耐量测试（ivGTT）提供了WLE代谢影响的额外证据。接受WLE100治疗的母羊在最初60分钟和180分钟内表现出较低的血糖峰值浓度和较低的曲线下面积（AUC），同时注射后胰岛素水平较高（表6，图3）。尽管WLE100导致初始血糖峰值较高，但随后血糖下降更快，从而导致总体AUC降低。这些结果与补充植物源性油籽的过渡期奶牛的研究结果相反，在那些研究中血糖峰值没有显著变化（Hashemzadeh-Cigari等人，2015年）。这里观察到的血糖清除增强可能反映了由于WLE长时间输注导致的周围葡萄糖摄取增加，尽管胰岛素反应较高（Saltiel & Kahn，2001年）。此外，葡萄糖输注后NEFA浓度显著下降，这与胰岛素的抗脂肪分解作用一致。值得注意的是，WLE显著调节了ivGTT期间的NEFA反应（WLE100组为590 μEq/L，对照组为260 ± 70 μEq/L；p < 0.001），表明胰岛素反应导致了脂肪分解的最大抑制（Jahani-Azizabadi等人，2022年）。

脂肪组织的组织学分析显示，WLE剂量依赖性地影响了尾脂和皮下脂肪库中的脂肪细胞形态。最高剂量（WLE100）减少了脂肪细胞的数量，同时增加了脂肪细胞的直径和面积（表6，图5），这表明脂质重新积累并且脂肪分解活性减弱。脂肪细胞肥大可能是对脂肪分解抑制的代偿反应，可能通过抗氧化剂对AMPK和激素敏感性脂肪酶（HSL）信号通路的反馈作用介导（Lafontan & Langin, 2009）。高剂量的多酚可以通过中和ROS来抑制脂肪分解，而ROS在脂质动员中起着关键的信号分子作用（Wang et al., 2021b）。WLE中的单宁和黄酮类化合物似乎具有剂量依赖性的双重效应：在低浓度下刺激脂肪分解，而在高浓度下通过干扰儿茶酚胺信号通路来抑制脂肪分解（Park et al., 2023）。Liu等人（2025）进一步报告称，较低剂量的WLE可以增强脂肪褐变基因（UCP1, PGC-1α）的表达，而较高剂量则会抑制这些效应，这突显了脂肪库的特异性敏感性。尾脂中的脂肪细胞数量减少更为明显，这与之前关于脂肪库特异性调节脂质代谢的观察结果一致（Lafontan et al., 2005）。在分子水平上，WLE显著上调了脂肪组织中的INSR和GLUT4的表达，而不影响HSL、Perilipin或IL-6。这些发现表明WLE通过调节胰岛素受体和GLUT4的表达来增强葡萄糖的摄取。像黄酮类和绿原酸这样的酚类成分可以抑制PTP1B的活性，从而增强胰岛素信号传导和葡萄糖摄取（Ali & Zeb., 2024; Sheng et al., 2021; Tahtah et al., 2016; Sohail et al., 2022）。未来的研究需要阐明WLE对脂肪分解、能量代谢和胰岛素敏感性影响的精确分子机制。总体而言，这些发现表明WLE可以在能量限制期间作为一种有效的代谢调节剂，尽管还需要更大样本量、更长的实验时间和详细的生理测量来确认这些效应并阐明其背后的机制。研究WLE的其他给药途径及其与饮食策略的结合可能会为WLE在反刍动物营养中的转化应用提供额外的见解。

5. 结论
在饲料限制条件下，给母羊静脉注射核桃叶提取物（WLE）可以改善其代谢健康、氧化状态和胰岛素敏感性，通过增强抗氧化能力、调节葡萄糖-胰岛素动态以及改变脂肪细胞的形态和INSR及GLUT4的表达来实现，其中100 mg/kg体重剂量下的效果最为显著。这些发现表明WLE可能作为一种有前景的代谢调节剂，有助于支持反刍动物在能量限制下的适应能力。为了推进WLE在反刍动物生理学中的转化应用，未来的研究应调查静脉注射后黄酮类化合物的循环特征，研究饲料限制期间以及通过非肠道途径给予植物活性物质时的瘤胃发酵动态，并评估WLE使用的长期影响——特别是对繁殖性能和整体健康的影响。更大的样本量、更长的实验周期以及更详细的生理和分子评估将有助于进一步加深对WLE机制及其实际应用价值的理解。

伦理声明
所有动物实验均获得了乌尔米亚大学动物护理和使用委员会（批准编号IR3016041）的批准，并符合伊朗动物护理委员会的规定。本研究遵循ARRIVE指南进行体内实验报告，所有实验方法均符合相关法规和标准。涉及植物的研究，无论是栽培的还是野生的，包括植物样本的采集，均按照相关机构、国家和国际规则及指南进行。

作者贡献声明
Maryam Sahebi-Ala：撰写——初稿、软件使用、实验设计、数据管理。
Hamed Khalilvandi-Behroozyar：撰写——审阅与编辑、撰写——初稿、验证、监督、资源协调、项目管理、方法学设计、资金获取、数据分析、概念构建。
Rasoul Pirmohammadi：撰写——审阅与编辑、项目管理、资金获取、概念构建。
Ehsan Anassori：撰写——审阅与编辑、资源协调、数据管理。
Morteza Hosseini-Ghaffari：撰写——审阅与编辑、监督。