Esculetin 通过抑制 PI3K-AKT/NF-κB 通路的激活来抑制 PRV（猪繁殖与呼吸综合征病毒）的复制

《Veterinary Microbiology》：Esculetin inhibits PRV replication by suppressing activation of the PI3K-AKT/NF-κB pathway

　　

张彦峰|李瑞飞|万照坤|牛伟婷|陈叶桐|杨庚|徐娟娟|朱燕

中国哈尔滨东北农业大学兽医学院

摘要

伪狂犬病（PR）由伪狂犬病病毒（PRV）引起，是一种急性且具有高度传染性的疾病，对全球养猪业造成了巨大的经济损失。近年来，能够逃避疫苗诱导免疫的神经嗜性PRV变体的出现凸显了迫切需要安全有效的抗病毒药物。在本研究中，我们证明了esculetin在体外和体内均表现出显著的抗病毒活性。Esculetin以剂量依赖的方式抑制了PK-15细胞中的PRV复制，选择性指数（SI）为15.85，最大抑制率为98.53%。在体内实验中，给予0.2 g/kg剂量的esculetin可使PRV感染小鼠的存活率提高到28.5%。大脑、肺和肾脏中的病毒载量也以剂量依赖的方式降低，并伴有PRV引起的组织损伤的显著减轻。此外，0.2 g/kg剂量的esculetin处理显著降低了血清中的促炎细胞因子IL-6、TNF-α和IL-1β的水平。从机制上看，esculetin抑制了AKT的磷酸化，抑制了NF-κB P65的核转运，并下调了包括IL-6、TNF-α、iNOS和MCP-1在内的炎症相关基因和蛋白的表达。这些发现表明，esculetin可能通过调节炎症反应来发挥其抗PRV作用，从而显示出作为预防和治疗PRV感染的有前景的抗病毒候选物的潜力。

引言

伪狂犬病病毒（PRV）属于Herpesviridae科和Varicellovirus属，是伪狂犬病的病原体，其双链DNA基因组编码多种结构和非结构蛋白，包括对病毒进入和组装至关重要的关键糖蛋白gB、gC和gD（Pomeranz等人，2005年）。PRV主要感染家猪，但也可以感染多种宿主。该病毒主要通过呼吸道和消化道传播。感染后，PRV迅速扩散到神经系统，导致神经系统症状、呼吸系统疾病和繁殖失败（Tan等人，2021年）。感染通常对仔猪是致命的（Liu等人，2021年），而幸存的动物可能会发展成难以根除的潜伏感染（Koyuncu等人，2018年）。此外，还报告了人类感染的零星病例，引发了人们对潜在公共卫生风险的担忧（Ai等人，2018年）。长期使用传统疫苗对PRV产生了强烈的选择压力，促进了多种变异株的出现（Ye等人，2016年）。这些变异株表现出更强的神经嗜性和对现有疫苗的敏感性降低，从而削弱了疫苗的效果，给养猪业带来了严重挑战（Gu等人，2015年）。因此，开发安全有效的抗病毒药物用于PRV的预防和治疗变得日益紧迫。

天然化合物因其良好的安全性、可获取性和成本效益而成为抗病毒药物发现的吸引人的来源（Li和Peng，2013年）。越来越多的天然产物被报道具有抗PRV活性。例如，黄酮类化合物如橙皮苷（Xu等人，2025年）和二氢杨梅素（Sun等人，2022年），以及多酚类化合物如白藜芦醇（Zhao等人，2018年）和皮塞坦醇（Wang等人，2023年），都显示出对抗PRV的有希望的抑制作用。

Esculetin（6,7-二羟基香豆素）是一种香豆素衍生物，也是中国草药Cortex Fraxini的主要活性成分，具有多种药理作用，包括抗肿瘤（Wang等人，2020年）、抗氧化（Vianna等人，2012年）、抗炎（Hong等人，2014年）和免疫调节活性（Chen等人，2018a）。此外，esculetin对多种病毒表现出广谱抗病毒活性，如单纯疱疹病毒1型和2型（Tian等人，2009年；Wang，2017年）、石斑鱼虹彩病毒（Huang等人，2021年）、乙型肝炎病毒（Huang等人，2019年）、人类呼吸道合胞病毒（de Sá等人，2024年）和新城疫病毒（Galabov等人，1996年）。先前的研究表明，从Nervilia fordii整株植物中提取的esculetin作为HSV-1的抑制剂得到了验证（Tian等人，2009年）。Wang等人通过显微镜观察、CCK-8检测和考马斯亮蓝染色证明esculetin具有抗HSV-II活性，并能抑制ICP27蛋白的表达（Wang，2017年）。基于这些发现，本研究旨在评估esculetin在体外和体内的抗PRV效果，并探讨其作用机制。本研究为抗病毒天然产品的开发和应用提供了科学依据，并强调了预防和控制PRV感染的潜在策略。

章节片段

细胞、病毒和esculetin

PK-15细胞在含有10%胎牛血清、100单位/mL青霉素和链霉素的培养基中于37℃和5% CO₂条件下维持。对于细胞毒性和抗PRV实验，使用添加了2%胎牛血清的DMEM培养基。伪狂犬病病毒株TJ（GenBank: KJ789182.1）由哈尔滨兽医研究所提供，在PK-15细胞中繁殖。病毒滴度通过Reed–Muench方法确定为10^-6.173 TCID₅₀/0.1 ml，并进行分装储存

Esculetin抑制PK-15细胞中的PRV复制

我们评估了esculetin在PK-15细胞中的细胞毒性，以确定一个安全的工作浓度。将esculetin的DMSO储备液稀释到维持培养基中，使最终的DMSO浓度低于1%。esculetin的化学结构如图1A所示。显微镜观察和CCK-8检测显示，随着esculetin浓度的增加，细胞活力逐渐下降。在0.125 mg/mL以下的浓度下，细胞活力与对照组没有显著差异（图1B）。因此，选择0.125 mg/mL作为实验浓度。

讨论

在本研究中，我们发现esculetin在体外对PRV复制具有显著的抑制作用，选择性指数（SI）为15.85，抑制率为98.54%，这是通过DNA-qPCR分析得出的。这些结果表明esculetin具有很强的抗PRV潜力。这一发现特别重要，因为目前PRV不断出现新的变体，这些变体具有更强的神经嗜性、免疫逃逸能力和更低的疫苗保护效果。

结论

我们的结果表明，esculetin在体外和体内均表现出显著的抗病毒活性。在PRV感染的小鼠中，esculetin治疗提高了存活率，同时减少了主要靶器官中的病毒载量，降低了全身性促炎细胞因子的水平，并减轻了病毒引起的组织损伤。从机制上看，esculetin可能通过抑制细胞内病毒复制、抑制PRV复制相关基因的表达来发挥其抗病毒作用。

CRediT作者贡献声明

张彦峰：撰写——原始草稿，方法学部分。牛伟婷：正式数据分析。陈叶桐：正式数据分析。李瑞飞：正式数据分析。万照坤：正式数据分析。朱燕：监督，资金获取。杨庚：正式数据分析。徐娟娟：正式数据分析。

利益冲突声明

本手稿不存在利益冲突，所有合作者均同意提交。我代表我的合作者声明，所描述的工作是原创的，尚未在任何地方以全部或部分形式发表。

致谢

首先，我们要衷心感谢黑龙江省优秀青年教师基础研究支持计划（YQJH2023195）提供的财政支持，使这项研究得以顺利进行。

我们非常感谢东北农业大学兽医学院的朱燕教授在整个研究过程中给予的宝贵指导。