PorV蛋白作为对抗Riemerella anatipestifer感染的交叉保护性抗原

《Veterinary Microbiology》：The PorV protein as a cross-protective antigen against Riemerella anatipestifer infection

　　

李森|王艳华|刘雄|任可可|邓彦平|肖云才|胡思顺|李子丽|周洪波|刘正飞|周祖涛

中国华中农业大学兽医学院，武汉

摘要

筛选和鉴定具有交叉保护作用的抗原是开发新疫苗的关键，尤其是对于具有多种血清型的细菌病原体。在本研究中，我们评估了黏附素PorV和PosF作为针对Riemerella anatipestifer（R. anatipestifer，RA）感染的亚单位疫苗候选物。接种PorV、PosF、PorV+PosF或灭活RA菌苗的鸭子产生了高水平的特异性抗体，而由灭活菌苗诱导的抗体也能特异性地识别PorV和PosF蛋白。接种PorV蛋白的鸭子的血清显著增强了外周血单核细胞的吞噬活性，其效果与接种菌苗的血清相当。在血清杀菌试验中，接种PorV、PosF、PorV+PosF或菌苗的鸭子中RA的存活率分别为22%、16%、8%和0.2%，而未接种疫苗的健康鸭子的存活率为73%。这些结果表明，PorV和PosF蛋白能够诱导出功能性抗体，这些抗体与补体协同作用杀死RA。当通过足垫注射5倍LD₅₀的RA-YM时，接种PorV、PosF或PorV+PosF的鸭子的保护率分别为40%、20%和20%，而接种菌苗的鸭子存活率为100%。尽管PorV蛋白的保护率仅为40%，但它显著降低了RA-YM感染引起的炎症细胞因子水平，并减轻了病理损伤。此外，接种PorV蛋白的鸭子还能抵抗5型RA野毒株的攻击。这些结果表明，PorV具有针对不同RA血清型的交叉保护潜力，是亚单位疫苗开发的理想候选物。

引言

Riemerella anatipestifer（R. anatipestifer，RA）是鸭子和其他家禽的重要细菌病原体，是传染性血清炎的致病菌（Hao等人，2025年）。该菌具有广泛的血清型多样性，不同血清型之间的交叉保护作用有限，这给疾病控制带来了重大挑战，导致家禽产业遭受巨大经济损失（Kang等人，2018年）。近年来，RA感染在商业鸡和种鸡中也日益增多，与产蛋量下降和关节炎有关，进一步影响了家禽的健康和生产力（Wang等人，2024年）。尽管抗生素被广泛用作主要治疗方法，并能在疫情期间有效降低死亡率，但多重耐药菌株的频繁出现成为一个主要问题，严重影响了治疗效果，并引发了关于抗菌药物管理和食品安全的更广泛问题（Li等人，2025b）。

疫苗接种是一种重要的预防策略，目前最常用的疫苗是针对RA 1型和2型的灭活疫苗（Liang等人，2024年）。近年来，包括1型、2型、5型、6型、7型和10型在内的多种RA血清型的流行限制了灭活菌苗的效果，因为这些血清型之间的交叉保护作用较差（Wang等人，2002年；Gu等人，2023年）。减毒疫苗可以引发体液和细胞免疫反应，提供持久的保护作用，从而减少重复接种的需要，凸显了它们在疫苗开发中的潜在价值。目前研究最广泛的RA减毒疫苗包括自然减毒菌株（如1型、2型和5型），以及通过删除毒力相关基因（如ΔsprT、ΔphoP、ΔB739–2187和Δfur）生成的基因工程菌株（Sandhu，1991年；Guo等人，2017年；Zhao等人，2016年；Li等人，2023年；Huang等人，2023年）。然而，自然减毒和基因工程减毒疫苗的开发受到恢复毒力的风险、高生产成本和漫长开发周期的阻碍。这些限制凸显了迫切需要开发能够诱导针对多种RA血清型广泛交叉保护的新疫苗，以提供更安全、更有效的疾病预防和控制方案。

细菌黏附素是高度保守的表面蛋白，负责与宿主细胞的附着，在感染启动过程中起关键作用。它们的保守性质确保了宿主免疫系统的广泛识别，使其成为有前景的疫苗候选物。例如大肠杆菌的FimH和假结核耶尔森菌的三聚体自转运蛋白YadA已被证明是疫苗的亚单位成分（Langermann等人，1997年；Silmon de Monerri等人，2025年；Tsugo等人，2017年）。作为高度免疫原性的表面抗原，细菌黏附素能引发强烈的体液免疫反应，表现为黏附阻断抗体和补体介导的清除作用。这些抗原在抗原处理后还能激活抗原特异性T细胞反应，从而促进体液和细胞免疫，并帮助建立免疫记忆。这些特性使细菌黏附素成为具有潜在交叉保护能力的疫苗开发的宝贵目标（Pereira和Hartwig，2025年；Singh等人，2014年；Thibau等人，2020年）。

近年来，针对RA的亚单位疫苗研究取得了进展。候选抗原包括YaeT、OmpA、P45N’、GroEL和PaR1蛋白（Guan等人，2023年；Han等人，2012年；Huang等人，2002年；Wang等人，2023年；Xu等人，2020年）。然而，单蛋白免疫诱导的保护效果相对较低，仍然是一个主要挑战。

在我们之前的研究中，我们发现RA蛋白PorV和PosF是感染过程中参与宿主细胞附着的黏附素（Li等人，2025a）。因此，本研究旨在评估PorV和PosF对RA感染的免疫原性和保护效果。通过检测抗原特异性抗体反应、淋巴细胞增殖、抗体相关的调理吞噬活性、血清杀菌活性、感染后的存活率以及组织病理变化，评估了这些蛋白的免疫原性和保护潜力。这一全面评估为选择RA亚单位疫苗的候选抗原提供了科学依据。

部分内容

伦理声明

所有动物实验均按照ARRIVE指南进行，并获得了中国湖北省华中农业大学研究伦理委员会的批准（批准编号：HZAUDU-2025–0005）。在实验结束时，根据美国兽医协会（AVMA）的《动物安乐死指南》（2020年版）对鸭子进行了人道安乐死。安乐死是通过过量注射麻醉剂（戊巴比妥）来实施的

PorV和PosF表现出免疫反应性

纯化的PorV（GenBank: QXT33237.1）和PosF（GenBank: QXT33746.1）蛋白通过SDS-PAGE进行分析，使用BCA蛋白测定试剂盒（Absin，上海，中国）测得其浓度分别为1.5 mg/mL和1.0 mg/mL。Western blot分析显示，这两种蛋白都能被接种RA-YM菌株的鸭子产生的高免疫血清中的抗体特异性识别，而eGFP阴性对照则没有表现出反应性，表明

讨论

鉴于开发针对抗原多样性病原体的有效疫苗的挑战，鉴定保守和免疫优势抗原对于亚单位疫苗的设计至关重要。在本研究中，我们专注于筛选RA-YM菌株的保守黏附素作为候选抗原。针对这些抗原有望引发体液和细胞免疫反应，从而为针对不同RA血清型提供更广泛和更有效的保护。

结论

总之，我们的结果表明，PorV提供了部分保护作用，并引发了比PosF更强的抗体反应，显示出其作为具有交叉保护潜力的RA亚单位疫苗候选物的前景。相比之下，PosF免疫诱导的抗体功能活性有限，仅提供了部分保护，其与PorV的组合甚至导致了免疫干扰。结合之前的研究证据，非保护性抗体反应在病毒中也存在

CRediT作者贡献声明

邓彦平：方法学研究。肖云才：监督、资源提供。刘雄：方法学研究、实验设计。任可可：验证、软件使用。周洪波：监督、资源提供、资金筹集。刘正飞：监督、资源提供。胡思顺：监督、资源提供。李子丽：监督、资源提供。周祖涛：写作、审稿与编辑、监督、资源提供、概念构思。李森：写作、审稿与编辑、初稿撰写、软件使用、方法学研究，

资助

本研究得到了中国国家重点研发计划（项目编号：2023YFD1800200）和中国农业研究系统专项基金（项目编号：CARS-41）的支持。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本研究报告工作的财务利益或个人关系。