槲皮素在脂多糖诱导的肉鸡胸腺坏死性凋亡中的保护作用解析：基于网络药理学和实验验证的Nrf2/PERK信号通路见解

《Redox Report》：Elucidating the protective role of quercetin against lipopolysaccharide-induced necroptosis in broiler thymus: insights from Nrf2/PERK signaling based on network pharmacology and experimental validation

　　

槲皮素（Quercetin, QUE）具有抗氧化、抗炎和免疫调节功能。核因子E2相关因子2（Nuclear factor erythroid 2-related factor 2, Nrf2）可启动蛋白激酶RNA样内质网激酶（protein kinase RNA-like ER kinase, PERK），导致免疫功能障碍和坏死性凋亡。本研究的发现阐明了槲皮素在减轻脂多糖（LPS）诱导的免疫组织损伤中的治疗潜力。 研究人员用LPS和/或槲皮素处理肉鸡和MSB-1细胞。他们还用Nrf2抑制剂（ML385）、PERK激活剂（MK-28）和坏死性凋亡抑制剂（NSA）处理MSB-1细胞，以进一步探索其详细机制。此外，研究人员进一步通过网络药理学和生物信息学分析了槲皮素与基因之间的调控关系。 网络药理学和生物信息学的综合分析揭示，槲皮素通过调节Nrf2活化及其与PERK信号的串扰，影响钙稳态、坏死性凋亡和炎症。基于实验验证，研究结果表明槲皮素处理通过Nrf2信号通路减轻了LPS诱导的氧化还原稳态失衡。槲皮素处理下调了与内质网应激（ERS）、坏死性凋亡和炎症相关的细胞因子表达。此外，槲皮素处理可防止LPS诱导的免疫功能紊乱。 研究得出结论，槲皮素处理通过Nrf2/PERK信号通路有效减轻了肉鸡胸腺免疫紊乱和坏死性凋亡。这项研究丰富了槲皮素的生物学功能，为其潜在应用的开发提供了坚实基础。

研究背景、问题与动机

槲皮素是一种广泛存在于水果和蔬菜中的膳食类黄酮，具有减少氧化应激、缓解炎症和调节免疫反应的潜力。然而，在禽类养殖中，革兰氏阴性菌感染导致的免疫抑制是常见问题，脂多糖（LPS）常被用作建模工具。尽管槲皮素在保护脾脏等免疫组织损伤方面显示出应用价值，但其对鸡胸腺损伤的拮抗作用及其潜在机制尚不明确。胸腺是肉鸡免疫系统的关键器官。Nrf2是调节氧化应激反应的核心转录因子，而内质网应激（ERS）条件下的PERK信号通路可引发炎症和坏死性凋亡。目前，槲皮素是否通过Nrf2/PERK信号通路缓解肉鸡胸腺坏死性凋亡仍不清楚。因此，本研究旨在探讨槲皮素对LPS诱导的肉鸡胸腺坏死性凋亡的保护作用及其分子机制。

研究目的与方法概述

本研究的主要目的是阐明槲皮素是否通过调控Nrf2/PERK信号通路来减轻LPS诱导的肉鸡胸腺坏死性凋亡和免疫功能障碍。研究人员结合网络药理学、生物信息学分析以及体内外实验进行验证。研究样本队列为14日龄的肉鸡（分为对照组、LPS组、槲皮素组和LPS+槲皮素组），并使用了鸡淋巴瘤细胞系MSB-1进行体外实验。为深入探索机制，在细胞实验中还使用了Nrf2抑制剂ML385、PERK激活剂MK-28和坏死性凋亡抑制剂NSA等工具化合物。

研究采用的关键技术方法主要包括：1. 网络药理学与生物信息学分析，用于预测槲皮素的作用靶点、富集通路及基因间的相互作用网络。2. 组织病理学观察（苏木精-伊红染色）评估胸腺结构损伤。3. 生化指标检测，测定超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-px）、丙二醛（MDA）等氧化应激标志物以及免疫球蛋白（IgA, IgG, IgM）和白细胞介素2（IL-2）的水平。4. 免疫荧光、免疫印迹和定量逆转录聚合酶链式反应，用于检测Nrf2、PERK信号通路、钙稳态、坏死性凋亡和炎症相关基因的蛋白与mRNA表达水平。5. 细胞内活性氧和钙离子检测，使用荧光探针进行评估。6. 细胞活力测定和荧光素酶报告基因检测，用于评估药物毒性和内质网应激反应元件（ERSE）活性。

研究结果

3.1. 槲皮素减轻肉鸡胸腺损伤

组织病理学观察显示，LPS组肉鸡胸腺结构紊乱，淋巴细胞数量减少，并出现炎性细胞浸润和细胞裂解。槲皮素处理显著减轻了这些损伤，表明其对胸腺具有保护作用。相关结果在Figure 1的HE染色图片中直观呈现。

3.2. 槲皮素通过调控Nrf2抑制LPS诱导的氧化应激

网络药理学分析发现槲皮素与胸腺炎症的交叉基因涉及Nrf2、氧化应激和TNF信号通路。体内实验表明，LPS刺激导致胸腺组织中活性氧过量产生，抗氧化酶（SOD, CAT, GSH-px）活性降低，MDA含量升高。槲皮素处理逆转了这些变化，并上调了Nrf2、HO-1和NQO1的表达，下调了Keap1的表达。体外细胞实验进一步证实，Nrf2抑制剂ML385可消除槲皮素对LPS诱导的活性氧过量产生的抑制作用，验证了槲皮素通过Nrf2维持氧化还原稳态。相关机制在Figure 2和Figure 3的Venn图、通路富集分析和蛋白表达结果中展示。

3.3. 槲皮素通过Nrf2/PERK通路抑制LPS诱导的内质网应激

研究发现LPS刺激上调了胸腺组织和MSB-1细胞中PERK的表达及其下游因子GRP78、ATF-4和CHOP的表达，表明ERS被激活。槲皮素处理能有效抑制这些因子的表达。在细胞实验中，使用Nrf2抑制剂ML385可逆转槲皮素对PERK磷酸化的抑制作用，而使用PERK激活剂MK-28则能逆转槲皮素对ERS的缓解作用。这表明槲皮素通过调控Nrf2/PERK信号通路来抑制LPS诱导的ERS。Figure 4的免疫荧光和免疫印迹结果支持了这一结论。

3.4. 槲皮素通过PERK信号通路减轻LPS诱导的钙稳态失衡

ERS会破坏钙稳态。研究显示LPS处理降低了钙转运蛋白NCX和SERCA的表达，并增加了细胞内Ca²⁺强度。槲皮素处理恢复了NCX和SERCA的表达，降低了Ca²⁺强度。然而，PERK激活剂MK-28的处理消除了槲皮素的这些保护作用，表明槲皮素通过PERK信号通路维持钙稳态。相关数据体现在Figure 5中。

3.5. 槲皮素通过调控PERK减轻LPS诱导的坏死性凋亡

LPS刺激显著增加了胸腺和细胞中坏死性凋亡标志物RIPK1、RIPK3、MLKL和P-MLKL的表达，降低了Caspase8的表达。槲皮素处理逆转了这些变化。免疫荧光（Figure 6A, 6B, 6E, 6F）清晰显示槲皮素降低了RIPK3和MLKL的荧光强度。在细胞实验中，MK-28处理消除了槲皮素对坏死性凋亡相关基因表达的抑制作用，证明槲皮素是通过调控PERK来减轻坏死性凋亡的。

3.6. 槲皮素通过调控PERK减轻LPS诱导的炎症

LPS处理上调了炎症因子COX-2、IL-1β、IL-6、IFN-γ和TNF-α的表达。槲皮素或坏死性凋亡抑制剂NSA处理均能抑制这些因子的表达。然而，MK-28处理阻断了槲皮素的抗炎作用（Figure 7D, 7E），表明槲皮素通过PERK介导的坏死性凋亡抑制来缓解炎症。

3.7. 槲皮素通过调控PERK防止LPS诱导的免疫功能紊乱

LPS降低了胸腺和细胞中免疫球蛋白（IgA, IgG, IgM）和IL-2的含量及mRNA水平。槲皮素处理恢复了这些免疫指标。在细胞实验中，MK-28处理逆转了槲皮素对免疫功能的保护作用（Figure 8），表明槲皮素通过调控PERK来减轻免疫功能紊乱。

3.8. 生物信息学分析

热图、相关性分析和Metascape分析（Figure 9）表明，Nrf2信号、PERK信号、钙转运、坏死性凋亡和炎症相关因子之间存在显著相关性，进一步支持了槲皮素通过Nrf2/PERK信号通路抑制坏死性凋亡、从而缓解胸腺损伤的结论。

讨论部分总结

研究人员在讨论中指出，槲皮素以其强大的自由基清除能力保护免疫组织。本研究发现槲皮素通过促进Nrf2表达来缓解LPS引发的氧化应激。异常的活性氧积累会破坏氧化还原系统平衡，激活ERS。PERK是介导此过程的关键，并通过调节下游信号级联参与坏死性凋亡和炎症等病理过程。本研究证实，槲皮素处理通过抑制PERK水平减轻了免疫功能紊乱。使用MK-28可消除槲皮素对坏死性凋亡相关因子表达的抑制作用，表明槲皮素通过Nrf2/PERK信号通路缓解坏死性凋亡。坏死性凋亡是一种程序性坏死细胞死亡途径，会引发炎症级联反应。本研究检测发现，槲皮素处理通过Nrf2/PERK诱导的坏死性凋亡抑制，减轻了LPS诱导的胸腺炎症。

研究结论翻译

本研究结果表明，结合网络药理学分析和实验验证，槲皮素处理通过调节Nrf2/PERK信号通路，有效防止了LPS诱导的肉鸡胸腺免疫紊乱和坏死性凋亡。这些发现不仅阐明了槲皮素减轻LPS所致胸腺损伤的分子机制，更重要的是拓展了其在保障家禽健康、促进绿色养殖方面的巨大潜力。