18F标记的小分子放射性示踪剂的合成与评估：作为PET试剂用于检测PD-L1表达

《Applied Radiation and Isotopes》：Synthesis and Evaluation of 18F-labeled Small-molecular Radiotracers as PET Agents for Imaging PD-L1 Expression

　　

朱俊毅|葛曼轩|何思远|张楠|杨继辰|邱玲|林建国|吕高超

南京医科大学药学院放射药学系，中国南京211166

摘要

目的

基于程序性细胞死亡蛋白1/程序性细胞死亡蛋白配体1（PD-1/PD-L1）的免疫检查点抑制剂受到了广泛关注。由于只有少数患者能从这种治疗中受益，因此通过测量PD-L1表达水平来筛选患者非常重要。在这项研究中，开发了两种小分子放射性示踪剂来评估肿瘤中的PD-L1表达。

方法

[¹⁸F]LGA-1和[¹⁸F]LGA-2是基于联苯骨架设计的。这些示踪剂的稳定性通过放射性高效液相色谱（radio-HPLC）进行了检测。使用小鼠黑色素瘤B16-F10细胞进行了细胞实验，以评估其体外的靶向特异性。通过正电子发射断层扫描（PET）成像，在B16-F10肿瘤模型中研究了这些示踪剂体内检测PD-L1表达的能力。

结果

[¹⁸F]LGA-1和[¹⁸F]LGA-2是通过在苯氧甲基-联苯骨架上引入一个或三个甘氨酸基团作为亲水连接剂合成的。它们的放射性化学纯度很高（>98.0%），[¹⁸F]LGA-1的放射性化学产率为15.87 ± 5.66%，[¹⁸F]LGA-2的放射性化学产率为12.63 ± 1.36%。这两种示踪剂在PBS（pH 7.4）和小鼠血清中孵育3小时后仍表现出良好的稳定性。体外细胞实验表明，在2小时时[¹⁸F]LGA-1（5.55 ± 0.51 %AD）的细胞摄取率高于[¹⁸F]LGA-2（3.55 ± 0.30 %AD），并且可以被相应的非放射性化合物阻断。同时，与[¹⁸F]LGA-2相比，[¹⁸F]LGA-1在体内PET成像研究中显示出更好的肿瘤成像效果。

结论

引言

癌症的发病率逐年增加，已成为目前人类死亡的主要原因之一^[1]。然而，传统的治疗方法如手术切除和化疗存在固有的局限性^[2]。近年来，临床肿瘤免疫疗法发展迅速，特别是针对程序性细胞死亡蛋白1/程序性细胞死亡蛋白配体1（PD-1/PD-L1）的免疫抑制疗法受到了广泛关注，显示出良好的临床应用价值和巨大的发展潜力^{[3], [4]}。

PD-1是一种重要的免疫抑制分子，当它与其配体PD-L1结合时，可以通过抑制T细胞激活来防止自身免疫，这是肿瘤免疫抵抗的主要机制^[5]。因此，通过阻断PD-1和PD-L1的结合，可以减轻肿瘤微环境的免疫抑制，帮助效应T细胞重新发挥作用^{[6], [7], [8]}。然而，只有少数患者能从这种治疗中受益^[9]。为了减少无效免疫疗法带来的不良反应，在免疫疗法前对患者进行筛选变得极为重要。临床试验结果显示，癌症患者中的PD-L1表达水平与其从PD-1/PD-L1免疫检查点抑制剂治疗中受益的可能性之间存在正相关^{[10], [11]}。因此，我们可以通过检测患者的PD-L1表达水平来估计他们是否适合接受免疫疗法。

目前，免疫组化（IHC）检测方法被广泛用于评估肿瘤中的PD-L1表达，但它需要体内采样，这具有固有的局限性^{[12], [13]}。由于肿瘤的异质性，IHC的结果只能反映肿瘤中PD-L1的局部表达水平。此外，PD-L1在肿瘤中的表达只能在一个固定的时间段内被检测到，这使得实时监测肿瘤的变化以及免疫疗法期间PD-L1表达水平的变化变得困难^{[14], [15]}。正电子发射断层扫描（PET）作为一种分子成像技术，具有高分辨率和高灵敏度的优势，可以无创地量化生物体内的蛋白质和生化过程。它已被有效用于检测肿瘤中的生物标志物表达并预测患者对治疗的反应^[16]。因此，越来越多的基于单克隆抗体的PET示踪剂被开发出来，迄今为止，已有数十种基于抗体的PD-1/PD-L1免疫检查点抑制剂因其高亲和力而被批准进入全球市场^[17]。然而，单克隆抗体的分子量较大，循环代谢时间较长，导致正常组织受到较高的辐射剂量^[18]。相比之下，小分子和肽的分子量较小，肿瘤穿透能力更强。因此，许多PD-L1肽放射性示踪剂取得了令人满意的结果，例如最近报道的[⁶⁸Ga]dmp10^[19]、[¹⁸F]AlF-NOTA-PCP2^[20]和[⁶⁸Ga]-NOTA-WL12^[21]，这些示踪剂在评估肿瘤中的PD-L1表达方面表现出优越的性能。与肽相比，小分子具有独特的优势，因为它们在组织中的摄取速度更快，药代动力学也更快，例如[^99mTc]Tc-A5^[22]、[⁶⁸Ga]Ga-D-pep-PMED^[23]和[¹¹C]5c^[24]。

在该团队的初步工作中，基于联苯结构开发了几种PD-L1放射性示踪剂[¹⁸F]LG-1^[24]、[¹⁸F]LGSu-1^[26]和[¹⁸F]LG-3^[27]，发现联苯结构与PD-L1具有良好的亲和力，所有这些示踪剂都能快速准确地描绘肿瘤形态。尽管通过引入PEG链后[¹⁸F]LG-3的结合亲和力得到了增强，但仍存在一些问题，如高肠道摄取率。本文旨在进一步优化基于[¹⁸F]LG-3的小分子抑制剂的结构，以获得具有更好靶标与非靶标背景对比度的放射性示踪剂。

在本研究中，设计了两种新型的小分子放射性示踪剂[¹⁸F]LGA-1和[¹⁸F]LGA-2，它们基于联苯结构，并通过不同的甘氨酸（Gly）数量作为连接剂，旨在减少正常组织的摄取。为了探索这两种示踪剂在体内和体外的PD-L1检测能力，进行了细胞摄取实验和PET成像研究。

章节片段

放射性标记

[¹⁸F]氟化物是在医用回旋加速器（四川九一源粒子技术有限公司）中通过¹⁸O (p, n)/¹⁸F核反应生成的。首先，回旋加速器产生的放射性核素¹⁸F被吸附在Sep-Pak light QMA柱（Waters，美国）上，并用NaHCO₃（0.5 M，10 mL）和水（10 mL）活化。然后用2 mL的Kryptofix_2.2.2/K₂CO₃洗脱放射性核素¹⁸F，并在氮气下用乙腈吹干。在100°C下向反应体系中加入含有2 mg化合物G4的0.7 mL DMSO溶液

合成

LGA-1和LGA-2的详细合成步骤如图1和支持信息所示。化合物1和G5是根据我们团队之前的报告获得的^[27]。在DMF中，化合物1与不同数量的甘氨酸在NaBH₃CN和AcOH的存在下进行还原胺化反应，分别获得了化合物2a和2b，产率分别为42%和40%。化合物3a和3b是通过将2a和2b与3-溴丙炔进行取代反应合成的，产率分别为63%和80%。

讨论

PET成像技术可以克服IHC的缺点，IHC无法全面、无创和及时地响应PD-L1的表达。尽管一些PD-L1放射性示踪剂在临床前研究中显示出有希望的前景，但它们的临床转化仍面临多重挑战。研究表明，PET成像的成本远高于IHC，而IHC仍然是评估PD-L1表达水平的金标准^[29]。因此，有必要开发

结论

CRediT作者贡献声明

何思远：方法学、正式分析。张楠：验证、方法学。朱俊毅：撰写——原始草稿、方法学、正式分析、数据管理。葛曼轩：方法学、正式分析。林建国：监督、资金获取。杨继辰：验证、正式分析。邱玲：监督、资金获取。吕高超：撰写——审阅与编辑、监督、资金获取、概念构思

[25]。

作者声明他们没有已知的可能会影响本文所报告工作的竞争性财务利益或个人关系。

数据可应要求提供。

? 作者声明他们没有已知的可能会影响本文所报告工作的竞争性财务利益或个人关系。

本工作得到了国家自然科学基金（U23A20478）、江苏省自然科学基金（BK20241757和BK20241758）、江苏省卫生健康委员会（M2024023）以及江苏省医学重点学科（ZDXYS202211）的支持。