对斑点蝎睾丸的单细胞转录组图谱分析显示，存在两个Sertoli细胞亚群，这两个亚群在dmrt1Y基因的表达上存在差异

《Aquaculture》：A single-cell transcriptomic atlas of the spotted scat testis reveals two Sertoli cell subclusters with differential dmrt1Y expression

　　余莉 | 蒋 Mou-Yan | 曹 Shan-Ni | 彭 You-Xing | 黄 Yuan-Qing | 史 Hong-Juan | 陈 Hua-Pu | 吴 Tian-Li | 江 Dong-Neng
广东省本土珍贵鱼类繁殖控制与育种技术研究中心，广东省水生动物疾病控制与健康养殖重点实验室，广东海洋大学渔业学院，湛江 524088，中国

**摘要**
在硬骨鱼类中，包括性别决定在内的生殖腺发育的潜在机制仍然复杂，并且正在积极研究中。斑点鲻鱼（Scatophagus argus）是一种具有商业价值的海洋鱼类。在这项研究中，我们对斑点鲻鱼成年雄性的睾丸进行了单细胞RNA测序（scRNA-seq），获得了398,377,233个原始读段。经过严格筛选后，保留了13,759个细胞进行分析，每个细胞平均有24,956个读段，每个细胞检测到4,499个基因。我们识别出八个转录上不同的细胞群体，包括五种参与精子发生的生殖细胞类型（精原干细胞、精原细胞、初级精母细胞、次级精母细胞和精子细胞）、两种体细胞类型（莱迪希细胞和塞托利细胞）、一个红细胞群体以及一个异质性群体。进一步进行亚群分析后，发现了两个转录上不同的塞托利细胞亚群。其中一个亚群高表达候选性别决定基因dmrt1Y，以及与雄性发育和激素信号传导相关的gsdf、amhr2和fshr基因；另一个亚群则与结构支持和细胞外基质组织有关。对塞托利细胞中上调基因的功能富集分析显示，TGF-β、ECM受体相互作用和MAPK信号通路显著富集，这反映了塞托利细胞转录组特征性的通路活性。亚群特定的富集模式与已知的生物学功能一致，包括精原细胞中的细胞周期调控、精子细胞中的鞭毛组装以及莱迪希细胞中的类固醇生成通路。本研究建立了斑点鲻鱼睾丸的首个scRNA-seq图谱，并揭示了与dmrt1Y富集相关的塞托利细胞的潜在功能异质性，为硬骨鱼类雄性生殖腺发育的研究提供了重要参考。

**引言**
斑点鲻鱼（Scatophagus argus）是一种原产于印度-太平洋地区的广盐性硬骨鱼类，在中国东南部是一种具有商业价值的水产养殖物种，因其生长迅速、适应性强以及兼具观赏和食用价值而受到重视（Gupta, 2016）。该物种在生长方面表现出明显的性别二态性，雌性生长速度明显快于雄性，在发育的最初1-2年内体型几乎达到雄性的两倍（Cai et al., 2010; Deng et al., 2014）。因此，通过性别控制育种来生产全雌性群体已成为提高斑点鲻鱼养殖效率的有效策略（Devlin and Nagahama, 2002）。自2018年以来，我们开发了斑点鲻鱼的性别特异性分子标记，揭示了其XX/XY性别决定系统（Mustapha et al., 2018）。随后的基因组和转录组测序发现有两个dmrt1基因拷贝：一个具有正常的编码序列（dmrt1Y/dmrt1），仅存在于Y染色体上的雄性中；另一个具有截短的编码序列（dmrt1ΔX/dmrt1b），存在于雄性和雌性中，这证实了dmrt1Y是候选的性别决定基因（Mustapha et al., 2018; Peng et al., 2023）。生产试验表明，虽然外源性雌激素如雌二醇可以成功诱导XY个体的雌性化，但17α-甲基睾酮和芳香化酶抑制剂来曲唑均无法有效使XX个体雄性化（Huang et al., 2025; Mustapha et al., 2021）。由于全雌性群体的生产通常依赖于将正常的XX雌性与性别反转的XX雄性（伪雄性）进行杂交，因此无法使XX个体雄性化成为实现斑点鲻鱼单性群体的主要瓶颈。这一限制可能是由于遗传雌性中缺乏功能性dmrt1或其他未知的调控机制所致。然而，dmrt1Y及其相互作用基因网络在斑点鲻鱼性别决定和生殖腺发育中的分子作用仍不清楚。

与其他脊椎动物一致，硬骨鱼类的精子发生依赖于动态的生殖细胞-体细胞相互作用，dmrt1作为睾丸发育和性别决定的保守调节因子（Nagahama et al., 2021; Uribe et al., 2014）。例如，在青鳉（Oryzias latipes）中，dmrt1突变会阻止精原细胞的自我更新并引发凋亡，导致发育缺陷和生殖细胞死亡（Masuyama et al., 2012）。同样，在中国鳎鱼（Cynoglossus semilaevis）中，dmrt1敲除会导致严重的睾丸发育不良，生殖腺整体外观类似雌性（Cui et al., 2017）。此外，作为参与生殖腺发育和性别决定的关键转录因子，dmrt1在生殖细胞和体细胞之间表现出显著的功能异质性（Zhong et al., 2022）。在体细胞中，dmrt1主要调节信号通路和基因表达，以维持生殖腺微环境并支持生殖细胞发育。例如，在尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus）中，dmrt1在塞托利细胞中高表达，通过上调amh和sox9促进睾丸分化和雄激素的产生，从而维持睾丸完整性（Li et al., 2013）。在生殖细胞中，dmrt1主要调控生殖细胞分化和减数分裂的启动（Dai et al., 2021; Matson et al., 2010）。在斑马鱼（Danio rerio）中，dmrt1在精原细胞中高表达，并通过调节dazl和vasa等基因促进早期生殖细胞分化（Lin et al., 2017）。尽管dmrt1的作用相对保守，但其表达模式在不同硬骨鱼类中存在差异。例如，在橙斑石斑鱼（Epinephelus coioides）中，dmrt1仅在生殖细胞中表达，在塞托利细胞中不存在（Xia et al., 2007）；而在XY型的尼罗罗非鱼中，dmrt1在睾丸的体细胞和生殖细胞中都表达（Qi et al., 2024）。在斑点鲻鱼中，dmrt1（dmrt1Y）及其调控网络的细胞表达情况尚不清楚，这引发了是否具有类似的双重定位模式或独特模式的关键问题，需要进一步研究来解决这些差异。

传统的转录组和表观基因组研究已经发现了斑点鲻鱼生殖腺中的性别偏向基因表达，包括dmrt1、foxl2和cyp19a1等基因，以及相关的DNA甲基化模式（Jiao et al., 2024; Mustapha et al., 2022）。然而，批量组织分析无法解析细胞类型的特异性表达谱。传统方法如原位杂交（ISH）可以定位基因表达，但仅限于少数基因，并且对低丰度转录本的敏感性较低，从而限制了全面的分析。单细胞RNA测序（scRNA-seq）通过提供单细胞分辨率的转录组谱型，能够识别不同的细胞类型及其谱系特异性的基因表达特征（Suzuki et al., 2019; Zhang et al., 2025a）。例如，在斑马鱼睾丸中的scRNA-seq分析识别出了多种睾丸细胞类型，揭示了精子发生过程中的细胞异质性和发育轨迹，并进一步表明精子发生能力随年龄增长而下降（Qian et al., 2022; Sposato et al., 2024）。在大型黄鲈鱼（Larimichthys crocea）中，跨发育阶段（幼体、成年分化及退化）的scRNA-seq构建了高分辨率的转录组图谱，明确了精原干细胞的分化轨迹，并揭示了季节性精子发生的分子机制（Yang et al., 2024）。同样，在成年橙斑石斑鱼睾丸中的scRNA-seq定义了10种具有特定标记基因（calr、eef1a、s100a1、vasa）的细胞类型，从而提供了关于睾丸细胞组成和性别反转机制的见解（Wu et al., 2021）。因此，将scRNA-seq应用于斑点鲻鱼睾丸是一种强大的方法，可以构建高分辨率的细胞图谱，并系统地描述dmrt1Y及其共表达基因在不同细胞类型中的表达谱型。

**实验方法和样本收集**
本研究使用了从中国湛江当地水产品批发市场捕获的一条健康的野生雄性斑点鲻鱼进行scRNA-seq分析。该鱼采集于冬季（2020年12月24日），属于非繁殖季节，体长约10厘米。根据我们之前发表的生长曲线数据（Mustapha et al., 2021），结合采样时间和斑点鲻鱼的繁殖季节性（通常发生在5月至8月），...

**scRNA-seq数据概述**
对成年斑点鲻鱼睾丸的单细胞转录组分析生成了睾丸腔室的全面细胞图谱（图1a）。睾丸的组织形态显示了不同发育阶段的多种生殖细胞类型，包括精原细胞、精母细胞和次级精母细胞（图1b）。睾丸被分类为III期，代表睾丸发育的中间阶段。

**结论**
本研究首次建立了斑点鲻鱼睾丸的scRNA-seq图谱，系统地揭示了其细胞组成和基因表达景观。识别出九个转录上不同的细胞群，其中八个被可靠地注释为定义的生殖细胞或体细胞类型，另一个代表一个异质性群体。使用阶段特异性标记（nanos2、dnd1、sycp3和spag6）表征了精子发生过程。亚群分析进一步揭示了两个...

**作者贡献声明**
余莉：撰写——审稿与编辑、撰写——初稿、研究、数据分析。
蒋 Mou-Yan：撰写——审稿与编辑、研究、数据分析。
曹 Shan-Ni：撰写——审稿与编辑、项目管理、方法学、数据分析。
彭 You-Xing：研究、数据分析。
黄 Yuan-Qing：研究。
史 Hong-Juan：项目管理、方法学。
陈 Hua-Pu：监督。
吴 Tian-Li：撰写——审稿与编辑、资源、方法学。

**资金来源**
本研究得到了中国国家自然科学基金[项目编号：32172971和32273131]、广东省基础与应用基础研究基金[项目编号：2024A1515010328]、广东省科技计划[项目编号：2023B0202010005]、广东省“TeZhi”计划青年科技创新人才项目[项目编号：2023TQ07A888]以及广东省水生动物疾病控制与健康养殖重点实验室研究基金的支持。

**利益冲突声明**
作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。

**致谢**
我们衷心感谢加拿大约克大学生物系的Peng Chun教授在数据解释和手稿修订方面的宝贵讨论和深刻见解。