将酶结合物共固定在层状多级大孔介孔二氧化硅上，以实现高效的级联反应

《Catalysis Science & Technology》：Co-immobilization of enzyme conjugates on monolithic hierarchical large-pore mesoporous silica for efficient cascade reactions

　　乔治亚·姆哈纳（Georgia Mhanna）| 穆斯林·德沃亚什金（Muslim Dvoyashkin）| 大卫·波皮茨（David Poppitz）| 罗杰·格莱瑟（Roger Gl?ser）
莱比锡大学化学技术研究所
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通过部分伪形转化制备了具有两种层次结构互连介孔系统的单体大孔介孔二氧化硅（LPMS）：一种是MCM-41介孔（2.4–5.5 nm），另一种是更大孔径的介孔（20–40 nm）。这种材料具有高比表面积（最高可达1121 m2/g）和孔体积（最高可达1.16 cm3/g）。通过调节结构导向剂C18TAOH与溴化物（CnTAOH/Br）的摩尔比，可以调整MCM-41介孔的相对比例，范围从0到1。两种介孔系统的互连性通过脉冲场梯度核磁共振（PFG NMR）扩散法得到了验证。葡萄糖氧化酶（GOx）和辣根过氧化物酶（HRP）被依次共固定在LPMS材料上。共固定的GOx（303–350 mg/g）和HRP（95–132 mg/g）在氧化葡萄糖为过氧化氢的过程中表现出高效的多酶协同作用，而过氧化氢进一步将2,2'-偶氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐（ABTS）氧化为其阳离子。当这些酶固定在粒径大于125 μm的LPMS单体上时，其活性可达游离酶的143 ± 8%。米氏动力学（Michaelis–Menten kinetics）结果支持酶在固定后仍保持高活性和高效协同作用，这表明酶位于单体的介孔内部。

**引言**
在每个生物体内，酶在控制复杂的化学反应网络中起着关键作用。几乎所有的代谢途径都是以级联反应的形式进行的。在自然界中，这些途径高效、具有选择性，并针对特定的底物和产物进行了优化。因此，多酶催化的反应在体外被广泛研究，以便将自然特性转移到生物技术应用中。特别是人工多酶系统在复杂化学转化中的应用受到了关注。当需要使用多种酶进行化学转化时，通常会采用连续转化的方式，即分别将不同酶固定在不同的载体上。然而，在一锅法中进行多酶转化更受欢迎，因为这样可以减少时间和成本，并降低产物回收的难度。一些多酶级联反应，例如利用醇脱氢酶（ADH）催化的级联反应进行对映体富集醇的合成或醇的消旋和立体反转，已经能够满足工业上对高时空产率和产品纯度的要求。

**酶的固定**
在固体载体上固定酶的方法主要有化学结合和物理吸附两种。对于不溶性且通常具有多孔性的载体，酶要么通过化学键合，要么通过物理吸附固定在其中；或者被包裹在微孔结构中。其中，孔径接近酶尺寸的纳米多孔材料受到了特别关注。例如，有序介孔二氧化硅（如MCM-41、MCM-48、SBA-15和MCF）已被用于固定各种大小的酶，从小分子（如细胞色素c30或溶菌酶）到大分子（如α-淀粉酶或细胞色素P450）。另一种有吸引力的载体是大孔介孔二氧化硅（LPMS）。其大的比表面积和孔体积以及可调的介孔尺寸使其适合容纳从小分子到大蛋白质的各种物质。此外，介孔二氧化硅的伪形转化可以引入不同孔径的二次孔系统。伪形转化能够制备出具有层次孔结构的单体材料，兼具新形成多孔材料（如MCM-41）和原始材料（如二氧化硅珠或沸石晶体）的特性。在转化过程中，碱性介质在结构导向剂（如烷基三甲基铵阳离子CnTA+）的作用下溶解原始LPMS中的二氧化硅。通过使用不同烷基链长度的CnTA+阳离子，可以获得不同孔径的转化产物；转化程度可以通过CnTAOH与CnTABr的摩尔比来控制。转化还会导致形成均匀分布在原始二氧化硅材料体积中的MCM-41区域。然而，这些孔系统之间的互连程度以及层次结构的可访问性仍不完全清楚。

**实验部分**
**大孔介孔二氧化硅（LPMS-x）的制备**
LPMS材料是通过Feng等人和Chen等人的方法结合溶胶-凝胶法制备的。以四甲基正硅酸盐（TMOS，Sigma Aldrich，98%）作为二氧化硅源，Pluronic? F127（Sigma Aldrich）作为结构导向剂（SDA），十二烷基磺基琥酸盐钠盐（AOT，Sigma Aldrich，≥97%）和正丁醇（VWR，≥99%）作为辅助SDA，以及1,3,5-三甲基苯（TMB，Sigma Aldrich，98%）作为膨胀剂。首先将Pluronic? F127和AOT溶解在3 mM的稀盐酸溶液中（318 K），然后加入TMB和正丁醇并搅拌至溶液澄清。接着加入TMOS，最终合成混合物的摩尔比为TMOS：F127：AOT：HCl：TMB：正丁醇 = 1.0：0.0050：0.037：0.00032：0.028：0.39。将混合物在318 K下保持24小时后，转移到聚四氟乙烯（PTFE）衬里的不锈钢高压釜中（体积V = 50 cm3），并在373 K下进行24小时的水热处理。固体产物通过倾析收集，然后在413 K下干燥和煅烧3小时，随后在573 K下煅烧3小时，最后在813 K下煅烧5小时（所有步骤的加热速率为1 K/min）。所得LPMS材料的粒径≥500 μm。通过研磨和机械筛分得到不同粒径的样品，分别表示为LPMS-x（其中x表示最大粒径，单位为μm）。

**层次结构大孔介孔二氧化硅（LPMS-x-yT）的制备**
首先进行了一系列伪形转化，将LPMS完全转化为MCM-41型材料。为此，将1克LPMS-50材料在373 K下干燥后，浸入42毫升的CnTAOH溶液中，在393 K下进行72小时的水热处理。转化溶液中SiO2：CnTAOH：H2O的摩尔比为1：0.2：140。转化产物过滤后，用去离子水洗涤至中性pH值，然后在473 K、673 K和813 K下分别煅烧3小时。根据所用CnTAOH中的烷基链长度对产物进行标记。

**表征**
使用Micromeritics?公司的ASAP 2010仪器在77 K下通过氮吸附等温线测定材料的纹理性质。总比孔体积取自P/P0?1 = 0.995的点。通过修改后的t-plot方法（适用于介孔和层次结构二氧化硅的t层区域，范围0.6至1.3）确定了两种孔系统的比表面积和比孔体积。完全转化材料的孔径分布（PWD）是通过氮吸附等温线的脱附分支得到的，该方法基于77 K下的氮-二氧化硅平衡转变核和圆柱形孔模型，采用非局部密度泛函理论（NLDFT）计算。比BET表面积是通过线性化的Brunauer–Emmett–Teller方程在相对压力P/P0?1 = 0.05至0.20的范围内获得的。对于部分转化的材料，通过将MCM-41型介孔的体积除以总孔体积（在P/P0?1 = 0.995时）来计算转化程度。扫描电子显微镜（SEM）图像使用Zeiss公司的Leo Gemini 1530显微镜在10 kV下获得。样品在测量前先镀金。样品的相分析通过粉末X射线衍射（XRD，Philips X'pert Pro）进行，使用Cu Kα射线（40 kV）在2θ = 0.5–7.0°的角度范围内进行测量，步长为0.05°。透射电子显微镜（TEM）使用Jeol公司的JEM-2100Plus设备，在200 kV的加速电压下进行。

**脉冲场梯度核磁共振（PFG NMR）研究**
脉冲场梯度核磁共振（PFG NMR）使用自制的谱仪进行，该谱仪工作频率为125 MHz，并配备了脉冲磁场梯度装置。扩散实验采用刺激自旋回波脉冲序列。在这种技术中，可以监测分子在施加磁场梯度方向上的运动过程（观察时间t = 10 ms）。其他实验参数包括：前两个90°射频脉冲之间的间隔τ = 1.2 ms；梯度脉冲的持续时间为δ = 0.8 ms。作为扩散剂，使用n-己烷（Sigma-Aldrich，99%），并通过冷冻/解冻法脱气。样品首先在473 K下干燥至少6小时，然后在298 K下与n-己烷蒸汽接触过夜，压力对应于P/P0?1 = 0.9，以确保介孔被气体填充，所有样品的n-己烷吸附量约为1。此后，探针被密封。酶的固定：GOx（来自黑曲霉，浓度为161.8 U mg?1，分子量为160 kDa，从Sigma Aldrich购买，纯度>90%）和HRP（浓度为950–2000 U mg?1，分子量为44 kDa，从Sigma Aldrich购买，纯度>99%）依次共固定在大孔介孔二氧化硅LPMS-x和部分转化的材料LPMS-x-yT上。在323 K下真空（<10 mbar）中活化过夜后，将50 mg的支撑材料与5.00 ml磷酸盐缓冲溶液（0.1 M，pH = 4.5，Na2HPO4/NaH2PO4，均来自Carl Roth，纯度≥98%）和5.00 mL GOx溶液（浓度为5 mg/mL）在室温下通过涡旋搅拌混合。在室温下轻轻搅拌48小时后，含有GOx的固体通过离心（4000 rpm，10分钟）分离，并用磷酸盐缓冲液多次洗涤，直到上清液中检测不到游离酶（使用UV/vis光谱仪Avantes AvaSpec-3648，GOx在270 nm处，HRP在403 nm处）。最后，材料在室温下真空（<10 mbar）中干燥至少6小时，然后立即使用或储存在277 K。通过从总上清液洗涤溶液中减去GOx的量来确定固定的GOx量。

接下来，探针被密封。GOx（来自黑曲霉，浓度为161.8 U mg?1，分子量为160 kDa，从Sigma Aldrich购买，纯度>90%）和HRP（浓度为950–2000 U mg?1，分子量为44 kDa，从Sigma Aldrich购买，纯度>99%）依次共固定在大孔介孔二氧化硅LPMS-x和部分转化的材料LPMS-x-yT上。在323 K下真空（<10 mbar）中活化过夜后，将50 mg的支撑材料与5.00 ml磷酸盐缓冲溶液（0.1 M，pH = 4.5，Na2HPO4/NaH2PO4，均来自Carl Roth，纯度≥98%）和5.00 mL GOx溶液（浓度为5 mg/mL）在室温下通过涡旋搅拌混合。在室温下轻轻搅拌48小时后，含有GOx的固体通过离心（4000 rpm，10分钟）分离，并用磷酸盐缓冲液多次洗涤，直到上清液中检测不到游离酶（使用UV/vis光谱仪Avantes AvaSpec-3648，GOx在270 nm处，HRP在403 nm处）。最后，材料在室温下真空（<10 mbar）中干燥至少6小时，然后立即使用或储存在277 K。通过从总上清液洗涤溶液中减去GOx的量来确定固定的GOx量。

对于选定的支撑材料，仅固定了GOx。在这种情况下，遵循上述相同的程序，但省略了添加HRP的步骤。为了比较，使用了介孔泡沫（MCF）（制备和表征见补充信息S3）和硅胶62（Sigma Aldrich，Davisil Grade 62）作为酶固定的支撑材料。

为了研究酶的催化活性，应用了一种需要GOx和HRP在水溶液中级联反应的活性测定方法（图1）。在这种测定中，葡萄糖和氧气被转化为过氧化氢，过氧化氢与2,2′-偶氮-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐（ABTS）反应生成其阳离子ABTS+，其浓度可以通过UV/vis光谱法（在415 nm处吸收）定量测定。在含有（游离）GOx和HRP的均匀溶液或仅含有GOx的溶液中，将1.00 mL 45 mM葡萄糖溶液和180.0 μL 0.4 mM ABTS溶液通过磁力搅拌混合在一个玻璃瓶（V = 10 cm3）中，然后加入200.0 μL GOx溶液（浓度为0.6 mg/mL）或200.0 μL含有0.6 mg/mL GOx的悬浮液，以及1.80 mL磷酸盐缓冲溶液（0.1 M，pH = 7.0，Na2HPO4/NaH2PO4）。接着加入200.0 μL HRP溶液（浓度为0.2 mg/mL）。所有情况下HRP:GOx的质量比为1:3，摩尔比为1:1。对于共固定的GOx和HRP，根据测定的固定GOx和HRP的量，选择干燥后的生物催化剂颗粒的质量，以保持与游离酶相同的酶量。含有两种固定酶的干燥生物催化剂颗粒直接加入到与游离酶相同的葡萄糖和ABTS溶液中，同时加入2.20 mL磷酸盐缓冲溶液。

所得到的生物催化剂在GOx固定后同样进行干燥，然后立即使用或储存在277 K。对于选定的支撑材料，仅固定了GOx。在这种情况下，遵循上述相同的程序，但省略了添加HRP的步骤。为了比较，使用了介孔泡沫（MCF）（制备和表征见补充信息S3）和硅胶62（Sigma Aldrich，Davisil Grade 62）作为酶固定的支撑材料。

为了研究酶的催化活性，应用了一种需要GOx和HRP在水溶液中级联反应的活性测定方法（图1）。在这种测定中，葡萄糖和氧气被转化为过氧化氢，过氧化氢与2,2′-偶氮-双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐（ABTS）反应生成其阳离子ABTS+，其浓度可以通过UV/vis光谱法（在415 nm处吸收）定量测定。在含有（游离）GOx和HRP的均匀溶液或仅含有GOx的溶液中，将1.00 mL 45 mM葡萄糖溶液和180.0 μL 0.4 mM ABTS溶液通过磁力搅拌混合在一个玻璃瓶（V = 10 cm3）中，然后加入200.0 μL GOx溶液（浓度为0.6 mg/mL）或200.0 μL含有0.6 mg/mL GOx的悬浮液，以及1.80 mL磷酸盐缓冲溶液（0.1 M，pH = 7.0，Na2HPO4/NaH2PO4）。接着加入200.0 μL HRP溶液（浓度为0.2 mg/mL）。所有情况下HRP:GOx的质量比为1:3，摩尔比为1:1。对于共固定的GOx和HRP，根据测定的固定GOx和HRP的量，选择干燥后的生物催化剂颗粒的质量，以保持与游离酶相同的酶量。含有两种固定酶的干燥生物催化剂颗粒直接加入到与游离酶相同的葡萄糖和ABTS溶液中，同时加入2.20 mL磷酸盐缓冲溶液。

所得到的反应混合物在室温下搅拌5分钟。通过UV/vis光谱法（Avantes AvaSpec-3648）监测415 nm处ABTS+的吸收来跟踪反应进程。催化活性通过0到10分钟内ABTS+浓度的变化来计算平均反应速率，t = 0表示加入HRP溶液的时刻。相对活性RA通过将固定酶的平均反应速率与相同反应条件下游离酶的平均反应速率之比来计算。通过将固定酶和游离酶的平均反应速率归一化到反应介质中的酶浓度来获得归一化活性NA（公式（1）。

通过用10 mL磷酸盐缓冲液洗涤三次固定酶并重复两次活性测定，研究了选定的固定生物催化剂的重复使用性。此外，通过在278 K下不同的孵育时间（24、48、72、100、120、140或160小时）以及在不同温度（278、288、298、308、318、333或343 K）下孵育4小时后进行活性测定，研究了游离酶和固定酶的热稳定性。

为了确定游离和固定GOx及HRP的Michaelis–Menten常数，进行了与上述相同的活性测定，但批次增加了5倍。将5.0 mL葡萄糖溶液（浓度为0、5、15、25、45、90或120 mM）和0.9 mL ABTS溶液（浓度为0.4 mM）与1.0 mL游离GOx（浓度为0.6 mg/mL）或1.0 mL含有0.6 mg/mL固定GOx的悬浮液混合，然后加入9.0 mL磷酸盐缓冲溶液（pH = 7）和1.0 mL HRP溶液（浓度为0.2 mg/mL），标记为反应开始时刻，即t = 0。底物浓度cS根据图1中的化学计量关系从ABTS+的浓度得出。初始反应速率r0根据t = 0时cS对时间的依赖性斜率计算得出，假设HRP催化步骤是非限制性的，并且级联反应在ABTS+的形成严格依赖于GOx的转化速率。随后，生成Lineweaver–Burk图，即r0?1与cS?1的双倒数图，从中提取出表观速率rmax和表观Michaelis–Menten常数KM（见补充信息S5）。此外，还估计了催化反应速率常数kcat（公式（2）和催化效率kcatKM?1，其中cE表示反应混合物中的酶浓度。

为了确定游离和固定GOx及HRP的Michaelis–Menten常数，使用与上述相同的批次大小在288至328 K的温度范围内进行了活性测定，以研究温度升高对酶活性的影响。

作为层状材料的起始材料，制备了大孔介孔二氧化硅（LPMS）。所得材料的氮吸附等温线和孔径分布如图2所示。LPMS具有高比孔体积（1.76 cm3 g?1）、高比表面积（324 m2 g?1）和最大孔径Dp = 35 nm的孔径分布。

最重要的是，LPMS材料以≥500 μm的单一颗粒形式获得。这使其成为连续过程的理想支撑材料，而许多其他介孔材料通常以粉末形式获得。

通过后合成伪形转化将MCM-41型材料的有序介孔引入LPMS中。在第一系列转化中，作为结构导向剂的表面活性剂CnTAOH的烷基链长度n在10到22个碳原子之间变化，同时将LPMS完全转化为MCM-41型材料。通过C18TAOH转化后的LPMS的XRD图谱（C18，图3）确认了MCM-41有序介孔系统的形成。主要反射峰位于2θ = 2.1°，对应于与100平面相关的MCM-41孔。随着结构导向剂中烷基链长度从10个碳原子增加到22个碳原子，转化产物的比孔体积和孔径分别从0.42–1.16 cm3 g?1和2.4–5.5 nm增加（图4和表1）。氮吸附等温线（图4，顶部）也证实了比表面积从558–1121 m2 g?1增加。唯一的例外是样品C22，其比表面积较低且孔径分布较宽，可能是由于未完全转化为MCM-41（见补充信息S2和样品C22的氮吸附等温线图S2）。

进行了第二系列伪形转化，以获得具有层状双峰孔系统的的大孔介孔二氧化硅。在这些转化中，使用不同比例的C18TABr和C18TAOH来控制转化程度。LPMS的部分转化过程在图5中以示意图形式展示。

通过小角XRD图谱可以看出介孔系统的转化。除了LPMS-50母材料由于检测限无法检测到峰外，随着C18TAOH溶液体积分数的增加，出现了衍射峰（图7）。这些峰向更高的衍射角移动，表明形成了更小的介孔。

为了分别确定MCM-41孔和LPMS孔的比孔体积，考虑了从氮吸附等温线通过t-plot方法得到的材料的累积孔体积。如图8（底部）所示，累积孔体积的第一次减少归因于MCM-41孔，其孔径宽度在0到5纳米之间；第二次减少则归因于LPMS孔，其孔径宽度在20到40纳米之间。采用相同的程序分别确定了MCM-41和LPMS孔的比表面积（图8，顶部）。表2总结了所有具有双峰孔系统的LPMS-50-yT材料的数值，包括MCM-41在总孔体积中的计算体积分数。

显然，随着C18TAOH溶液体积分数的增加，MCM-41孔的比例XMCM-41也在增加。然而，这并不直接与转化混合物中C18TAOH溶液的体积分数相关。例如，在由50体积% C18TAOH溶液制成的LPMS-50-50T中，只有0.25的总比孔体积是由MCM-41孔贡献的。

SEM图像显示，经过假象转化后，颗粒的大小和几何形状没有发生变化。高分辨率的SEM图像显示的颗粒表面与氮吸附和小角XRD的结果相反：虽然LPMS-50材料的孔径宽度非常小，接近分辨率极限，但在C18TAOH体积分数达到75%时，孔径宽度似乎有所增加。令人惊讶的是，LPMS-50-100T的表面非常光滑，只能观察到小孔。

为了评估层次化LPMS材料用于固定多酶结合物的适用性，使用了葡萄糖氧化酶（GOx）和辣根过氧化物酶（HRP）作为模型酶。首先，确定了不同起始酶浓度下每种酶在LPMS材料上的负载量（见补充信息S4和图S4–S6）。基于这些结果，选择了GOx和HRP的负载量进行顺序吸附以实现共固定。这一概念在图11中以图形方式进行了说明。由于GOx的尺寸为5.5 × 7.0 × 8.0纳米，假设它可以适应LPMS的大孔，但不能适应小孔MCM-41的孔。然而，MCM-41的孔可以容纳HRP（尺寸为4.0 × 4.4 × 6.8纳米）。

作为初步测试，研究了酶负载对固定前后比孔体积的影响，以确定GOx是否能适应LPMS的大孔，HRP是否能适应MCM-41的小孔。因此，GOx被固定在原始LPMS-50上，而HRP被固定在完全转化后的材料LPMS-50-100T上，其最大颗粒尺寸为50微米。加载酶后，LPMS-50 + GOx的比孔体积从1.54 cm3 g?1降低到1.31 cm3 g?1，LPMS-50-100T + HRP的比孔体积从1.06 cm3 g?1降低到0.84 cm3 g?1。这表明酶占据了孔空间，而不是位于材料的外表面。然而，不能排除部分孔堵塞的可能性。

首先进行了GOx的吸附，然后进行HRP的吸附。假设在用GOx酶填充大孔后，小孔（以及大孔中未被GOx占据的空间）可以加载HRP酶。为了避免在HRP吸附过程中GOx的渗出，在HRP固定期间使用了较高pH值的缓冲溶液。然而，已经吸附的GOx酶仍会发生轻微渗出，这可以通过UV/vis光谱监测，并根据渗出损失重新计算GOx的最终负载量。根据文献所述，所选模型反应的最大整体活性需要HRP:GOx的质量比为1:3。因此，相应地调整了负载比例。表3总结了在各种材料上通过顺序共固定获得的HRP和GOx的负载量。结果显示，达到了目标酶负载比例，且GOx和HRP的总体负载量处于可比较的范围内，除了完全转化后的材料LPMS-50-100T + GOx/HRP，其两种酶的负载量明显较低。这可能是由于LPMS-100T材料中只有小孔，进入内部孔的难度较大，因此孔堵塞的可能性更高。

通过PFG NMR研究了双峰孔系统的层次结构及酶的负载情况。使用PFG NMR扩散测量进一步了解了部分转化的大孔介孔硅中两种介孔系统的连通性以及共固定酶GOx和HRP的位置。图12显示了使用正己烷作为扩散剂的PFG NMR光谱测得的回波衰减曲线。曲线显示出明显的非指数衰减，表明存在多个扩散系数，这可能是由于正己烷的扩散机制不同所致。根据样品制备程序，正己烷分子可能不仅在材料的孔内扩散，还部分通过颗粒间的气相扩散。在这种情况下，称为长程扩散，所得到的扩散率可能甚至高于 bulk 液态正己烷的扩散率。因此，仅分析了高梯度范围内的最慢衰减。相应的拟合结果用图12中的实线表示。表4总结了这些拟合的结果，使用爱因斯坦方程（方程（3）计算了每个测得的颗粒内扩散率的均方根位移（RMSD）。

根据研究材料的纹理数据，随着转化程度的提高，较小孔（即MCM-41型孔）的比例增加。一致地观察到，正己烷的自扩散系数单调递减。如果转化在探测的RMSD长度尺度（约5–10微米）上均匀发生，并且较大孔和较小孔的界面没有显著的扩散障碍，那么在较小孔和较大孔之间快速扩散交换的条件下，可以预测中间转化程度的扩散率。然后使用方程（4）计算了每种部分转化为MCM-41的LPMS材料的预期扩散系数Dexpected：其中VLPMS、VMCM-41和Vtotal分别对应于从氮吸附数据中提取的LPMS和MCM-41的比孔体积以及总孔体积。假设正己烷在较大孔和较小孔中的密度相等，具有DLPMS和DMCM-41扩散率的分子比例可以表示为VLPMS/Vtotal和VMCM-41/Vtotal。由于文献中没有关于LPMS材料的先前PFG NMR数据，因此DLPMS取为纯LPMS的实验扩散率值（1.40 × 10?? m2 s?1），而DMCM-41对应于当MCM-41体积分数为一时通过外推得到的扩散率估计值（3.75 × 10?1? m2 s?1）。表4总结了本报告中使用的不同LPMS材料的Dexpected计算值。

关于同时负载了GOx和HRP的LPMS材料，图12（底部）中的自旋回波衰减曲线类似，Dexpected+GOx/HRP是从这些曲线的较慢成分中提取的，并在表4中呈现。图13显示了根据XMCM-41（从氮吸附数据（表2）计算出的MCM-41体积分数变化的扩散系数变化。Dexpected也作为实验值的参考值绘制在图中。如图13所示，未加载酶的材料的扩散率实验值与Dexpected相当，除了LPMS-75T材料，其正己烷的扩散率较低。这表明这种高转化程度的两种介孔系统的连通性更高。对于加载了酶的材料，颗粒内扩散系数的降低表明酶占据了孔空间，而不是位于材料的外表面。此外，比较加载酶和未加载酶的材料时，扩散率的减少（30–40%）表明酶没有堵塞孔。

关于同时负载了GOx和HRP的LPMS材料，图12（底部）中的自旋回波衰减曲线类似，Dexpected+GOx/HRP是从这些曲线的较慢成分中提取的，并在表4中呈现。图13展示了根据XMCM-41（从氮吸附数据（表2）计算出的MCM-41体积分数变化的扩散系数变化。Dexpected也作为实验值的参考值绘制在图中。如图13所示，未加载酶的材料的扩散率实验值与Dexpected相当，除了LPMS-75T材料，其正己烷的扩散率较低。这表明这种高转化程度的两种介孔系统的连通性更高。对于加载了酶的材料，颗粒内扩散系数的降低表明酶占据了孔空间，而不是位于材料的外表面。此外，比较加载酶和未加载酶的材料时，扩散率的减少（30–40%）表明酶没有堵塞孔。“Expected”表示根据方程（4）计算出的扩散系数的值。根据PFG NMR的研究结果，在约5–10 μm的长度尺度上观察到了较大和较小介孔之间的快速交换，这表明通过假晶转变获得的所有LPMS-yT材料中的两种介孔具有层次结构和相互关联性。图14总结了固定在层次化LPMS-50-yT材料上的酶的归一化总活性，以及作为对比的介孔泡沫（MCF）和硅胶上的酶的活性。共固定的GOx和HRP的活性比溶液中的游离酶低28–33%，以溶液中的游离酶活性为100%作为基准。有趣的是，LPMS载体的不同转化程度（即LPMS-50-50T或LPMS-50-75T）对活性几乎没有影响。然而，固定在层次化、整体LPMS材料上的酶的活性显著高于固定在介孔泡沫或硅胶上的酶（见图14）。这可能与两种酶在层次化LPMS材料的孔中更有效的相互作用有关。另外需要注意的是，所有实验都进行了阴性对照，即在不含固定酶的载体存在下进行，记录的归一化活性为0%。两种介孔系统的均匀分布和相互连通性通过高分辨率透射电子显微镜（HR-TEM）和脉冲场核磁共振（PFG NMR）得到了验证。这些材料成功用于共固定两种不同大小的酶——GOx和HRP，实现了针对这两种不同尺寸介孔系统的空间排列。当这些共固定的酶被支撑在粒径大于125微米的层次化LPMS整体材料上时，其活性比溶液中的自由酶更高。目前仍需改进酶的稳定性，特别是在通过温和洗涤、交联或对硅材料进行表面功能化处理后重复使用时的稳定性问题。显然，通过调整介孔系统的宽度（分布）和相对比例，这种方法可以扩展到支持其他酶结合物。基于多酶结合体的整体式生物催化剂具有吸引力，是未来连续流处理技术中用于先进和可持续生物技术转化的理想候选材料。引入更复杂的孔结构以固定两种以上类型的协同作用的酶，最终可能会为合理设计人工细胞铺平道路。

作者贡献：
Georgia Mhanna：概念构思、方法设计、实验研究、数据整理、初稿撰写。
Muslim Dvoyashkin：实验研究、数据整理。
David Poppitz：实验研究、数据整理、审稿与编辑。
Roger Gl?ser：资金筹集、资源提供、研究指导、审稿与编辑。

利益冲突：
无需要声明的利益冲突。

数据可用性：
支持性数据已作为补充信息（SI）提供，包括11页内容、6个部分、15张图表、3个表格和2篇参考文献。其中涵盖了烷基三甲基铵氢氧化物溶液的制备、部分改性的大孔介孔硅材料（LPMS-x-yT）的特性分析、介孔泡沫的制备、酶的固定方法以及固定后酶的活性和稳定性等方面的信息。补充信息可访问：https://doi.org/10.1039/d5cy01546d